应用含CpG基序的寡核苷酸增强乙型肝炎病毒基因疫苗诱导的细胞免疫应答
作者：李文波 姚志强 周永兴 冯志华
单位：李文波(250031 济南，济南军区总医院消化科)；姚志强 周永兴 冯志华(第四军医大学唐都医院感染病科)
关键词：含CpG基序的寡核苷酸；肝炎病毒，乙型；基因疫苗；细胞免疫应答
中华传染病杂志000202 【摘要】 目的 探讨人工合成的含CpG基序的寡核苷酸(ODN)作为佐剂对乙型肝炎病毒(HBV)基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 构建编码HBV表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗，人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂，以Balb/c小鼠作为实验动物进行免疫接种；采用3H-TdR法、51Cr 4 h释放法等分别检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖和杀伤功能。结果 与空载体对照组相比较，HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P<0.05)；应用CpG ODN组与未应用组相比较，免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P<0.05)。结论 CpG ODN作为佐剂可增强HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答。
, 百拇医药
CpG oligodeoxyribonucleotide potently enhances cellular immune responses induced by hepatitis B virus gene vaccines
LI Wenbo, YAO Zhiqiang, ZHOU Yongxing, et al.
(Department of Gastroenterology, General Hospital of Jinan Military Region, Jinan 250031, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of CpG oligodeoxyribonucleotide (ODN) as adjuvants on cellular immune responses in mice immunized with hepatitis B virus (HBV) gene vaccines. Methods Recombinant eukaryotic expression plasmids of pCR3.1-S encoding S protein of HBV were constructed as gene vaccines. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides containing one CpG motif were synthesized as adjuvants. Then Balb/c mice were inoculated so that the immune responses to HBV could be studied. Lymphocyte proliferation reactions and cytotoxic T lymphocyte activities were detected through 3H-TdR incorporation and 4-hour 51Cr release assays. Results Compared with plasmid vectors of pCR3.1, HBV gene vaccines could induce strong lymphocyte proliferation reactions and cytotoxic T lymphocyte activities in immunized mice (P<0.05). Immunized mice with CpG ODN showed higher specific cellular responses to HBV than those without CpG ODN (P<0.05). Conclusion CpG ODN can act as adjuvants to enhence cellular immune responses in mice immunized with HBV gene vaccines.
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【Key words】CpG oligodeoxyribonucleotide; Hepatitis B virus; Gene vaccine; Cellular immunity response
有研究表明，细胞免疫应答，包括辅助T细胞(Th)和细胞毒T细胞(CTL)应答，在机体清除乙型肝炎病毒(HBV)的过程中发挥重要作用[1]。HBV基因疫苗，由于其可诱导机体产生较强且持久的细胞免疫应答，可能具有治疗乙型肝炎的作用。采用佐剂等措施，促进HBV基因疫苗诱导产生更强的细胞免疫应答，可能将增强其治疗效应。最近研究发现，含CpG基序(motif)的寡核苷酸(ODN)具有较强的Th1型免疫佐剂作用[2，3]。为此，我们合成了一段含CpG基序的ODN，构建了编码HBV S蛋白的基因疫苗pCR3.1-S，观察了CpG ODN对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。
