腺相关病毒和人γ-干扰素基因重组体转染淋巴细胞的研究
作者：朱海红 陈智 章明太 姚航平 丁列明
单位：朱海红 陈智 章明太 姚航平(310003 杭州，浙江大学医学院附属一院传染病研究所)；丁列明(美国阿肯萨斯大学病理系)
关键词：基因疗法；干扰素γ；腺相关病毒；淋巴细胞
中华传染病杂志000201 【摘要】 目的 观察腺相关病毒和人γ-干扰素的重组体pWIG转染淋巴细胞及在细胞内表达情况。方法 将pWIG以DNA-磷酸钙共沉淀法转染人淋巴细胞株H9，再分别用聚合酶链反应(PCR)、逆转录-PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法在DNA、RNA和蛋白质水平研究该重组体导入细胞和在细胞内表达的情况。结果 转染pWIG的H9细胞的DNA和RNA经PCR和RT-PCR检测均有504 bp的DNA条带；用ELISA可测出γ-干扰素的表达量为17.2 pg/3×106细胞。结论 重组体pWIG用DNA-磷酸钙共沉淀法导入细胞后，转录HuIFN-γ mRNA，并翻译人γ-干扰素蛋白。为基因治疗的进一步研究打下基础。
, http://www.100md.com
Transfection and expression of the recombinant adeno-associated virus carrying human interferon-γ in human lymphocyte
ZHU Haihong, CHEN Zhi, ZHANG Mingtai, et al.
(Institute of Infectious Diseases,the First Affiliated Hospital,Medical college of Zhejiang University,Hangzhou 310003, China)
【Abstract】 Objective In order to study the transfection and expression of the recombinant pWIG of Adeno-associated virus and Human interferon-γ(HuIFN-γ) in human lymphocyte.Methods After transfecting pWIG into human lymphocyte via calcium phosphate, DNA, RNA and protein extracted from transfected cells were detected by polymerase chain reaction(PCR), reverse transcription PCR(RT-PCR) and ELISA. Results The 504 bp bands were detected from PCR and RT-PCR products of the DNA and RNA from the cells transfected, and HuIFN-γ protein were detected to be 17.2 pg/3×106 cells by ELISA.Conclusion The recombinant pWIG could produce HuIFN-γ mRNA after the transfection via calcium phosphate, and translate corresponding protein further. This lays ground for the further research of gene therapy.
, 百拇医药
【Key words】Gene therapy; Interferon γ; Adeno-associated virus; Lymphocyte
腺相关病毒(AAV)是目前基因治疗的常用载体系统之一。因其具有稳定表达、定点整合、安全性较高等优点而受到重视。我们在以往工作的基础上[1]，将已构建成功的腺相关病毒和人γ-干扰素(HuIFN-γ)基因的重组体pWIG转染源于人淋巴细胞的H9细胞株，在DNA、RNA、及蛋白水平探讨其表达状态。
材料和方法
一、材料
(一)DNA质粒和细胞株 pwp19载体由美国阿肯萨斯大学提供，为带有腺相关病毒末端反向重复序列的真核表达载体，详细资料参见文献[2]。重组体pWIG为本研究小组构建，是腺相关病毒载体pwp19和包含信号肽的HuIFN-γ的编码区cDNA的重组体。pGEM-1-IFN-γ质粒内带有人IFN-γ cDNA全基因，由军事医学科学院提供。H9细胞株：是本所长期保存的传代细胞株，为有缺陷的CD4+ T淋巴细胞株。
