慢性乙型肝炎患者外周血T细胞受体基因重组的意义
作者：郭毅 吴辉 李十月 燕虹
单位：郭毅 李十月 燕虹(430071 武汉，湖北医科大学流行病学教研室)；吴辉(湖北医科大学第二医院传染病教研室)
关键词：肝炎，乙型；T细胞受体基因；重组
中华传染病杂志000204 【摘要】 目的 通过对慢性乙型肝炎患者外周血T细胞受体基因β链(T cell receptor gene Beta chain, TCRβ)重组与血清HBeAg，抗-HBe和丙氨酸转氨酶(ALT)平行检测，以探讨优势T细胞克隆在病程中的作用。方法 运用Southern杂交检测85例慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞DNA。结果 85例患者TCRβ重组阳性率为44.7%，大多数具有EcoRⅠ或/和HindⅢ重组带。横断面比较及对19例患者的随访表明：TCRβ基因重组的检出与HBV的清除和细胞毒作用有关。结论 TCRβ基因重组似可作为评价本病特异性免疫应答及肝脏损伤的一个指标。
, http://www.100md.com
Tcell receptor gene rearrangement of Peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic he-patitis B
GUO Yi, WU Hui, LI Shiyue, et al.
(Department of Epidemiology, Department of Infectious Diseases, Hubei Medical University, Hubei Wuhan, 430071, China)
【Abstract】 Objective T cell receptor gene (TCR) rearrangement of peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis B was detected simultaneously with serum HBeAg, anti-HBe and alanine aminotransferase (ALT) to examine the role of dominant T cell clones. Methods Southern hybridization was used to detect DNA from peripheral blood mononuclear cells in 85 patients with chronic he-patitis B. Results The positive rate of TCR rearrangement was 44.7% in 85 patients with chronic hepatitis B. Most of them demonstrated two kinds of rearrangement bands of DNA fragment. Cross-sectional study indicated there was no significant difference in positive rate of HBeAg between TCR positive group and TCR negative group while there was significant difference in ALT between the two groups. Follow-up of 19 patients with chronic hepatitis B suggested that appearance of the TCR rearrangement was associated with cytotoxicity to liver and clearance of hepatitis B virus.Conclusion The detection of TCR rearrangement is useful in the evaluation of disease progression and immune response.
, 百拇医药
【Key words】Hepatitis B; T cell receptor gene; Rearrangement
乙型肝炎病毒(HBV)感染机体后可致不同的临床表现，其原因尚未明了。一般认为，T细胞对HBV的免疫应答决定HBV感染的结果[1]，慢性乙型肝炎的形成是由于细胞免疫不能彻底清除HBV所致。由于遗传因素决定T细胞受体(TCR)基因重组的方式，导致TCR分子结构的改变，进而影响T细胞的免疫应答能力。因此，不同个体间的病情差异可能是由于T细胞对HBV应答的改变所致，而这种应答的改变可用TCR基因重组来反映。
材料与方法
一、研究对象
我院1994年3月至1997年11月住院的85例慢性乙型肝炎患者，男62例，女23例，平均年龄28.4岁。健康对照64例，男41例，女23例，平均年龄30.1岁。所有患者平行检测HBsAg、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、抗-HBs、丙氨酸转氨酶(ALT)。
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为了确定TCRβ基因重组与病程的关系，我们动态观察了19例患者。首份血TCRβ基因重组阳性者8例，TCRβ基因重组阴性者11例，共检测68次。随访时间1～37个月，每例患者最少检测2次，最多8次。
二、TCRβ基因重组检测[2]
每例采血10 ml，分离单个核细胞(其中含大量淋巴细胞)，用含有0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K溶液消化，37℃过夜，然后用盐析法提取DNA[3]。DNA用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化(2U/μg DNA)，电泳后转印到Hybond-Nylon膜上(Amersham, Buckinghamshire, UK)，用紫外光固定，然后用32P-dCTP标记的TCRβ C1区cDNA探针杂交，65℃过夜。TCRβ C1区探针的标记采用随机引物法。杂交后Hybond-Nylon膜分别用2×、1×、0.2×、0.1×SSC和0.1% SDS漂洗，温度65℃。最后用Kodak X-Omat AR底片在-70℃曝光显影1～3 d。