材料和方法
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一、材料
(一) 细胞系和实验动物 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0、人肝癌细胞(HHCC)系为本室保存。实验动物采用雌性Balb/c小鼠，6～8周龄，第四军医大学实验动物中心提供。
(二) 质粒和宿主菌 真核表达质粒载体pCR3.1(Invitrogen公司)；含编码adw亚型HBsAg基因s的重组质粒pCR3.1-S，由姚志强教授在比利时鲁汶大学构建；宿主菌JM 109由本室李谨革博士惠赠。
(三) 主要试剂 RPMI-1640培养剂(Sigma公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；lipofectamine转染试剂(Gibco公司)；G418、HBsAg纯抗原(北京原平生物技术公司)；链霉素-卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒、小鼠抗-HBs(武汉博士德生物工程有限公司)；3H-TdR(中国原子能科学研究院同位素研究所)；Na251CrO4(美国杜邦公司)；ODN 5′-TCAACGTT-3′和5′-TCAAGCTT-3′(上海生物工程公司合成)。
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二、方法
(一) 重组质粒的构建 以计算机设计聚合酶链反应(PCR)引物，从HBV感染者血清(adw亚型)中扩增HBV S基因序列；以T-A克隆法将其插入真核表达载体pCR3.1；酶切、电泳鉴定含正向插入S基因片段的重组质粒，命名其为pCR3.1-S。
(二) 重组质粒的细胞表达 以脂质体lipofectamine介导基因转移，将重组质粒与空载体质粒分别转染细胞系Sp2/0、HHCC系。转染48～72 h后，1∶4～1∶8传代并以含G418培养基筛选。不同时间点收获转染细胞并以Western blot法检测HBsAg蛋白的表达。另取不同转染时间点的HHCC制作细胞爬片，以免疫组织化学染色法检测HBsAg蛋白的表达。
(三) CpG ODN的合成 Krieg等[4]曾报道，ODN 5′-TCAACGTT-3′(CpG ODN,含CpG motif “AACGTT”)可在体外诱导小鼠B淋巴增殖及分泌免疫球蛋白等，而ODN 5′-TCAAGCTT-3′(非CpG ODN)无此效应。由此，我们选择合成了这两段ODN分别作为免疫佐剂和对照剂。而且，为增强其核酸酶抗性，对其进行了硫代磷酸骨架修饰。
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(四) 免疫接种 按常规方法大量制备重组质粒，聚乙二醇(PEG)纯化，以无菌生理盐水溶解质粒并测定A比值达1.8～2.0。将Balb/c小鼠随机分组，每组小鼠5只。以0.5%盐酸布比卡因、0.1%对羟基苯甲酸甲酯(生理盐水为溶剂)处理小鼠股四头肌[5]。24 h后，以100 μg重组质粒接种处理后肌肉，分别以生理盐水、寡核苷酸5′-TCAACGTT-3′(50 μg*只-1*次-1)、寡核苷酸5′-TCAAGCTT-3′(50 μg*只-1*次-1)作为免疫佐剂。间隔两周加强注射，共接种2次。
(五) 淋巴细胞增殖反应的检测 采用3H-TdR掺入法。2次接种后约1周，取免疫小鼠脾细胞，以含10%小牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基调细胞浓度至1～5×109/L，100 μl/孔加入96孔培养板。培养4～6 h后，分别加入10～30 μg/ml纯HBsAg至总体积达200 μl/孔。72 h时每孔加入0.5 μCi 3H-TdR，继续培养12～18 h。以多头细胞收集仪将细胞收获于“9999”型玻璃纤维滤膜上，红外线烤箱烤干后以β计数仪(Backman公司)液闪计数。增殖水平以刺激指数(Stimulation Index,SI)表示，SI=(实验组cpm-仪器本底)/(对照组cpm-仪器本底)。
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(六) 淋巴细胞杀伤效应的检测 采用51Cr 4 h释放法。以重组质粒pCR3.1-S转染Sp2/0细胞(遗传背景H-2d,与Balb/c小鼠遗传背景相同)制备HBV特异性靶细胞。取0.5 ml以G418筛选1～2周的重组质粒转染Sp2/0(浓度2×109/L)细胞，加入100 μCi Na251CrO4温育2～3 h进行标记，其间每15～20 min轻摇1次。标记结束后，洗涤并调细胞浓度为1×108/L，以其作为靶细胞。另取免疫小鼠脾细胞为效应细胞。将靶细胞和效应细胞各100 μl/孔加入96孔培养板(效靶比1∶50)，最大释放组及自然释放组分别加入1% Triton-X 100和靶细胞、RPMI-1640完全培养基和靶细胞各200 μl/孔。继续培养4 h后，取上清100 μl，γ免疫计数仪计数(FJ-2008型，西安国营226厂)。特异性杀伤率(%)=(实验组cpm-自然释放组cpm)/(最大释放组cpm-自然释放组cpm)×100%。
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结果
一、重组质粒的鉴定