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(二)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和PCR试剂 M-MLV逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs混合液等均购自美国Gibco BRL公司。Hu-IFN-γ引物是根据Devos等[3]的报道合成，其扩增产物为含信号肽的504 bp HuIFN-γ编码区cDNA，由美国Gibco BRL公司合成。上游引物：5′-GCATGAAATATACAAGTTATATCTTGG-3′，下游引物：5′-ATTTACTGGGATGCTCTTCGACC-TC-3′。Oligo(dT)15：购自美国Promega公司。
(三)HuIFN-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂 购自晶美生物工程公司(美国Genzyme公司进口分装)。
(四)培养基试剂 RPMI 1640和Hepes粉剂购自美国Gibco BRL公司；超级小牛血清购自浙江杭州四季青生物制品研究所，按说明书配制。
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(五)其他试剂 Trizol Reagent购自美国Gibco BRL公司；DNA酶Ⅰ(RNase-free)购自德国宝灵曼公司。
二、方法
(一)重组体转染H9细胞 用DNA-磷酸钙共沉淀法。首先将大量扩增后的重组体pWIG制成DNA-磷酸钙悬液，静置0.5 h后重悬3×106个H9细胞，置于CO2培养箱内0.5 h后加入含10%小牛血清的1×RPMI 1640，参照文献[4]进行。12 h后更换培养液，60 h后收获细胞。
(二)3组对照细胞的设立 1.转染pwp19的细胞；2.经磷酸钙悬液处理的细胞(不含质粒DNA)；3.未处理细胞。
(三)细胞收获 保留细胞培养上清。用生理盐水洗涤细胞4次后收集细胞，并保留最后1次的细胞洗涤液。同时以Trizol连续抽提实验组和对照组细胞内总RNA、DNA和蛋白质，按照产品说明书进行操作。
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(四)PCR检测重组体导入细胞内情况 实验组和对照组细胞内抽提出的DNA以及细胞洗涤液直接用HuIFN-γ引物作PCR。程序为：94℃变性1 min,55℃退火40 s，72℃延伸40 s，三步为一个循环，共35个循环，最后72℃延伸18 min。具体操作参照文献[4]。
(五)RT-PCR检测重组体在细胞内mRNA的表达情况 实验组和对照组细胞内抽提出的总RNA经DNase Ⅰ消化后，以Oligo(dT)15作为逆转录反应的引物，37℃水浴1 h后以HuIFN-γ引物作PCR，反应程序同前。具体操作参照文献[4]。
(六)ELISA检测细胞内HuIFN-γ蛋白的表达情况 实验组和对照组细胞的培养上清和细胞内抽提的蛋白质，按检测试剂盒说明书进行检测。
结果
一、PCR检测重组体导入细胞内情况
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经pWIG转染的细胞DNA扩增出504 bp条带，三组对照细胞的DNA和细胞洗涤液均未扩增出504 bp条带，见图1。说明pWIG已成功导入H9细胞内。
1.pGEM-1-IFN-γ的PCR产物(504 bp)；
2.100 bp ladder(Promega公司)；
3.洗涤细胞的0.9% NaCl的PCR产物；
4.转染pWIG细胞的DNA的PCR产物(504 bp)；
5.转染pwp19细胞的DNA的PCR产物；
6.磷酸钙处理细胞的DNA的PCR产物；
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7.未处理细胞的DNA的PCR产物
图1 细胞内抽提DNA的PCR结果
1.转染pwp19细胞总RNA的RT-PCR产物；
2.磷酸钙处理细胞总RNA的RT-PCR产物；
3.未处理细胞总RNA的RT-PCR产物；
4.水作空白对照；
5.转染pWIG细胞总RNA的RT-PCR产物(504 bp)；
6.pGEM-1-IFN-γ的PCR产物(504 bp)；
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7.100 bp ladder(Promega公司)
图2 细胞内抽提总RNA的RT-PCR结果
二、RT-PCR检测重组体在细胞内的mRNA表达情况
经pWIG转染的细胞总RNA以Oligo(dT)15作引物进行逆转录扩增出504 bp条带，3组对照细胞的总RNA均未扩增出任何条带，见图2。提示pWIG在细胞内已成功表达出HuIFN-γ mRNA，且其3′末端带有polyA。
三、ELISA检测细胞内HuIFN-γ蛋白的表达情况
转染pWIG的细胞：3×106细胞抽提出的蛋白中检测出17.2 pg HuIFN-γ蛋白，培养上清中未测到HuIFN-γ蛋白。
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3组对照细胞：培养上清和细胞内抽提的蛋白中均未检测到HuIFN-γ蛋白。提示转染pWIG的细胞有HuIFN-γ蛋白表达，而对照组细胞则未检测到。
讨论
