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大鼠舌内一氧化氮合酶阳性神经元在伤害性刺激后的形态学变化
作者：邵金贵 忻国妹 杨会杰
单位：芜湖市皖南医学院口腔组织病理学教研室，安微省，241001
关键词：一氧化氮合酶；神经元；舌；大鼠
中华口腔医学杂志000221 【摘要】 目的 探讨大鼠舌内一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)阳性神经元在伤害性刺激后的形态学变化。方法 用NADPH-d 组织化学法，对大鼠舌内NOS阳性神经元在损伤后的形态学变化进行观察。 结果 损伤后舌内NOS阳性神经元胞体明显增大，染色加深，由其发出的阳性神经纤维明显增粗。在舌体、舌尖段NOS阳性神经元胞体附近出现深染的细颗粒状物质，其神经纤维至终末沿途可见到梅花状的NOS阳性结构。在舌根段肌肉组织和腺体周围的NOS阳性神经纤维明显增粗，有的纤维内出现了膨体结构。结论 舌内NOS阳性神经元在伤害性刺激时，一氧化氮(nitric oxide，NO)参与了病理性伤害信息的传递和调控机制。
Noxious stimulation-induced morphological changes of nitric oxide synthase-positive neurons in the tongue of rats
SHAO Jingui, XIN Guomei, YANG Huijie.
(Department of Oral Histopathology, Wannan Medical College, Wuhu， Anhui 241001, China)
【Abstract】 Objective To explore noxious stimulation-induced morphological changes of nitric oxide synthase (NOS)positive neurons in the tongue. Methods The histochemical method of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH)-diaphorase activity was used . Results NOS positive neuron bodies in the tongue were obviously enlarged,the staining intensity increased and nerve fibers became thicker after injury. At the body and tip of the tongue , near the body cells of NOS positive neurons deeply stained fine granular particles were seen , and structures of plum blossom form were seen along the route of the nerve fiber extending all the way to the terminal. NOS positive nerve fibers in the striated muscles and around the gland in the tongue root became thicker, and bead structures were seen in some of the fibers. Conclusion NOS positive neurons of the tongue, when noxi ously stimulated , are inflicted with pathological changes, which suggest that nitric oxide might play a role in the transmission and control of the message related to pathological lesions.
【Key words】 Nitric-oxide synthase； Neurons； Tongue； Rats
一氧化氮(nitric oxide，NO)是以一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)为催化剂，以L- 精氨酸为底物而产生的一种新的神经信息物质[1]，在中枢及外周神经系统中均担负着重要的信号传导任务[2]。许多证据表明，分布在神经系统的还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)就是一氧化氮合酶[3]，硝基四氮唑蓝(NBT)可以显示组织内的NADPH-d阳性细胞定位[4] ，因而可以用NADPH-d组织化学法显示NOS的分布状况，从而确定NO的生成部位。机体对伤害性刺激的防御反应的产生有赖于N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate ，NMDA)受体的激活和NO的生成[5]，NO参与了伤害性信息的中枢处理和调控[6]。为了解舌受到伤害性刺激后舌内NOS阳性神经元结构的变化，我们用NADPH-d组织化学法[7] ，对大鼠舌内NOS阳性神经元在损伤后的形态学变化进行了观察。
材料和方法
1.实验动物:成年Spargue -Dawley纯系大鼠16只，体重180～250 g。
