上海地区Ⅱ、Ⅲ型丙型肝炎病毒包膜区cDNA序列分析
作者：邱纪慧 张欣欣 陆志檬 金根娣 汪垣
单位：邱纪慧 张欣欣 陆志檬 金根娣(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院临床病毒研究室)；汪垣(中国科学院上海生物化学研究所)
关键词：肝炎病毒,丙型；包膜区；核苷酸序列
中华传染病杂志000207 【摘要】 目的 分析上海地区丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)Ⅱ、Ⅲ型包膜区cDNA序列变异。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV包膜区E1、E2/NS1片断(1 005bp)，在373DNA全自动测序仪上进行了序列分析。结果 HCV-E1、E2/NS1区核苷酸和氨基酸同源性比较显示：上海株Ⅱ型、Ⅲ型间同源性分别为62.48%和59.10%；上海株与国内外同型株间分别为85.97%～87.36%和83.38%～86.57%；上海株与国内外不同型株间分别为61.49%～70.95%和59.10%～78.21%。此外，共发现5个变异较大的区域，其中两个是国际公认的高变区(HVR1及HVR2)，另外3个为首次报道(第251～258、297～301、461～467位氨基酸)。结论 HCV-E1、E2/NS1序列变异大，这对其疫苗设计有参考价值。
, 百拇医药
Sequence analysis of E1,E2/NS1 region of genotype Ⅱ and Ⅲ hepatitis C virus isolated from Shanghai patients
QIU Jihui, ZHANG Xinxin, LU Zhimeng, et al.
(Research Unit of Clinical Virology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
【Abstract】 Objective To analyse the variation of envelope gene of genotype Ⅱ and Ⅲ hepatitis C virus (HCV) isolated from Shanghai patients with chronic hepatitis C. Methods The envelope genes (E1, E2/NS1) were amplified by nested reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Totally 1 005 bp were sequenced and compared with previously reported isolates. Results The nucleotide (nt) and amino acid (aa) homologies between genotype Ⅱ and Ⅲ Shanghai isolates were 62.48% and 59.10%, respectively. The nt and aa homologies between Shanghai isolates and isolates with the same genotype from different regions were 85.97%～87.36% and 83.38%～86.57%, whereas the homologies between isolates with different genotypes, were 61.49%～70.95% and 59.10%～78.21%. Five hypervariable regions (aa 251～258, 297～301, 384～408, 461～467, 475～480) were found and two of them were consistent with the two hepervariable regions reported previously (aa 384～408, 474～482). Conclusion The variation of envelope gene was great and the knowledge of how variability distributed along different regions of the HCV genome could be helpful in the design of HCV vaccine.
, http://www.100md.com
【Key words】Hepatitis C virus; Envelope gene; Nucleotide sequence
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后及散发性非甲非乙型肝炎的主要病原。HCV为长约9.4 kb的单股正链RNA病毒，其中E1、E2区是HCV基因组中变异最大的部位，其编码的包膜糖蛋白可能刺激机体产生保护性抗体[1，2]。E2包膜区内的高变区(HVR1)是产生中和抗体的关键部位，但对免疫逃避株无中和作用[3]。包膜区的高度变异导致病毒准种及免疫逃避株的产生，给疫苗的研制带来困难。
我们对上海地区Ⅱ、Ⅲ型HCV E1、E2/NS1区进行了序列测定，并与国内外分离株作比较，分析其同源性及变异特点。
材料与方法
一、血清标本
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2份血清标本来自上海第二医科大学瑞金医院传染病科住院患者，有输血史，丙氨酸转氨酶(ALT)异常，经Abbott试剂检测抗-HCV(+)，上海华美试剂检测HCV RNA(+)。采用Okamoto基因分型法[4]，1份血清为Ⅱ/1b型，另1份血清为Ⅲ/2a型。
二、HCV-E1、E2/NS1片段扩增