目的基因和靶细胞的选择和获得以及基因转移方式的选择均是基因治疗的重要问题。以病毒载体介导为主的生物学方法是目前常用的基因转移方式之一。在各种病毒载体系统中AAV载体系统因安全性相对较高[5]、潜伏感染人体时可以特异地整合到宿主细胞的19号染色体上[6]、外源基因可以长期稳定表达[7]、分裂期细胞和静止期细胞均能被感染等优点[8]引起人们的重视。γ-干扰素作为一种重要的细胞因子，具有较高的抗肿瘤和抗肝纤维化活性，已在临床广泛应用。肝脏疾病基因治疗的靶细胞，常选择外周血淋巴细胞(PBL)、肝癌组织中的肿瘤浸润性淋巴细胞、肝细胞及肝癌细胞等。其中外周血淋巴细胞易从体内取出、分离；回输方便；体外在白细胞介素-2刺激下可进行培养和扩增；可有效地被外源基因转导，并可耐受筛选过程的操作；回输人体后，能继续存活且具有生物学功能[9]。因此本研究采用PBL作为靶细胞。
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利用基因治疗的方法在真核细胞内表达的γ-干扰素，其空间结构比重组蛋白更接近天然干扰素，且具有局部浓度高、分泌到细胞外可发挥旁分泌功能等优点，从而可发挥更强的生物学效应。本研究在先前工作的基础上，将已构建好的重组体pWIG转染淋巴细胞，收获细胞后分别用PCR、RT-PCR和ELISA等方法从DNA、RNA和蛋白水平研究重组体导入细胞和在细胞内表达情况。
pWIG转染H9细胞时，设立3组对照：第一组为pwp19转染的H9细胞；第二组为不含有质粒DNA的磷酸钙处理的H9细胞；第三组为未作任何处理的细胞。结果提示转染pwp19载体、磷酸钙处理以及普通的体外培养条件均不能促使H9细胞产生HuIFN-γ。实验组的结果提示重组体pWIG以DNA-磷酸钙共沉淀法导入细胞后，可有效地转录HuIFN-γ mRNA，并表达HuIFN-γ蛋白，但产量较低。理论上，带有信号肽的细胞因子可以通过细胞膜分泌到细胞外，发挥其旁分泌的功能。我们构建的重组体中的HuIFN-γ基因含有信号肽的全编码区，上清中未检测到HuIFN-γ蛋白，可能是由于该蛋白分泌到细胞外后被培养基稀释，浓度低于试剂盒的检测灵敏度所致。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目(39570653)
参考文献
1，陈智，朱海红，章明太，等.腺相关病毒和人γ-干扰素基因重组体的构建.中国学术期刊文摘，1998，4：1259-1260.
2，Nahreini P, Woody MJ, Zhou SZ, et al. Versatile adeno-associated virus 2-based vectors for constructing recombinant virions. Gene, 1993,124:257-262.
3，Devos R, Cheroutre H, Taya Y, et al. Molecular cloning of human immune interferon cDNA and its expression in eukaryotic cells. Nucleic Acids Res, 1982,10:2487-2501.
, 百拇医药
4，Sambrook J, Fristch EF, Maniatis J. Moecular cloning laboratory mannual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
5，Marshall E. Gene therapy's growing pains. Science, 1995,269:1050-1055.
6，Goldspiel BR, Green L, Calis KA, et al. Human gene therapy. Clin Pharm, 1993,12:488-505.
7，Flotte TR, Afione SA, Conrad C, et al. Stable in vivo expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator with an adeno-associated virus vector. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90:10613-10617.
, 百拇医药
8，Halbert CL, Alexander IE, Wolgamot GM. Adeno-associated virus vectors transduce primary cells much less efficiently than immortalized cells. J Virol, 1995,69:1473-1479.
9，Culver K, Cornetta K, Morgan R, et al. Lymphocytes as cellular vehicles for gene therapy in mouse and man. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:3155-3159.