质粒载体pCR3.1分子大小为5.0 kb，以CMV IE(cytomegalovirus immediate-early)为启动子。分析其多克隆位点并参照HBV s基因序列酶切图谱，重组质粒pCR3.1-S以Xbal酶切可获得621 bp片段，以HindⅢ酶切可获得122 bp片段，鉴定结果与理论推测基本一致。
二、重组质粒的细胞表达
分别以Western blot法、SABC免疫组化染色法检测Sp2/0转染细胞、HHCC转染细胞发现，重组质粒pCR3.1-S组转染细胞可表达一定量的HBsAg蛋白，而空质粒载体转染组细胞则不能。
三、重组质粒诱导的细胞免疫应答
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与空质粒载体接种组小鼠相比较，100 μg重组质粒免疫组小鼠脾淋巴细胞，体外经HBsAg蛋白刺激后增殖明显(P<0.05);51Cr 4 h释放法测定其体外杀伤功能亦显示对HBV特异靶细胞的杀伤效应明显(P<0.05)，见表1。
表1 不同免疫组小鼠的细胞免疫应答比较(
±s) 组别
淋巴细胞增殖反应
(刺激指数)
淋巴细胞杀伤效应
(杀伤率%)
pCR3.1
1.08±0.26
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18.5±3.0
pCR3.1-S+生理盐水
4.65±1.24*
60.2±8.6*
pCR3.1-S+非CpG ODN
5.27±1.83* *
58.6±6.5* *
pCR3.1-S+CpG ODN
8.64±2.51* * *
75.4±10.2* * *
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t检验：*P<0.05、* *P<0.05，与pCR3.1免疫对照组；* *P>0.05，与生理盐水佐剂组；* * *P<0.05，与生理盐水佐剂组、非CpG ODN佐剂组
四、CpG ODN对细胞免疫应答产生的影响
与应用生理盐水作为对照佐剂相比较，非CpG ODN作为佐剂组，重组质粒免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应增强，淋巴细胞杀伤活性减弱，但统计学分析，两者差异无显著性(P>0.05)；CpG ODN作为佐剂组，重组质粒免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应及杀伤效应均明显增强(P<0.05)。另外，CpG ODN作为佐剂组与非CpG ODN作为佐剂组相比较，重组质粒诱导小鼠产生的淋巴细胞增殖反应及杀伤效应差异均有显著性(P<0.05，表1)。结果提示：CpG ODN作为佐剂可促进HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生的细胞免疫应答，其佐剂效应主要由于CpG基序的存在。
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讨论
基因免疫是近年发展迅速的一种新兴免疫策略。它是指构建携带目的抗原基因的重组真核表达载体，以各种方式将其导入体内，使之在机体细胞内持续表达具有天然构象的抗原蛋白，从而诱导机体产生抗原特异的体液和细胞免疫应答。与常规蛋白质疫苗等相比较，基因疫苗尤其可诱导产生较强的细胞免疫应答，故有望用于慢性病毒性感染如乙型肝炎的治疗。Moncini等[6]以HBV基因疫苗免疫HBsAg转基因小鼠，结果发现，转基因小鼠血循环中HBsAg滴度明显下降，且抗-HBs出现阳转，有些小鼠甚至HBsAg完全被清除。在本实验中，我们构建了编码HBV s蛋白的重组质粒pCR3.1-S，以其作为HBV基因疫苗免疫接种Balb/c小鼠，结果免疫小鼠产生了较好的免疫应答[7，8]。而且，我们尝试应用CpG ODN作为佐剂，观察其对重组质粒pCR3.1-S诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响，目的是为基因疫苗诱导机体获得更强的细胞免疫应答寻找途径，从而为HBV基因疫苗应用于乙型肝炎的治疗奠定基础。
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CpG ODN是指含有CpG基序(以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤为基元构成的特定核苷酸序列结构)的ODN。近期研究显示，CpG ODN作为佐剂，可明显促进Th1型免疫应答的产生[2，3]。其与不完全弗氏佐剂(IFA)联合应用时，其效应甚至强于完全弗氏佐剂(CFA)。即使与Th2型佐剂如氢氧化铝合用亦可明显促进免疫应答的产生，且Th1型应答明显强于Th2型应答。本实验中，我们以CpG ODN(5′-TCAACGTT-3′)作为重组质粒pCR3.1-S的佐剂，结果，免疫小鼠的抗-HBs应答、淋巴细胞增殖反应和淋巴细胞杀伤效应明显增强，其佐剂效应主要由于CpG基序的存在，提示CpG ODN可促进HBV基因疫苗的细胞免疫效应。Porter等[9]以含CpG基序的质粒DNA与登革热基因疫苗共注射动物，结果基因疫苗的免疫效应明显增强。Sato等[10]亦报道，CpG ODN与基因疫苗共同注射可促进基因疫苗的免疫效应。我们的研究结果与这些报道相一致。CpG ODN的佐剂作用可能与其可激活多种免疫细胞，诱生多种细胞因子，尤其可调节免疫应答向Th1亚型转换等免疫学效应有关。
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本课题获国家自然科学基金资助(39770665)
参考文献
1，Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Annu Rev Immunol, 1995,13:29-61.