用异硫氰酸胍裂解，酚、氯仿提取HCV RNA，逆转录后，经套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增得所需片段。PCR及测序引物参考HCV-J[5]、HCV-BK[6]、HCV-HB[7]及HC-J6[8]株序列，选择相对保守的区域设计，由上海市血液学研究所合成。
PCR及测序引物序列及位置如下： E1区Ⅱ型引物
, 百拇医药 外引物 S1 5′-CTCATGGGGTACATTCCGCT-3′ 397～416
A1 5′-GCG(A)AAGAGTAGCATCACAATC-3′ 1116～1136
内引物 S2 5′-CGGAATTCATGGCACATGGTGTCCGGGTT-3′ 452～471
A2 5′-CGGAATTCATCACAATCAAA(G)ACCTTAGCC-3′ 1104～1125
E1区Ⅲ型引物
外引物 QS1 5′-CCGACCTCATGGGGTACAT-3′ 392～410
QA1 5′-CAAAGAGTCATTGCAGTTCAG-3′ 1279～1299
, http://www.100md.com
内引物 QS2 5′-CGGGATCCATGGGGAACTTACCCGGTTGCTC-3′ 499～518
QA2 5′-CGGAATTCCGGTGCGGTTGATGTGCCA-3′ 1258～1276
E2区Ⅱ、Ⅲ型通用引物
外引物 S3n 5′-GGTCACCGCATGG(CG)TTGGGA-3′ 943～962
A3n 5′-CACGTCTTGGTGA(AG)CC(CG)AGTG-3′ 1671～1691
内引物 S4n 5′-CGGGATCCTGGGATATGATGATGAACTGGTC-3′ 958～980
A4n 5′-CGGAATTCCAGCACGTCTGTCTCATTCTCC-3 1590～1611
, 百拇医药
* 划线部分为酶切位点
三、PCR产物直接序列分析
采用DNA测序试剂盒，根据双脱氧链末端终止法原理，在373A DNA全自动测序仪上测定，测序引物采用PCR扩增时的内引物，同一片段正反两方向测定。
结果
一、PCR扩增产物电泳结果
Ⅱ型HCV株经外引物S1、A1及内引物S2、A2扩增，Ⅲ型HCV株经外引物QS1、QA1及内引物QS2、QA2扩增，得到片段包含全部E1及部分C区片段，Ⅱ型长度为674 bp，Ⅲ型长度为778 bp。Ⅱ型、Ⅲ型HCV经外引物S3n、A3n及内引物S4n、A4n扩增得到长度为654 bp的部分E2区片段。
二、核苷酸序列分析结果
, 百拇医药
测定了上海株Ⅱ型HCV-SH2、Ⅲ型HCV-SH3的E1区及部分E2区(包括两个高变区)共1 005 bp的核苷酸序列，并与国内外其它分离株进行了比较，其同源性结果列于表1。
表1 上海株Ⅱ、Ⅲ型与其它分离株E1、E2/NS1相应部位核苷酸同源性比较(%)
HCV-SH3
HCV-HB
HCV-J
HCV-BK
HC-J6
HCV-1
HCV-SH2
62.48
, 百拇医药
87.36
87.16
85.97
61.49
70.95
HCV-SH3
—
63.38
62.90
64.16
86.45
63.98
表2 上海株Ⅱ、Ⅲ型与其它分离株E1、E2/NS1相应部位推导的氨基酸同源性比较(%)
, http://www.100md.com
HCV-SH3
HCV-HB
HCV-J
HCV-BK
HC-J6
HCV-1
HCV-SH2
59.10
85.07
86.57
83.58
59.11
78.21
, http://www.100md.com
HCV-SH3
—
60.00
59.10
60.00
83.38
66.56
三、推导的氨基酸序列及其与其它分离株的比较
由测得的上海株Ⅱ型HCV-SH2、Ⅲ型HCV-SH3的E1及E2/NS1部分核苷酸顺序推导其相对应的氨基酸序列，并与其它分离株相应部位进行了比较，其同源性结果列于表2。讨论
HCV基因组具有很大的变异性，根据不同的分型方法，可将HCV分为不同的基因型。Okamoto分型方法根据HCV核心区核苷酸序列的差异，通过逆转录-聚合酶链反应分析扩增产物的长度，将HCV分为Ⅰ～Ⅳ基因型。我们通过此分型方法选择到上海地区Ⅱ型和Ⅲ型HCV各1株，对E1、E2/NS1区的序列进行了测定，并进一步与其它已知序列作了比较。
, 百拇医药
不同国家、不同地区的HCV基因组间存在很大的差异，其中编码包膜蛋白的E1、E2/NS1区在HCV基因组中变异程度最大。该区不断发生变异，可能与丙型肝炎容易发生慢性化、干扰素耐受及导致肝癌等有一定的关系。HCV-E1、E2/NS1区核苷酸和氨基酸同源性比较显示：上海株Ⅱ型、Ⅲ型间分别为62.48%和59.10%；上海株与国内外同型株间分别为85.97%～87.36%和83.38%～86.57%；上海株与国内外不同型株间分别为61.49%～70.95%和59.10%～78.21%。此外，与其它株比较发现，上海株较大变异区包括第251～258、297～301、384～408、461～467、475～480位氨基酸，其中两个与公认的高变区HVR1(第384～408aa)和HVR2(第474～482aa)位置一致[10]。有研究认为位于包膜蛋白E2(gp70)内的HVR1，可能含有B细胞中和表位，但仅对同源病毒株有特异性[3]。该区的高度变异给研制普遍适用的疫苗造成很大困难。
尽管E1、E2/NS1区变异很大，但我们仍可以观察到一些氨基酸保守区，如224～229、276～283、316～329、350～355、415～421、483～489、502～521位氨基酸，这些区域含有较多的半胱氨酸及脯氨酸，半胱氨酸与形成链间及链内二硫键有关，脯氨酸与多肽转角的形成有关，因此推测这些氨基酸保守部位在维持外膜蛋白的空间结构及功能方面起重要作用，至于这些部位是否具有抗原表位，有待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Choo QL, Kuo G, Ralston R, et al. Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:1294-1298.
