BMP2在成釉细胞瘤中的表达及成熟肽片断的基因克隆
作者：岳文 杨连甲 朱峰 晏伟 金岩 董绍忠
单位：岳文 杨连甲 金岩 董绍忠(第四军医大学口腔医学院病理科，西安，710031)；朱峰 晏伟(生化及分子生物学教研室)
关键词：
中华口腔医学杂志000229 成釉细胞瘤是较常见的一种牙源性的肿瘤，目前普遍认为其来源于胚胎发育时期的成釉器，肿瘤性的成釉上皮过度增生且失去其诱导硬组织形成的活性。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)在牙胚成釉器中有较高表达并诱导间充质细胞向成釉上皮分化，是牙釉质和牙本质形成过程中的重要因素之一。我们检测了成釉细胞瘤中的BMP的表达及作用，研究成釉细胞瘤丧失其成骨性的病理发生机制。
一、材料和方法
1.标本来源：16例标本来源于第四军医大学口腔医学院手术切除标本。取有BMP表达和BMP2 mRNA扩增的3例成釉细胞瘤和2例骨肉瘤组织，提取其RNA。
, 百拇医药
2.免疫组化：bBMP-MCAb由本实验室制备,常规免疫组化方法染色。
3.原位杂交：重组质粒PSP64-BMP2(含有1.58 kb的BMP2 cDNA片段)由美国基因研究所Dr Wozney 馈赠。地高辛标记检测试剂盒(德国 Boehringer Mannheim 公司)随机引物法标记探针。常规原位杂交操作步骤。
4.RT-PCR反应：异硫氰酸胍方法提取成釉细胞瘤及骨肉瘤组织中的RNA，常规反转录，用针对BMP2的成熟肽片段设计两条引物进行PCR，反应条件为 95℃，20 s； 60℃, 30 s；72℃, 1 min； 40个循环。
5.PCR产物的克隆、鉴定：PCR反应产物进行T-A克隆，经蓝白筛选，提取质粒后进行PCR鉴定。
6. 对阳性克隆的质粒进行序列测定及计算机分析。
, 百拇医药
二、结果
1.免疫组化检测结果：16例成釉细胞瘤胞浆中均可见BMP阳性反应。牙胚成釉器的内、外釉上皮及星网状细胞可见BMP阳性反应。
2.原位杂交检测结果：16例原位杂交成釉细胞瘤标本及成釉器中均可见阳性杂交信号。滤泡型肿瘤及牙胚成釉器中的柱状上皮层细胞及不规则星网状细胞胞浆中均有BMP2 mRNA的扩增。
3.PCR 产物克隆及其鉴定：3例标本的6个克隆除1例外PCR均出现阳性条带。选择来源于不同病例的3个阳性克隆提取质粒后进行自动测序。
4.计算机分析测定结果：1例成釉细胞瘤组织中的 BMP2 成熟肽片段出现两处基因变异：1 389 bp处 G→A,从而使密码子 GAT→AAT, 但此处突变未造成编码氨基酸 I (异亮氨酸)的改变。另外一处为 1 450 bp处 G→A，密码子 CGA→CAA, 所编码的氨基酸由E(谷氨酸)→K(赖氨酸)。进一步分析表明:该例成釉细胞瘤组织基因变异导致所编码氨基酸发生改变，从而引起相应多肽结构发生变异，影响蛋白质的理化性质。
, http://www.100md.com
三、讨论
本组结果表明，在16例成釉细胞瘤中均可检测到BMP的表达，其范围及强度均类似于其在牙胚成釉器中的表达。这为成釉细胞瘤来源于牙胚的成釉器提供了分子生物学依据。成釉细胞瘤组织中有丰富的BMP蛋白的表达和BMP mRNA的扩增，但瘤组织本身并无硬组织存在。而BMP的最基本的特性就在于可以引起异位骨组织的形成，提示成釉细胞瘤组织中的BMP和牙胚成釉器中的BMP可能存在某些不同，这可能是成釉细胞瘤中无硬组织形成的原因之一。我们选择与肿瘤关系最为密切的BMP2开放读框中编码成熟肽的基因片段作为检测对象，因成熟肽是其生物学性状的决定因素。测序结果发现，1例肿瘤组织BMP2编码成熟肽片段的基因发生了个别碱基的改变，并造成了其编码氨基酸的改变，从而引起其多肽结构和蛋白理化性状的改变，这可能造成BMP蛋白功能的改变,使其诱骨活性丧失。这一结果提示BMP家族的改变可能在成釉细胞瘤的病理机制中发挥重要作用，为探讨成釉细胞瘤的发生、发展机理打下基础。
收稿日期：1999-04-16, 百拇医药
单位：岳文 杨连甲 金岩 董绍忠(第四军医大学口腔医学院病理科，西安，710031)；朱峰 晏伟(生化及分子生物学教研室)