2，Chu RS, Targoni OS, Krieg AM, et al. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1(Th1) immunity. J Exp Med, 1997,186:1623-1631.
3，Davis HL, Weeratna R, Waldschmidt TJ, et al. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with he-patitis B surface antigen. J Immunol, 1998,160:870-876.
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4，Krieg AM, Yi AK, Matson S, et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature, 1995, 374:546-549.
5，Wang B, Ugen KE, Strikantan V, et al. Gene inoculation gene-rates immune responses against human immunodeficiency virus type 1. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90:4156-4160.
6，Moncini M, Hadchouel M, Davis HL, et al. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:12496-12501.
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7，李文波，周永兴，姚志强，等.乙型肝炎病毒基因疫苗免疫小鼠的初步研究.陕西医学杂志，1999，28：125-126.
8，李文波，姚志强，周永兴，等.白细胞介素2作为乙型肝炎病毒基因疫苗佐剂的效应.细胞与分子免疫学杂志，1999，15:55-56.
9，Porter KR, Kochel TJ, Raviprakask K, et al. Protective efficacy of a dengue 2 DNA vaccine in mice and effect of CpG immunostimulatory motifs on antibody responses. Arch Virol, 1998,143:997-1003.
10，Sato Y, Roman M, Tighe H, et al. Immunostimulatory DNA sequences for effective intradermal gene immunization. Science, 1996,273:352-354.
收稿日期：1999-09-18, 百拇医药
单位：李文波(250031 济南，济南军区总医院消化科)；姚志强 周永兴 冯志华(第四军医大学唐都医院感染病科)
关键词：含CpG基序的寡核苷酸；肝炎病毒，乙型；基因疫苗；细胞免疫应答
中华传染病杂志000202 【摘要】 目的 探讨人工合成的含CpG基序的寡核苷酸(ODN)作为佐剂对乙型肝炎病毒(HBV)基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 构建编码HBV表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗，人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂，以Balb/c小鼠作为实验动物进行免疫接种；采用3H-TdR法、51Cr 4 h释放法等分别检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖和杀伤功能。结果 与空载体对照组相比较，HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P<0.05)；应用CpG ODN组与未应用组相比较，免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P<0.05)。结论 CpG ODN作为佐剂可增强HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答。
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CpG oligodeoxyribonucleotide potently enhances cellular immune responses induced by hepatitis B virus gene vaccines
LI Wenbo, YAO Zhiqiang, ZHOU Yongxing, et al.
(Department of Gastroenterology, General Hospital of Jinan Military Region, Jinan 250031, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of CpG oligodeoxyribonucleotide (ODN) as adjuvants on cellular immune responses in mice immunized with hepatitis B virus (HBV) gene vaccines. Methods Recombinant eukaryotic expression plasmids of pCR3.1-S encoding S protein of HBV were constructed as gene vaccines. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides containing one CpG motif were synthesized as adjuvants. Then Balb/c mice were inoculated so that the immune responses to HBV could be studied. Lymphocyte proliferation reactions and cytotoxic T lymphocyte activities were detected through 3H-TdR incorporation and 4-hour 51Cr release assays. Results Compared with plasmid vectors of pCR3.1, HBV gene vaccines could induce strong lymphocyte proliferation reactions and cytotoxic T lymphocyte activities in immunized mice (P<0.05). Immunized mice with CpG ODN showed higher specific cellular responses to HBV than those without CpG ODN (P<0.05). Conclusion CpG ODN can act as adjuvants to enhence cellular immune responses in mice immunized with HBV gene vaccines.