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结果
一、TCRβ基因重组的辨别[4]
用EcoRⅠ消化，11 kb和4 kb的带为胚系型带；用HindⅢ消化，8 kb、6 kb、3.5 kb的带为胚系型带，为非T细胞共有。不同于胚系型的带为重组带，见图1。
图1 经HindⅢ消化，箭头指处为重组带，余为胚系型带
二、TCRβ基因重组的检出率
病例组有38例(44.7%)TCRβ基因重组，对照组仅5例(7.8%)重组。经χ2检验，差异有高度显著性(χ2=20.69,P<0.01)。38例TCRβ基因重组阳性的患者中，33例有EcoRⅠ 5.0 kb和/或HindⅢ 5.5 kb重组带，其中8例有EcoRⅠ 21 kb，5例有EcoRⅠ 4.5 kb，6例有HindⅢ 18 kb重组带。5例无EcoRⅠ 5.0 kb,HindⅢ 5.5 kb的患者中，2例有EcoRⅠ 21 kb，3例有HindⅢ 18 kb重组带。
, 百拇医药
三、TCRβ基因重组与疾病的关系
(一) 横断面比较 TCRβ阳性组38例患者有22例(57.9%)HBeAg阳性，阴性组47例患者中22例(46.8%)HBeAg阳性，经χ2检验，差异无显著性(χ2=1.03, P>0.05)。阳性组的患者ALT均值(134±28)U/L高于阴性组(102±34)U/L，经t检验，差异有高度显著性(t=4.64,P<0.01)。
(二) 随访观察结果 首份血TCRβ基因重组阳性的8例患者的36例次检测中，TCRβ基因的重组出现在ALT高峰前或与高峰一致，并与HBeAg检出相吻合；当TCRβ基因重组消失时，HBeAg阴转，抗-HBe出现，ALT降低或恢复正常，见表1。首份血TCRβ基因重组阴性的11例患者的32例次检测中，仅6例次检测出TCRβ基因重组，与ALT与HBeAg关系不明显，且ALT波动小。
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表1 8例TCRβ基因重组患者的随访观察 例号
项 目
随 访 例 次
1
2
3
4
5
6
7
8
例1
HBeAg
, 百拇医药
+
+
-
+
+
+
+
+
抗-HBe
-
-
+
-
-
, 百拇医药
-
-
-
ALT(U/L)
244
455
68
115
238
76
121
542
TCRβ
, http://www.100md.com
+
+
-
+
+
+
+
+
例2
HBeAg
+
+
+
+
, http://www.100md.com
-
-
抗-HBe
-
-
-
-
+
+
ALT
209
308
181
423
, 百拇医药
55
70
TCRβ
+
+
+
+
-
-
例3
HBeAg
+
+
, 百拇医药 -
-
抗-HBe
-
-
-
+
ALT
98
645
40
46
TCRβ
, 百拇医药 +
+
-
-
例4
HBeAg
+
+
+/-
+/-
+/-
抗-HBe
-
-
, http://www.100md.com
-
-
-
ALT
216
230
36
40
50
TCRβ
+
+
-
, 百拇医药 -
-
例5*
HBeAg
-
-
-
-
-
抗-HBe
+
+
+
+
, 百拇医药
+
ALT
190
42
58
96
50
TCRβ
+
-
-
+
-
, 百拇医药 例6
HBeAg
-
-
-
-
抗-HBe
+
+
+
+
ALT
35
160
, 百拇医药
20
30
TCRβ
+
+
-
-
例7
HBeAg
+
+
抗-HBe
-
, 百拇医药
-
ALT
68
1760
TCRβ
+
+
例8
HBeAg
+
+
抗-HBe
-
, 百拇医药
-
ALT
132
122
TCRβ
+
-
* 例5为HBV前C区1896位点变异讨论
TCR基因重组已被广泛地用作T细胞谱系和克隆化的标志[5]。每个成熟的T细胞克隆具有独特的TCR基因重组序列，表达特异的T细胞受体。当遇到相应的抗原刺激时，则大量增殖，故可用分子杂交法检出，表现为特异的杂交带。检测TCR基因重组能探讨特异的T细胞克隆在病程中的作用。
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慢性乙型肝炎TCRβ基因的重组率高于健康对照，差异有高度显著性，表明HBV感染导致部分慢性患者体内特异的T细胞克隆增殖，形成优势克隆，对HBV感染能够形成免疫应答。
横断面比较的结果显示，TCRβ基因阳性组的ALT高于TCRβ基因阴性组，提示TCRβ基因重组的出现与肝脏损伤有关。
慢性乙型肝炎患者血清HBeAg向抗-HBe转化时，肝脏损伤加重，被认为是细胞毒T细胞清除HBV感染的肝细胞所致。对8例首次检测TCRβ基因重组阳性的患者动态观察显示，TCRβ基因重组与血清HBeAg向抗-HBe转变和ALT升高基本一致，提示优势克隆参与HBV的清除及细胞毒作用。11例首次检测TCRβ基因重组阴性患者的TCRβ检出率低，ALT波动小，与HBeAg变化的关系不明显，提示这些患者免疫应答较弱。因此，TCRβ检测似可作为评价慢性乙型肝炎患者免疫应答能力及肝脏损伤程度的一项指标。
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TCRβ基因重组的患者呈现不同的重组带，大多数具有EcoRⅠ 5.0 kb重组带和/或Hind Ⅲ 5.5 kb重组带，表明不同的T细胞克隆参与了对HBV的应答，优势克隆主要有两种。由于一个克隆针对一个抗原表位，且这些克隆与慢性乙型肝炎患者的HBV清除有关，故可通过优势克隆确定相应的HBV表位，为今后制备具有治疗作用的疫苗治疗本病提供依据。
本课题受湖北省卫生厅基金资助(W940301010)
参考文献
1，Mondelli MG, Mieli VG, Albert A, et al. Specificity of the T lymphocyte cytotoxicity to autologous hepatocytes in chronic hepatitis B virus infection: evidence that T cell are directed against HBV core antigen expressed on hepatocytes. J Immunol, 1982, 129:2773-2781.