2，Farci P, Alter HJ, Wong DC, et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibody mediated in vitro neutralization. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:7792-7796.
3，Farci P, Shimoda A, Wong D, et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 of envelope 2 protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:15394-15399.
, 百拇医药
4，Okamoto H, Sugiyama Y, Okada S, et al. Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers. Application to clinical surveys and tracing infectious sources. J Gen Virol, 1992, 73:673-679.
5，Kato N, Hijikata M, Ootsuyama Y, et al. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:9524-9528.
6，Takamizawa A, Mori C, Fuke I, et al. Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J Virol, 1991, 65:1105-1113.
, 百拇医药
7，毕胜利，白宪鹤，丛勉尔，等.中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异.病毒学报，1993，9：104-127.
8，Okamoto H, Okada S, Sugiyama Y, et al. Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparison with reported isolates for conserved and divergent regions. J Gen Virol, 1991, 72:2697-2704.
9，Choo QL, Richman KH, Han JH, et al. Genetic organization and diverisity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:2451-2455.
10，Okada S, Akahane Y, Suzuki H, et al. The degree of variability in the amino terminal region of the E2/NS1 protein of hepatitis C virus correlates with responsiveness to interferon therapy in viremic patients. Hepatology, 1992, 16:619-624.
收稿日期：1999-12-21, http://www.100md.com
单位：邱纪慧 张欣欣 陆志檬 金根娣(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院临床病毒研究室)；汪垣(中国科学院上海生物化学研究所)
关键词：肝炎病毒,丙型；包膜区；核苷酸序列
中华传染病杂志000207 【摘要】 目的 分析上海地区丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)Ⅱ、Ⅲ型包膜区cDNA序列变异。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV包膜区E1、E2/NS1片断(1 005bp)，在373DNA全自动测序仪上进行了序列分析。结果 HCV-E1、E2/NS1区核苷酸和氨基酸同源性比较显示：上海株Ⅱ型、Ⅲ型间同源性分别为62.48%和59.10%；上海株与国内外同型株间分别为85.97%～87.36%和83.38%～86.57%；上海株与国内外不同型株间分别为61.49%～70.95%和59.10%～78.21%。此外，共发现5个变异较大的区域，其中两个是国际公认的高变区(HVR1及HVR2)，另外3个为首次报道(第251～258、297～301、461～467位氨基酸)。结论 HCV-E1、E2/NS1序列变异大，这对其疫苗设计有参考价值。
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Sequence analysis of E1,E2/NS1 region of genotype Ⅱ and Ⅲ hepatitis C virus isolated from Shanghai patients
QIU Jihui, ZHANG Xinxin, LU Zhimeng, et al.
(Research Unit of Clinical Virology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
【Abstract】 Objective To analyse the variation of envelope gene of genotype Ⅱ and Ⅲ hepatitis C virus (HCV) isolated from Shanghai patients with chronic hepatitis C. Methods The envelope genes (E1, E2/NS1) were amplified by nested reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Totally 1 005 bp were sequenced and compared with previously reported isolates. Results The nucleotide (nt) and amino acid (aa) homologies between genotype Ⅱ and Ⅲ Shanghai isolates were 62.48% and 59.10%, respectively. The nt and aa homologies between Shanghai isolates and isolates with the same genotype from different regions were 85.97%～87.36% and 83.38%～86.57%, whereas the homologies between isolates with different genotypes, were 61.49%～70.95% and 59.10%～78.21%. Five hypervariable regions (aa 251～258, 297～301, 384～408, 461～467, 475～480) were found and two of them were consistent with the two hepervariable regions reported previously (aa 384～408, 474～482). Conclusion The variation of envelope gene was great and the knowledge of how variability distributed along different regions of the HCV genome could be helpful in the design of HCV vaccine.