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【Key words】CpG oligodeoxyribonucleotide; Hepatitis B virus; Gene vaccine; Cellular immunity response
有研究表明，细胞免疫应答，包括辅助T细胞(Th)和细胞毒T细胞(CTL)应答，在机体清除乙型肝炎病毒(HBV)的过程中发挥重要作用[1]。HBV基因疫苗，由于其可诱导机体产生较强且持久的细胞免疫应答，可能具有治疗乙型肝炎的作用。采用佐剂等措施，促进HBV基因疫苗诱导产生更强的细胞免疫应答，可能将增强其治疗效应。最近研究发现，含CpG基序(motif)的寡核苷酸(ODN)具有较强的Th1型免疫佐剂作用[2，3]。为此，我们合成了一段含CpG基序的ODN，构建了编码HBV S蛋白的基因疫苗pCR3.1-S，观察了CpG ODN对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。
材料和方法
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一、材料
(一) 细胞系和实验动物 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0、人肝癌细胞(HHCC)系为本室保存。实验动物采用雌性Balb/c小鼠，6～8周龄，第四军医大学实验动物中心提供。
(二) 质粒和宿主菌 真核表达质粒载体pCR3.1(Invitrogen公司)；含编码adw亚型HBsAg基因s的重组质粒pCR3.1-S，由姚志强教授在比利时鲁汶大学构建；宿主菌JM 109由本室李谨革博士惠赠。
(三) 主要试剂 RPMI-1640培养剂(Sigma公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；lipofectamine转染试剂(Gibco公司)；G418、HBsAg纯抗原(北京原平生物技术公司)；链霉素-卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒、小鼠抗-HBs(武汉博士德生物工程有限公司)；3H-TdR(中国原子能科学研究院同位素研究所)；Na251CrO4(美国杜邦公司)；ODN 5′-TCAACGTT-3′和5′-TCAAGCTT-3′(上海生物工程公司合成)。
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二、方法
(一) 重组质粒的构建 以计算机设计聚合酶链反应(PCR)引物，从HBV感染者血清(adw亚型)中扩增HBV S基因序列；以T-A克隆法将其插入真核表达载体pCR3.1；酶切、电泳鉴定含正向插入S基因片段的重组质粒，命名其为pCR3.1-S。
(二) 重组质粒的细胞表达 以脂质体lipofectamine介导基因转移，将重组质粒与空载体质粒分别转染细胞系Sp2/0、HHCC系。转染48～72 h后，1∶4～1∶8传代并以含G418培养基筛选。不同时间点收获转染细胞并以Western blot法检测HBsAg蛋白的表达。另取不同转染时间点的HHCC制作细胞爬片，以免疫组织化学染色法检测HBsAg蛋白的表达。
(三) CpG ODN的合成 Krieg等[4]曾报道，ODN 5′-TCAACGTT-3′(CpG ODN,含CpG motif “AACGTT”)可在体外诱导小鼠B淋巴增殖及分泌免疫球蛋白等，而ODN 5′-TCAAGCTT-3′(非CpG ODN)无此效应。由此，我们选择合成了这两段ODN分别作为免疫佐剂和对照剂。而且，为增强其核酸酶抗性，对其进行了硫代磷酸骨架修饰。
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(四) 免疫接种 按常规方法大量制备重组质粒，聚乙二醇(PEG)纯化，以无菌生理盐水溶解质粒并测定A比值达1.8～2.0。将Balb/c小鼠随机分组，每组小鼠5只。以0.5%盐酸布比卡因、0.1%对羟基苯甲酸甲酯(生理盐水为溶剂)处理小鼠股四头肌[5]。24 h后，以100 μg重组质粒接种处理后肌肉，分别以生理盐水、寡核苷酸5′-TCAACGTT-3′(50 μg*只-1*次-1)、寡核苷酸5′-TCAAGCTT-3′(50 μg*只-1*次-1)作为免疫佐剂。间隔两周加强注射，共接种2次。