关键词：
中华口腔医学杂志000229 成釉细胞瘤是较常见的一种牙源性的肿瘤，目前普遍认为其来源于胚胎发育时期的成釉器，肿瘤性的成釉上皮过度增生且失去其诱导硬组织形成的活性。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)在牙胚成釉器中有较高表达并诱导间充质细胞向成釉上皮分化，是牙釉质和牙本质形成过程中的重要因素之一。我们检测了成釉细胞瘤中的BMP的表达及作用，研究成釉细胞瘤丧失其成骨性的病理发生机制。
一、材料和方法
1.标本来源：16例标本来源于第四军医大学口腔医学院手术切除标本。取有BMP表达和BMP2 mRNA扩增的3例成釉细胞瘤和2例骨肉瘤组织，提取其RNA。
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2.免疫组化：bBMP-MCAb由本实验室制备,常规免疫组化方法染色。
3.原位杂交：重组质粒PSP64-BMP2(含有1.58 kb的BMP2 cDNA片段)由美国基因研究所Dr Wozney 馈赠。地高辛标记检测试剂盒(德国 Boehringer Mannheim 公司)随机引物法标记探针。常规原位杂交操作步骤。
4.RT-PCR反应：异硫氰酸胍方法提取成釉细胞瘤及骨肉瘤组织中的RNA，常规反转录，用针对BMP2的成熟肽片段设计两条引物进行PCR，反应条件为 95℃，20 s； 60℃, 30 s；72℃, 1 min； 40个循环。
5.PCR产物的克隆、鉴定：PCR反应产物进行T-A克隆，经蓝白筛选，提取质粒后进行PCR鉴定。
6. 对阳性克隆的质粒进行序列测定及计算机分析。
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二、结果
1.免疫组化检测结果：16例成釉细胞瘤胞浆中均可见BMP阳性反应。牙胚成釉器的内、外釉上皮及星网状细胞可见BMP阳性反应。
2.原位杂交检测结果：16例原位杂交成釉细胞瘤标本及成釉器中均可见阳性杂交信号。滤泡型肿瘤及牙胚成釉器中的柱状上皮层细胞及不规则星网状细胞胞浆中均有BMP2 mRNA的扩增。
3.PCR 产物克隆及其鉴定：3例标本的6个克隆除1例外PCR均出现阳性条带。选择来源于不同病例的3个阳性克隆提取质粒后进行自动测序。
4.计算机分析测定结果：1例成釉细胞瘤组织中的 BMP2 成熟肽片段出现两处基因变异：1 389 bp处 G→A,从而使密码子 GAT→AAT, 但此处突变未造成编码氨基酸 I (异亮氨酸)的改变。另外一处为 1 450 bp处 G→A，密码子 CGA→CAA, 所编码的氨基酸由E(谷氨酸)→K(赖氨酸)。进一步分析表明:该例成釉细胞瘤组织基因变异导致所编码氨基酸发生改变，从而引起相应多肽结构发生变异，影响蛋白质的理化性质。
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三、讨论
本组结果表明，在16例成釉细胞瘤中均可检测到BMP的表达，其范围及强度均类似于其在牙胚成釉器中的表达。这为成釉细胞瘤来源于牙胚的成釉器提供了分子生物学依据。成釉细胞瘤组织中有丰富的BMP蛋白的表达和BMP mRNA的扩增，但瘤组织本身并无硬组织存在。而BMP的最基本的特性就在于可以引起异位骨组织的形成，提示成釉细胞瘤组织中的BMP和牙胚成釉器中的BMP可能存在某些不同，这可能是成釉细胞瘤中无硬组织形成的原因之一。我们选择与肿瘤关系最为密切的BMP2开放读框中编码成熟肽的基因片段作为检测对象，因成熟肽是其生物学性状的决定因素。测序结果发现，1例肿瘤组织BMP2编码成熟肽片段的基因发生了个别碱基的改变，并造成了其编码氨基酸的改变，从而引起其多肽结构和蛋白理化性状的改变，这可能造成BMP蛋白功能的改变,使其诱骨活性丧失。这一结果提示BMP家族的改变可能在成釉细胞瘤的病理机制中发挥重要作用，为探讨成釉细胞瘤的发生、发展机理打下基础。
收稿日期：1999-04-16, 百拇医药