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【Key words】Hepatitis C virus; Envelope gene; Nucleotide sequence
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后及散发性非甲非乙型肝炎的主要病原。HCV为长约9.4 kb的单股正链RNA病毒，其中E1、E2区是HCV基因组中变异最大的部位，其编码的包膜糖蛋白可能刺激机体产生保护性抗体[1，2]。E2包膜区内的高变区(HVR1)是产生中和抗体的关键部位，但对免疫逃避株无中和作用[3]。包膜区的高度变异导致病毒准种及免疫逃避株的产生，给疫苗的研制带来困难。
我们对上海地区Ⅱ、Ⅲ型HCV E1、E2/NS1区进行了序列测定，并与国内外分离株作比较，分析其同源性及变异特点。
材料与方法
一、血清标本
, http://www.100md.com
2份血清标本来自上海第二医科大学瑞金医院传染病科住院患者，有输血史，丙氨酸转氨酶(ALT)异常，经Abbott试剂检测抗-HCV(+)，上海华美试剂检测HCV RNA(+)。采用Okamoto基因分型法[4]，1份血清为Ⅱ/1b型，另1份血清为Ⅲ/2a型。
二、HCV-E1、E2/NS1片段扩增
用异硫氰酸胍裂解，酚、氯仿提取HCV RNA，逆转录后，经套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增得所需片段。PCR及测序引物参考HCV-J[5]、HCV-BK[6]、HCV-HB[7]及HC-J6[8]株序列，选择相对保守的区域设计，由上海市血液学研究所合成。
PCR及测序引物序列及位置如下： E1区Ⅱ型引物
, 百拇医药 外引物 S1 5′-CTCATGGGGTACATTCCGCT-3′ 397～416
A1 5′-GCG(A)AAGAGTAGCATCACAATC-3′ 1116～1136
内引物 S2 5′-CGGAATTCATGGCACATGGTGTCCGGGTT-3′ 452～471
A2 5′-CGGAATTCATCACAATCAAA(G)ACCTTAGCC-3′ 1104～1125
E1区Ⅲ型引物
外引物 QS1 5′-CCGACCTCATGGGGTACAT-3′ 392～410
QA1 5′-CAAAGAGTCATTGCAGTTCAG-3′ 1279～1299
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内引物 QS2 5′-CGGGATCCATGGGGAACTTACCCGGTTGCTC-3′ 499～518
QA2 5′-CGGAATTCCGGTGCGGTTGATGTGCCA-3′ 1258～1276
E2区Ⅱ、Ⅲ型通用引物
外引物 S3n 5′-GGTCACCGCATGG(CG)TTGGGA-3′ 943～962
A3n 5′-CACGTCTTGGTGA(AG)CC(CG)AGTG-3′ 1671～1691
内引物 S4n 5′-CGGGATCCTGGGATATGATGATGAACTGGTC-3′ 958～980
A4n 5′-CGGAATTCCAGCACGTCTGTCTCATTCTCC-3 1590～1611
, 百拇医药
* 划线部分为酶切位点
三、PCR产物直接序列分析
采用DNA测序试剂盒，根据双脱氧链末端终止法原理，在373A DNA全自动测序仪上测定，测序引物采用PCR扩增时的内引物，同一片段正反两方向测定。
结果
一、PCR扩增产物电泳结果
Ⅱ型HCV株经外引物S1、A1及内引物S2、A2扩增，Ⅲ型HCV株经外引物QS1、QA1及内引物QS2、QA2扩增，得到片段包含全部E1及部分C区片段，Ⅱ型长度为674 bp，Ⅲ型长度为778 bp。Ⅱ型、Ⅲ型HCV经外引物S3n、A3n及内引物S4n、A4n扩增得到长度为654 bp的部分E2区片段。
二、核苷酸序列分析结果
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测定了上海株Ⅱ型HCV-SH2、Ⅲ型HCV-SH3的E1区及部分E2区(包括两个高变区)共1 005 bp的核苷酸序列，并与国内外其它分离株进行了比较，其同源性结果列于表1。
表1 上海株Ⅱ、Ⅲ型与其它分离株E1、E2/NS1相应部位核苷酸同源性比较(%)
HCV-SH3
HCV-HB
HCV-J
HCV-BK
HC-J6
HCV-1
HCV-SH2
62.48
, 百拇医药
87.36
87.16
85.97
61.49
70.95
HCV-SH3
—
63.38
62.90
64.16
86.45
63.98
表2 上海株Ⅱ、Ⅲ型与其它分离株E1、E2/NS1相应部位推导的氨基酸同源性比较(%)
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HCV-SH3
HCV-HB
HCV-J
HCV-BK
HC-J6
HCV-1
HCV-SH2
59.10
85.07
86.57
83.58
59.11
78.21
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59.10
60.00
83.38
66.56
三、推导的氨基酸序列及其与其它分离株的比较
由测得的上海株Ⅱ型HCV-SH2、Ⅲ型HCV-SH3的E1及E2/NS1部分核苷酸顺序推导其相对应的氨基酸序列，并与其它分离株相应部位进行了比较，其同源性结果列于表2。讨论