(五) 淋巴细胞增殖反应的检测 采用3H-TdR掺入法。2次接种后约1周，取免疫小鼠脾细胞，以含10%小牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基调细胞浓度至1～5×109/L，100 μl/孔加入96孔培养板。培养4～6 h后，分别加入10～30 μg/ml纯HBsAg至总体积达200 μl/孔。72 h时每孔加入0.5 μCi 3H-TdR，继续培养12～18 h。以多头细胞收集仪将细胞收获于“9999”型玻璃纤维滤膜上，红外线烤箱烤干后以β计数仪(Backman公司)液闪计数。增殖水平以刺激指数(Stimulation Index,SI)表示，SI=(实验组cpm-仪器本底)/(对照组cpm-仪器本底)。
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(六) 淋巴细胞杀伤效应的检测 采用51Cr 4 h释放法。以重组质粒pCR3.1-S转染Sp2/0细胞(遗传背景H-2d,与Balb/c小鼠遗传背景相同)制备HBV特异性靶细胞。取0.5 ml以G418筛选1～2周的重组质粒转染Sp2/0(浓度2×109/L)细胞，加入100 μCi Na251CrO4温育2～3 h进行标记，其间每15～20 min轻摇1次。标记结束后，洗涤并调细胞浓度为1×108/L，以其作为靶细胞。另取免疫小鼠脾细胞为效应细胞。将靶细胞和效应细胞各100 μl/孔加入96孔培养板(效靶比1∶50)，最大释放组及自然释放组分别加入1% Triton-X 100和靶细胞、RPMI-1640完全培养基和靶细胞各200 μl/孔。继续培养4 h后，取上清100 μl，γ免疫计数仪计数(FJ-2008型，西安国营226厂)。特异性杀伤率(%)=(实验组cpm-自然释放组cpm)/(最大释放组cpm-自然释放组cpm)×100%。
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结果
一、重组质粒的鉴定
质粒载体pCR3.1分子大小为5.0 kb，以CMV IE(cytomegalovirus immediate-early)为启动子。分析其多克隆位点并参照HBV s基因序列酶切图谱，重组质粒pCR3.1-S以Xbal酶切可获得621 bp片段，以HindⅢ酶切可获得122 bp片段，鉴定结果与理论推测基本一致。
二、重组质粒的细胞表达
分别以Western blot法、SABC免疫组化染色法检测Sp2/0转染细胞、HHCC转染细胞发现，重组质粒pCR3.1-S组转染细胞可表达一定量的HBsAg蛋白，而空质粒载体转染组细胞则不能。
三、重组质粒诱导的细胞免疫应答
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与空质粒载体接种组小鼠相比较，100 μg重组质粒免疫组小鼠脾淋巴细胞，体外经HBsAg蛋白刺激后增殖明显(P<0.05);51Cr 4 h释放法测定其体外杀伤功能亦显示对HBV特异靶细胞的杀伤效应明显(P<0.05)，见表1。
表1 不同免疫组小鼠的细胞免疫应答比较(
±s) 组别淋巴细胞增殖反应
(刺激指数)
淋巴细胞杀伤效应
(杀伤率%)
pCR3.1
1.08±0.26
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18.5±3.0
pCR3.1-S+生理盐水
4.65±1.24*
60.2±8.6*
pCR3.1-S+非CpG ODN
5.27±1.83* *
58.6±6.5* *
pCR3.1-S+CpG ODN
8.64±2.51* * *
75.4±10.2* * *
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t检验：*P<0.05、* *P<0.05，与pCR3.1免疫对照组；* *P>0.05，与生理盐水佐剂组；* * *P<0.05，与生理盐水佐剂组、非CpG ODN佐剂组
四、CpG ODN对细胞免疫应答产生的影响
与应用生理盐水作为对照佐剂相比较，非CpG ODN作为佐剂组，重组质粒免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应增强，淋巴细胞杀伤活性减弱，但统计学分析，两者差异无显著性(P>0.05)；CpG ODN作为佐剂组，重组质粒免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应及杀伤效应均明显增强(P<0.05)。另外，CpG ODN作为佐剂组与非CpG ODN作为佐剂组相比较，重组质粒诱导小鼠产生的淋巴细胞增殖反应及杀伤效应差异均有显著性(P<0.05，表1)。结果提示：CpG ODN作为佐剂可促进HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生的细胞免疫应答，其佐剂效应主要由于CpG基序的存在。
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讨论