收稿日期：1999-06-24, http://www.100md.com
单位：朱海红 陈智 章明太 姚航平(310003 杭州，浙江大学医学院附属一院传染病研究所)；丁列明(美国阿肯萨斯大学病理系)
关键词：基因疗法；干扰素γ；腺相关病毒；淋巴细胞
中华传染病杂志000201 【摘要】 目的 观察腺相关病毒和人γ-干扰素的重组体pWIG转染淋巴细胞及在细胞内表达情况。方法 将pWIG以DNA-磷酸钙共沉淀法转染人淋巴细胞株H9，再分别用聚合酶链反应(PCR)、逆转录-PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法在DNA、RNA和蛋白质水平研究该重组体导入细胞和在细胞内表达的情况。结果 转染pWIG的H9细胞的DNA和RNA经PCR和RT-PCR检测均有504 bp的DNA条带；用ELISA可测出γ-干扰素的表达量为17.2 pg/3×106细胞。结论 重组体pWIG用DNA-磷酸钙共沉淀法导入细胞后，转录HuIFN-γ mRNA，并翻译人γ-干扰素蛋白。为基因治疗的进一步研究打下基础。
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Transfection and expression of the recombinant adeno-associated virus carrying human interferon-γ in human lymphocyte
ZHU Haihong, CHEN Zhi, ZHANG Mingtai, et al.
(Institute of Infectious Diseases,the First Affiliated Hospital,Medical college of Zhejiang University,Hangzhou 310003, China)
【Abstract】 Objective In order to study the transfection and expression of the recombinant pWIG of Adeno-associated virus and Human interferon-γ(HuIFN-γ) in human lymphocyte.Methods After transfecting pWIG into human lymphocyte via calcium phosphate, DNA, RNA and protein extracted from transfected cells were detected by polymerase chain reaction(PCR), reverse transcription PCR(RT-PCR) and ELISA. Results The 504 bp bands were detected from PCR and RT-PCR products of the DNA and RNA from the cells transfected, and HuIFN-γ protein were detected to be 17.2 pg/3×106 cells by ELISA.Conclusion The recombinant pWIG could produce HuIFN-γ mRNA after the transfection via calcium phosphate, and translate corresponding protein further. This lays ground for the further research of gene therapy.
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【Key words】Gene therapy; Interferon γ; Adeno-associated virus; Lymphocyte
腺相关病毒(AAV)是目前基因治疗的常用载体系统之一。因其具有稳定表达、定点整合、安全性较高等优点而受到重视。我们在以往工作的基础上[1]，将已构建成功的腺相关病毒和人γ-干扰素(HuIFN-γ)基因的重组体pWIG转染源于人淋巴细胞的H9细胞株，在DNA、RNA、及蛋白水平探讨其表达状态。
材料和方法
一、材料
(一)DNA质粒和细胞株 pwp19载体由美国阿肯萨斯大学提供，为带有腺相关病毒末端反向重复序列的真核表达载体，详细资料参见文献[2]。重组体pWIG为本研究小组构建，是腺相关病毒载体pwp19和包含信号肽的HuIFN-γ的编码区cDNA的重组体。pGEM-1-IFN-γ质粒内带有人IFN-γ cDNA全基因，由军事医学科学院提供。H9细胞株：是本所长期保存的传代细胞株，为有缺陷的CD4+ T淋巴细胞株。