HCV基因组具有很大的变异性，根据不同的分型方法，可将HCV分为不同的基因型。Okamoto分型方法根据HCV核心区核苷酸序列的差异，通过逆转录-聚合酶链反应分析扩增产物的长度，将HCV分为Ⅰ～Ⅳ基因型。我们通过此分型方法选择到上海地区Ⅱ型和Ⅲ型HCV各1株，对E1、E2/NS1区的序列进行了测定，并进一步与其它已知序列作了比较。
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不同国家、不同地区的HCV基因组间存在很大的差异，其中编码包膜蛋白的E1、E2/NS1区在HCV基因组中变异程度最大。该区不断发生变异，可能与丙型肝炎容易发生慢性化、干扰素耐受及导致肝癌等有一定的关系。HCV-E1、E2/NS1区核苷酸和氨基酸同源性比较显示：上海株Ⅱ型、Ⅲ型间分别为62.48%和59.10%；上海株与国内外同型株间分别为85.97%～87.36%和83.38%～86.57%；上海株与国内外不同型株间分别为61.49%～70.95%和59.10%～78.21%。此外，与其它株比较发现，上海株较大变异区包括第251～258、297～301、384～408、461～467、475～480位氨基酸，其中两个与公认的高变区HVR1(第384～408aa)和HVR2(第474～482aa)位置一致[10]。有研究认为位于包膜蛋白E2(gp70)内的HVR1，可能含有B细胞中和表位，但仅对同源病毒株有特异性[3]。该区的高度变异给研制普遍适用的疫苗造成很大困难。
尽管E1、E2/NS1区变异很大，但我们仍可以观察到一些氨基酸保守区，如224～229、276～283、316～329、350～355、415～421、483～489、502～521位氨基酸，这些区域含有较多的半胱氨酸及脯氨酸，半胱氨酸与形成链间及链内二硫键有关，脯氨酸与多肽转角的形成有关，因此推测这些氨基酸保守部位在维持外膜蛋白的空间结构及功能方面起重要作用，至于这些部位是否具有抗原表位，有待进一步研究。
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参考文献
1，Choo QL, Kuo G, Ralston R, et al. Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:1294-1298.
2，Farci P, Alter HJ, Wong DC, et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibody mediated in vitro neutralization. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:7792-7796.
3，Farci P, Shimoda A, Wong D, et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 of envelope 2 protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:15394-15399.
, 百拇医药
4，Okamoto H, Sugiyama Y, Okada S, et al. Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers. Application to clinical surveys and tracing infectious sources. J Gen Virol, 1992, 73:673-679.
5，Kato N, Hijikata M, Ootsuyama Y, et al. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:9524-9528.
6，Takamizawa A, Mori C, Fuke I, et al. Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J Virol, 1991, 65:1105-1113.
, 百拇医药
7，毕胜利，白宪鹤，丛勉尔，等.中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异.病毒学报，1993，9：104-127.
8，Okamoto H, Okada S, Sugiyama Y, et al. Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparison with reported isolates for conserved and divergent regions. J Gen Virol, 1991, 72:2697-2704.
9，Choo QL, Richman KH, Han JH, et al. Genetic organization and diverisity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:2451-2455.
10，Okada S, Akahane Y, Suzuki H, et al. The degree of variability in the amino terminal region of the E2/NS1 protein of hepatitis C virus correlates with responsiveness to interferon therapy in viremic patients. Hepatology, 1992, 16:619-624.
收稿日期：1999-12-21, http://www.100md.com