基因免疫是近年发展迅速的一种新兴免疫策略。它是指构建携带目的抗原基因的重组真核表达载体，以各种方式将其导入体内，使之在机体细胞内持续表达具有天然构象的抗原蛋白，从而诱导机体产生抗原特异的体液和细胞免疫应答。与常规蛋白质疫苗等相比较，基因疫苗尤其可诱导产生较强的细胞免疫应答，故有望用于慢性病毒性感染如乙型肝炎的治疗。Moncini等[6]以HBV基因疫苗免疫HBsAg转基因小鼠，结果发现，转基因小鼠血循环中HBsAg滴度明显下降，且抗-HBs出现阳转，有些小鼠甚至HBsAg完全被清除。在本实验中，我们构建了编码HBV s蛋白的重组质粒pCR3.1-S，以其作为HBV基因疫苗免疫接种Balb/c小鼠，结果免疫小鼠产生了较好的免疫应答[7，8]。而且，我们尝试应用CpG ODN作为佐剂，观察其对重组质粒pCR3.1-S诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响，目的是为基因疫苗诱导机体获得更强的细胞免疫应答寻找途径，从而为HBV基因疫苗应用于乙型肝炎的治疗奠定基础。
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CpG ODN是指含有CpG基序(以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤为基元构成的特定核苷酸序列结构)的ODN。近期研究显示，CpG ODN作为佐剂，可明显促进Th1型免疫应答的产生[2，3]。其与不完全弗氏佐剂(IFA)联合应用时，其效应甚至强于完全弗氏佐剂(CFA)。即使与Th2型佐剂如氢氧化铝合用亦可明显促进免疫应答的产生，且Th1型应答明显强于Th2型应答。本实验中，我们以CpG ODN(5′-TCAACGTT-3′)作为重组质粒pCR3.1-S的佐剂，结果，免疫小鼠的抗-HBs应答、淋巴细胞增殖反应和淋巴细胞杀伤效应明显增强，其佐剂效应主要由于CpG基序的存在，提示CpG ODN可促进HBV基因疫苗的细胞免疫效应。Porter等[9]以含CpG基序的质粒DNA与登革热基因疫苗共注射动物，结果基因疫苗的免疫效应明显增强。Sato等[10]亦报道，CpG ODN与基因疫苗共同注射可促进基因疫苗的免疫效应。我们的研究结果与这些报道相一致。CpG ODN的佐剂作用可能与其可激活多种免疫细胞，诱生多种细胞因子，尤其可调节免疫应答向Th1亚型转换等免疫学效应有关。
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本课题获国家自然科学基金资助(39770665)
参考文献
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3，Davis HL, Weeratna R, Waldschmidt TJ, et al. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with he-patitis B surface antigen. J Immunol, 1998,160:870-876.
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6，Moncini M, Hadchouel M, Davis HL, et al. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:12496-12501.
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7，李文波，周永兴，姚志强，等.乙型肝炎病毒基因疫苗免疫小鼠的初步研究.陕西医学杂志，1999，28：125-126.
8，李文波，姚志强，周永兴，等.白细胞介素2作为乙型肝炎病毒基因疫苗佐剂的效应.细胞与分子免疫学杂志，1999，15:55-56.
9，Porter KR, Kochel TJ, Raviprakask K, et al. Protective efficacy of a dengue 2 DNA vaccine in mice and effect of CpG immunostimulatory motifs on antibody responses. Arch Virol, 1998,143:997-1003.
10，Sato Y, Roman M, Tighe H, et al. Immunostimulatory DNA sequences for effective intradermal gene immunization. Science, 1996,273:352-354.
收稿日期：1999-09-18, 百拇医药