, http://www.100md.com
2，Soeharso P, Summers KM, Cooksley WG, et al. Allotype distribution of human T cell receptor beta and gamma chain genes in caucasians, Asians and Australian Aborigines: relevence to chronic hepatitis B. Hum Genet, 1992,89:59-63.
3，Miller SA, Dykes DD, Polesky HF, et al. A simple sample salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 1988, 16:1215.
4，Moebius U, Manns M, Hess G, et al. T cell receptor gene rearrangements of T lymphocytes infiltrating the liver in chronic active hepatitis B and primary biliary cirrhosis (PBC): oligoclonality of PBC-derived T cell clones. Eur J Immunol, 1990, 20:889-896.
5，Knowles DM, Pelicci PG, Dalla FR, et al. T cell receptor beta chain gene rearrangements: genetic markers of T cell lineage and cell lineage clonality. Hum Pathol, 1986, 17:546-551.
收稿日期：1999-09-20, 百拇医药
单位：郭毅 李十月 燕虹(430071 武汉，湖北医科大学流行病学教研室)；吴辉(湖北医科大学第二医院传染病教研室)
关键词：肝炎，乙型；T细胞受体基因；重组
中华传染病杂志000204 【摘要】 目的 通过对慢性乙型肝炎患者外周血T细胞受体基因β链(T cell receptor gene Beta chain, TCRβ)重组与血清HBeAg，抗-HBe和丙氨酸转氨酶(ALT)平行检测，以探讨优势T细胞克隆在病程中的作用。方法 运用Southern杂交检测85例慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞DNA。结果 85例患者TCRβ重组阳性率为44.7%，大多数具有EcoRⅠ或/和HindⅢ重组带。横断面比较及对19例患者的随访表明：TCRβ基因重组的检出与HBV的清除和细胞毒作用有关。结论 TCRβ基因重组似可作为评价本病特异性免疫应答及肝脏损伤的一个指标。
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Tcell receptor gene rearrangement of Peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic he-patitis B
GUO Yi, WU Hui, LI Shiyue, et al.
(Department of Epidemiology, Department of Infectious Diseases, Hubei Medical University, Hubei Wuhan, 430071, China)
【Abstract】 Objective T cell receptor gene (TCR) rearrangement of peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis B was detected simultaneously with serum HBeAg, anti-HBe and alanine aminotransferase (ALT) to examine the role of dominant T cell clones. Methods Southern hybridization was used to detect DNA from peripheral blood mononuclear cells in 85 patients with chronic he-patitis B. Results The positive rate of TCR rearrangement was 44.7% in 85 patients with chronic hepatitis B. Most of them demonstrated two kinds of rearrangement bands of DNA fragment. Cross-sectional study indicated there was no significant difference in positive rate of HBeAg between TCR positive group and TCR negative group while there was significant difference in ALT between the two groups. Follow-up of 19 patients with chronic hepatitis B suggested that appearance of the TCR rearrangement was associated with cytotoxicity to liver and clearance of hepatitis B virus.Conclusion The detection of TCR rearrangement is useful in the evaluation of disease progression and immune response.