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(二)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和PCR试剂 M-MLV逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs混合液等均购自美国Gibco BRL公司。Hu-IFN-γ引物是根据Devos等[3]的报道合成，其扩增产物为含信号肽的504 bp HuIFN-γ编码区cDNA，由美国Gibco BRL公司合成。上游引物：5′-GCATGAAATATACAAGTTATATCTTGG-3′，下游引物：5′-ATTTACTGGGATGCTCTTCGACC-TC-3′。Oligo(dT)15：购自美国Promega公司。
(三)HuIFN-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂 购自晶美生物工程公司(美国Genzyme公司进口分装)。
(四)培养基试剂 RPMI 1640和Hepes粉剂购自美国Gibco BRL公司；超级小牛血清购自浙江杭州四季青生物制品研究所，按说明书配制。
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(五)其他试剂 Trizol Reagent购自美国Gibco BRL公司；DNA酶Ⅰ(RNase-free)购自德国宝灵曼公司。
二、方法
(一)重组体转染H9细胞 用DNA-磷酸钙共沉淀法。首先将大量扩增后的重组体pWIG制成DNA-磷酸钙悬液，静置0.5 h后重悬3×106个H9细胞，置于CO2培养箱内0.5 h后加入含10%小牛血清的1×RPMI 1640，参照文献[4]进行。12 h后更换培养液，60 h后收获细胞。
(二)3组对照细胞的设立 1.转染pwp19的细胞；2.经磷酸钙悬液处理的细胞(不含质粒DNA)；3.未处理细胞。
(三)细胞收获 保留细胞培养上清。用生理盐水洗涤细胞4次后收集细胞，并保留最后1次的细胞洗涤液。同时以Trizol连续抽提实验组和对照组细胞内总RNA、DNA和蛋白质，按照产品说明书进行操作。
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(四)PCR检测重组体导入细胞内情况 实验组和对照组细胞内抽提出的DNA以及细胞洗涤液直接用HuIFN-γ引物作PCR。程序为：94℃变性1 min,55℃退火40 s，72℃延伸40 s，三步为一个循环，共35个循环，最后72℃延伸18 min。具体操作参照文献[4]。
(五)RT-PCR检测重组体在细胞内mRNA的表达情况 实验组和对照组细胞内抽提出的总RNA经DNase Ⅰ消化后，以Oligo(dT)15作为逆转录反应的引物，37℃水浴1 h后以HuIFN-γ引物作PCR，反应程序同前。具体操作参照文献[4]。
(六)ELISA检测细胞内HuIFN-γ蛋白的表达情况 实验组和对照组细胞的培养上清和细胞内抽提的蛋白质，按检测试剂盒说明书进行检测。
结果
一、PCR检测重组体导入细胞内情况
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经pWIG转染的细胞DNA扩增出504 bp条带，三组对照细胞的DNA和细胞洗涤液均未扩增出504 bp条带，见图1。说明pWIG已成功导入H9细胞内。
1.pGEM-1-IFN-γ的PCR产物(504 bp)；
2.100 bp ladder(Promega公司)；
3.洗涤细胞的0.9% NaCl的PCR产物；
4.转染pWIG细胞的DNA的PCR产物(504 bp)；
5.转染pwp19细胞的DNA的PCR产物；
6.磷酸钙处理细胞的DNA的PCR产物；
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7.未处理细胞的DNA的PCR产物
图1 细胞内抽提DNA的PCR结果
1.转染pwp19细胞总RNA的RT-PCR产物；
2.磷酸钙处理细胞总RNA的RT-PCR产物；
3.未处理细胞总RNA的RT-PCR产物；
4.水作空白对照；
5.转染pWIG细胞总RNA的RT-PCR产物(504 bp)；
6.pGEM-1-IFN-γ的PCR产物(504 bp)；
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7.100 bp ladder(Promega公司)
图2 细胞内抽提总RNA的RT-PCR结果
二、RT-PCR检测重组体在细胞内的mRNA表达情况
经pWIG转染的细胞总RNA以Oligo(dT)15作引物进行逆转录扩增出504 bp条带，3组对照细胞的总RNA均未扩增出任何条带，见图2。提示pWIG在细胞内已成功表达出HuIFN-γ mRNA，且其3′末端带有polyA。
三、ELISA检测细胞内HuIFN-γ蛋白的表达情况
转染pWIG的细胞：3×106细胞抽提出的蛋白中检测出17.2 pg HuIFN-γ蛋白，培养上清中未测到HuIFN-γ蛋白。
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3组对照细胞：培养上清和细胞内抽提的蛋白中均未检测到HuIFN-γ蛋白。提示转染pWIG的细胞有HuIFN-γ蛋白表达，而对照组细胞则未检测到。
讨论