2.分组：共分4组，按给予伤害性刺激的盐酸浓度不同，分为3个实验组(每组4只)及正常对照组(4只)。①实验组：在1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分别用3、5、8 mol/L盐酸涂抹各实验组动物舌背粘膜，2 h后用生理盐水200 ml经心脏冲洗血液，灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH 7.4)300 ml，30 min后取整个舌，分舌尖、舌体(游离段、附着段)和舌根，经上述固定液固定4 h(4℃)，移入15%蔗糖磷酸缓冲液过夜，冰冻切片，片厚30 μm。②对照组：将动物麻醉后，经生理盐水冲洗，4%多聚甲醛PB液灌注固定。取材、固定、切片等方法同上。
3.实验方法：将各组切片分别收集在0.1 mol/L PB液内 (pH 7.5)，进行NADPH-d组化反应。步骤如下：将切片移入0.1 mol/L PB液内 (pH 8.0)，内含0.3% Triton X-100，NBT(上海前进化学试剂厂)1 mol/L和NADPH(W-Germany)1 mol/L。37 ℃孵育15～30 min。然后移入0.01 mol/L PBS液内 (pH 7.4) 终止反应，并漂洗数次，切片裱于涂有明胶的载玻片上，干燥、脱水、透明、封片、光镜观察。
4.NADPH-d染色反应对照实验：①孵育液内不加NADPH-d。②孵育液内不加NBT。③将切片在84℃干燥箱内加热5 min ，使NOS变性以破坏其酶活性。
结果
一、 NOS阳性神经元在舌内的正常分布
NOS阳性神经元和神经纤维主要分布在舌的肌层、结缔组织、血管壁和味腺腺泡周围。其中NOS阳性胞体以舌体游离段和舌根分布较多，舌尖和舌体附着段次之，单个或成群分布，也可聚集在一起形成舌内固有神经节，胞体圆形或椭圆形，形似单极或多极神经元。在NOS阳性神经元胞体突起周围有细颗粒状NOS阳性物质。由胞体发出的NOS阳性神经纤维在舌尖和舌体段为膨体纤维，串珠状明显，有的NOS阳性神经纤维伸入菌状乳头和丝状乳头中轴内，行走于上皮基部。而舌根部NOS阳性神经纤维的膨体不明显，由胞体发出后，行走于肌细胞之间及血管、腺泡周围。在轮廓乳头中轴内和环沟底部周围都有NOS阳性神经元胞体和神经纤维分布。整个舌的血管内皮细胞为NOS阳性着色。
二、 舌背粘膜伤害性刺激后NOS阳性神经元的形态学改变
3 mol/L盐酸刺激舌背粘膜组，舌粘膜有轻度水肿，舌内各段组织中NOS阳性神经元胞体和神经纤维染色加深。使用5 mol/L盐酸刺激舌背粘膜，舌粘膜有明显红肿，舌各段组织内NOS阳性神经元胞体明显增大，染色加深，NOS阳性纤维明显增粗。在舌体和舌尖段NOS阳性神经元胞体突起周围细颗粒状物质染色加深，NOS阳性神经膨体纤维沿途可见类似梅花状的NOS阳性物质，有的神经纤维末端亦可见到相似的NOS阳性物质。在舌根部肌组织和味腺周围等处的NOS阳性神经元胞体明显增大，染色加深，神经纤维增粗，有的神经纤维可见到NOS阳性膨体结构。当盐酸浓度增至8 mol/L时，舌背粘膜红肿更明显，舌内各组织中的NOS阳性神经元胞体和纤维反应结果与盐酸浓度为5 mol/L时相同。实验结果见图1～6。
三、 NADPH-d染色反应对照结果
上述几种对照试验的结果均为阴性。说明本实验的阳性结果是可靠的。
图1 对照组舌体NOS阳性神经元发出的神经纤维为膨体纤维，串珠状明显(↑)(NADPH-d 组化染色×400) 图2 实验组舌体NOS阳性神经元胞体明显增大,染色加深,由胞体发出的神经纤维沿途可见类似梅花状的NOS阳性物质(↑)(NADPH-d 组化染色×400) 图3 对照组舌体NOS阳性神经元发出的膨体纤维(▲)(NADPH-d 组化染色×400) 图4 实验组NOS阳性神经纤维末端出现NOS阳性物质(▲)(NADPH-d 组化染色×400) 图5 对照组舌体NOS阳性神经纤维的体不明显(▲)(NADPH-d 组化染色×400) 图6 实验组舌根肌组织内NOS阳性神经元胞体明显增大,神经纤维出现膨体(▲)(NADPH-d 组化染色×400)
讨论
NOS分布广泛，在中枢或外周神经系统都担负着重要的信号传导任务，参与机体的各种生理代谢过程。在正常情况下，根据NOS阳性神经元胞体及其神经纤维在舌内的分布特征表明，NO可能与舌的血流调节、腺体分泌、舌肌运动和味觉调控有关[8]。
在舌背粘膜受到伤害性刺激时，舌内NOS阳性神经元胞体和神经纤维与正常对照组相比发生明显改变。有证据表明，中枢神经系统中NOS的分布与谷氨酸的NMDA受体的分布一致[9]。伤害感受性反应的强化有赖于NMDA受体的激活和NO的生成[5,6] 。本实验结果显示，从NOS阳性神经元胞体突起周围到神经纤维终末出现了深染的细颗粒状和梅花样物质，这些形态学改变提示在舌内可能与外源性兴奋性氨基酸尤其是谷氨酸增高有关。谷氨酸增高后，主要作用于NMDA受体，开放细胞膜上的离子通道，使钙离子内流，胞浆内钙离子浓度升高，激活NOS而合成过量的NO，从而产生神经毒性作用[10] 。NOS阳性神经元合成过量的NO，必然导致释放增加，从而出现上述形态改变。本实验结果也说明NOS阳性神经元可能参与病理性损害信息的传递和调节机制。
NOS阳性结构在舌损害后的分布位置可以说明NO的释放方式。它与传统的神经递质既有相似之处，又有很大的区别，它可以行使类似神经递质的调节作用，但又不要求特别的释放装置，在缺乏传统的神经递质释放的条件下，根据机体需要也可以从产生的地方扩散到所作用的靶区[2] 。因此，在舌内的NOS阳性神经元不仅具有局部调控作用，而且在其纤维延伸途中及其终末所支配的组织都有信息传递和调节机能。
从舌内NOS阳性神经元在舌损伤后的形态改变特征来看，NOS阳性神经元既可以以神经终末与其他组织发生突触联系，又可以不通过与突触膜受体之间相互作用形成信号传递途径[2]。
国内外文献关于NOS的研究报告多集中在中枢神经系统和其他外周器官，而对舌的损伤尚未见报道。本实验证明在舌损伤时不仅舌粘膜发生变化，而且NOS阳性神经元在形态及染色强度方面均发生了明显的变化，从而可以影响舌的腺体分泌、血流量的调节及味觉的感受等。本实验结果为进一步研究舌损伤的发病机制、病理变化及治疗提供了参考资料。
参考文献：
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收稿日期：1999-01-06