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【Key words】Hepatitis B; T cell receptor gene; Rearrangement
乙型肝炎病毒(HBV)感染机体后可致不同的临床表现，其原因尚未明了。一般认为，T细胞对HBV的免疫应答决定HBV感染的结果[1]，慢性乙型肝炎的形成是由于细胞免疫不能彻底清除HBV所致。由于遗传因素决定T细胞受体(TCR)基因重组的方式，导致TCR分子结构的改变，进而影响T细胞的免疫应答能力。因此，不同个体间的病情差异可能是由于T细胞对HBV应答的改变所致，而这种应答的改变可用TCR基因重组来反映。
材料与方法
一、研究对象
我院1994年3月至1997年11月住院的85例慢性乙型肝炎患者，男62例，女23例，平均年龄28.4岁。健康对照64例，男41例，女23例，平均年龄30.1岁。所有患者平行检测HBsAg、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、抗-HBs、丙氨酸转氨酶(ALT)。
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为了确定TCRβ基因重组与病程的关系，我们动态观察了19例患者。首份血TCRβ基因重组阳性者8例，TCRβ基因重组阴性者11例，共检测68次。随访时间1～37个月，每例患者最少检测2次，最多8次。
二、TCRβ基因重组检测[2]
每例采血10 ml，分离单个核细胞(其中含大量淋巴细胞)，用含有0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K溶液消化，37℃过夜，然后用盐析法提取DNA[3]。DNA用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化(2U/μg DNA)，电泳后转印到Hybond-Nylon膜上(Amersham, Buckinghamshire, UK)，用紫外光固定，然后用32P-dCTP标记的TCRβ C1区cDNA探针杂交，65℃过夜。TCRβ C1区探针的标记采用随机引物法。杂交后Hybond-Nylon膜分别用2×、1×、0.2×、0.1×SSC和0.1% SDS漂洗，温度65℃。最后用Kodak X-Omat AR底片在-70℃曝光显影1～3 d。
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结果
一、TCRβ基因重组的辨别[4]
用EcoRⅠ消化，11 kb和4 kb的带为胚系型带；用HindⅢ消化，8 kb、6 kb、3.5 kb的带为胚系型带，为非T细胞共有。不同于胚系型的带为重组带，见图1。
图1 经HindⅢ消化，箭头指处为重组带，余为胚系型带
二、TCRβ基因重组的检出率
病例组有38例(44.7%)TCRβ基因重组，对照组仅5例(7.8%)重组。经χ2检验，差异有高度显著性(χ2=20.69,P<0.01)。38例TCRβ基因重组阳性的患者中，33例有EcoRⅠ 5.0 kb和/或HindⅢ 5.5 kb重组带，其中8例有EcoRⅠ 21 kb，5例有EcoRⅠ 4.5 kb，6例有HindⅢ 18 kb重组带。5例无EcoRⅠ 5.0 kb,HindⅢ 5.5 kb的患者中，2例有EcoRⅠ 21 kb，3例有HindⅢ 18 kb重组带。
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三、TCRβ基因重组与疾病的关系
(一) 横断面比较 TCRβ阳性组38例患者有22例(57.9%)HBeAg阳性，阴性组47例患者中22例(46.8%)HBeAg阳性，经χ2检验，差异无显著性(χ2=1.03, P>0.05)。阳性组的患者ALT均值(134±28)U/L高于阴性组(102±34)U/L，经t检验，差异有高度显著性(t=4.64,P<0.01)。
(二) 随访观察结果 首份血TCRβ基因重组阳性的8例患者的36例次检测中，TCRβ基因的重组出现在ALT高峰前或与高峰一致，并与HBeAg检出相吻合；当TCRβ基因重组消失时，HBeAg阴转，抗-HBe出现，ALT降低或恢复正常，见表1。首份血TCRβ基因重组阴性的11例患者的32例次检测中，仅6例次检测出TCRβ基因重组，与ALT与HBeAg关系不明显，且ALT波动小。
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表1 8例TCRβ基因重组患者的随访观察 例号
项 目
随 访 例 次
1
2
3
4
5
6
7
8
例1
HBeAg
, 百拇医药
+
+
-
+
+
+
+
+
抗-HBe
-
-
+
-
-
, 百拇医药
-
-
-
ALT(U/L)
244
455
68
115
238
76
121
542
TCRβ
, http://www.100md.com
+
+
-
+
+
+
+
+
例2
HBeAg
+
+
+
+
, http://www.100md.com
-
-
抗-HBe
-
-
-
-
+
+
ALT
209
308
181
423
, 百拇医药
55
70
TCRβ
+
+
+
+
-
-
例3
HBeAg
+
+
, 百拇医药 -
-
抗-HBe
-
-
-
+
ALT
98
645
40
46
TCRβ
, 百拇医药 +
+
-
-
例4
HBeAg
+
+
+/-
+/-
+/-
抗-HBe
-
-
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-