目的基因和靶细胞的选择和获得以及基因转移方式的选择均是基因治疗的重要问题。以病毒载体介导为主的生物学方法是目前常用的基因转移方式之一。在各种病毒载体系统中AAV载体系统因安全性相对较高[5]、潜伏感染人体时可以特异地整合到宿主细胞的19号染色体上[6]、外源基因可以长期稳定表达[7]、分裂期细胞和静止期细胞均能被感染等优点[8]引起人们的重视。γ-干扰素作为一种重要的细胞因子，具有较高的抗肿瘤和抗肝纤维化活性，已在临床广泛应用。肝脏疾病基因治疗的靶细胞，常选择外周血淋巴细胞(PBL)、肝癌组织中的肿瘤浸润性淋巴细胞、肝细胞及肝癌细胞等。其中外周血淋巴细胞易从体内取出、分离；回输方便；体外在白细胞介素-2刺激下可进行培养和扩增；可有效地被外源基因转导，并可耐受筛选过程的操作；回输人体后，能继续存活且具有生物学功能[9]。因此本研究采用PBL作为靶细胞。
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利用基因治疗的方法在真核细胞内表达的γ-干扰素，其空间结构比重组蛋白更接近天然干扰素，且具有局部浓度高、分泌到细胞外可发挥旁分泌功能等优点，从而可发挥更强的生物学效应。本研究在先前工作的基础上，将已构建好的重组体pWIG转染淋巴细胞，收获细胞后分别用PCR、RT-PCR和ELISA等方法从DNA、RNA和蛋白水平研究重组体导入细胞和在细胞内表达情况。
pWIG转染H9细胞时，设立3组对照：第一组为pwp19转染的H9细胞；第二组为不含有质粒DNA的磷酸钙处理的H9细胞；第三组为未作任何处理的细胞。结果提示转染pwp19载体、磷酸钙处理以及普通的体外培养条件均不能促使H9细胞产生HuIFN-γ。实验组的结果提示重组体pWIG以DNA-磷酸钙共沉淀法导入细胞后，可有效地转录HuIFN-γ mRNA，并表达HuIFN-γ蛋白，但产量较低。理论上，带有信号肽的细胞因子可以通过细胞膜分泌到细胞外，发挥其旁分泌的功能。我们构建的重组体中的HuIFN-γ基因含有信号肽的全编码区，上清中未检测到HuIFN-γ蛋白，可能是由于该蛋白分泌到细胞外后被培养基稀释，浓度低于试剂盒的检测灵敏度所致。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(39570653)
参考文献
1，陈智，朱海红，章明太，等.腺相关病毒和人γ-干扰素基因重组体的构建.中国学术期刊文摘，1998，4：1259-1260.
2，Nahreini P, Woody MJ, Zhou SZ, et al. Versatile adeno-associated virus 2-based vectors for constructing recombinant virions. Gene, 1993,124:257-262.
3，Devos R, Cheroutre H, Taya Y, et al. Molecular cloning of human immune interferon cDNA and its expression in eukaryotic cells. Nucleic Acids Res, 1982,10:2487-2501.
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4，Sambrook J, Fristch EF, Maniatis J. Moecular cloning laboratory mannual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
5，Marshall E. Gene therapy's growing pains. Science, 1995,269:1050-1055.
6，Goldspiel BR, Green L, Calis KA, et al. Human gene therapy. Clin Pharm, 1993,12:488-505.
7，Flotte TR, Afione SA, Conrad C, et al. Stable in vivo expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator with an adeno-associated virus vector. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90:10613-10617.
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8，Halbert CL, Alexander IE, Wolgamot GM. Adeno-associated virus vectors transduce primary cells much less efficiently than immortalized cells. J Virol, 1995,69:1473-1479.
9，Culver K, Cornetta K, Morgan R, et al. Lymphocytes as cellular vehicles for gene therapy in mouse and man. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:3155-3159.
收稿日期：1999-06-24, http://www.100md.com