-
ALT
216
230
36
40
50
TCRβ
+
+
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-
例5*
HBeAg
-
-
-
-
-
抗-HBe
+
+
+
+
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+
ALT
190
42
58
96
50
TCRβ
+
-
-
+
-
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HBeAg
-
-
-
-
抗-HBe
+
+
+
+
ALT
35
160
, 百拇医药
20
30
TCRβ
+
+
-
-
例7
HBeAg
+
+
抗-HBe
-
, 百拇医药
-
ALT
68
1760
TCRβ
+
+
例8
HBeAg
+
+
抗-HBe
-
, 百拇医药
-
ALT
132
122
TCRβ
+
-
* 例5为HBV前C区1896位点变异讨论
TCR基因重组已被广泛地用作T细胞谱系和克隆化的标志[5]。每个成熟的T细胞克隆具有独特的TCR基因重组序列，表达特异的T细胞受体。当遇到相应的抗原刺激时，则大量增殖，故可用分子杂交法检出，表现为特异的杂交带。检测TCR基因重组能探讨特异的T细胞克隆在病程中的作用。
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慢性乙型肝炎TCRβ基因的重组率高于健康对照，差异有高度显著性，表明HBV感染导致部分慢性患者体内特异的T细胞克隆增殖，形成优势克隆，对HBV感染能够形成免疫应答。
横断面比较的结果显示，TCRβ基因阳性组的ALT高于TCRβ基因阴性组，提示TCRβ基因重组的出现与肝脏损伤有关。
慢性乙型肝炎患者血清HBeAg向抗-HBe转化时，肝脏损伤加重，被认为是细胞毒T细胞清除HBV感染的肝细胞所致。对8例首次检测TCRβ基因重组阳性的患者动态观察显示，TCRβ基因重组与血清HBeAg向抗-HBe转变和ALT升高基本一致，提示优势克隆参与HBV的清除及细胞毒作用。11例首次检测TCRβ基因重组阴性患者的TCRβ检出率低，ALT波动小，与HBeAg变化的关系不明显，提示这些患者免疫应答较弱。因此，TCRβ检测似可作为评价慢性乙型肝炎患者免疫应答能力及肝脏损伤程度的一项指标。
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TCRβ基因重组的患者呈现不同的重组带，大多数具有EcoRⅠ 5.0 kb重组带和/或Hind Ⅲ 5.5 kb重组带，表明不同的T细胞克隆参与了对HBV的应答，优势克隆主要有两种。由于一个克隆针对一个抗原表位，且这些克隆与慢性乙型肝炎患者的HBV清除有关，故可通过优势克隆确定相应的HBV表位，为今后制备具有治疗作用的疫苗治疗本病提供依据。
本课题受湖北省卫生厅基金资助(W940301010)
参考文献
1，Mondelli MG, Mieli VG, Albert A, et al. Specificity of the T lymphocyte cytotoxicity to autologous hepatocytes in chronic hepatitis B virus infection: evidence that T cell are directed against HBV core antigen expressed on hepatocytes. J Immunol, 1982, 129:2773-2781.
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2，Soeharso P, Summers KM, Cooksley WG, et al. Allotype distribution of human T cell receptor beta and gamma chain genes in caucasians, Asians and Australian Aborigines: relevence to chronic hepatitis B. Hum Genet, 1992,89:59-63.
3，Miller SA, Dykes DD, Polesky HF, et al. A simple sample salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 1988, 16:1215.
4，Moebius U, Manns M, Hess G, et al. T cell receptor gene rearrangements of T lymphocytes infiltrating the liver in chronic active hepatitis B and primary biliary cirrhosis (PBC): oligoclonality of PBC-derived T cell clones. Eur J Immunol, 1990, 20:889-896.
5，Knowles DM, Pelicci PG, Dalla FR, et al. T cell receptor beta chain gene rearrangements: genetic markers of T cell lineage and cell lineage clonality. Hum Pathol, 1986, 17:546-551.
收稿日期：1999-09-20, 百拇医药