放线共生放线杆菌白细胞毒素水平检测
作者：王者玲 张廷发 肖白 杨圣辉
单位：王者玲 杨圣辉(首都医科大学附属北京口腔医院口腔医学研究所，100050)；张廷发(北京医院口腔科)；肖白(首都医科大学附属朝阳医院分子生物学实验室)
关键词：放线杆菌属；细胞毒素类；牙周炎
中华口腔医学杂志000212 【摘要】 目的 检测放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)临床分离菌株白细胞毒素水平，区分高毒株与低毒株。方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测白细胞毒素操纵子启动子区域基因序列的差异。检测临床菌株68株，其中b型17株，c型42株，a型9株。阳性对照高毒株为JP2，低毒株为ATCC43717等5株Aa国际参考菌株，阴性对照为12株异种菌国际参考菌株。结果 68株临床分离菌株扩增片段均为1 022 bp, JP2扩增片段为492 bp，ATCC43717等5株扩增片段均为1 022 bp，12株异种菌参考菌株无扩增片段出现。结论 68株临床分离菌株全部为低毒株。
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Detecting the level of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin
WANG Zheling
(Research Institute of Stomatology，Beijing Stomatological Hospital，Beijing 100050，China)
ZHANG Tingfa ,XIAO Bai
【Abstract】 Objective To detect the level of Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) leukotoxin and distinguish the highly and the minimally toxic strains. Methods The polymerase chain reaction (PCR) assay was used to detect the difference of the nucleotide sequence of Aa leukotoxic promoter. 68 Aa isolates were examined, including 17 serotype b,42 serotype c and 9 serotype a strains. The positive control strains were the highly toxic strain JP2 and 7 minimally toxic strains such as ATCC43717; the negative control strains were 12 other species of reference strains. Results The PCR fragments of JP2 was about 492 bp and that of the other Aa reference strains and 68 clinical isolates were 1 022 bp. PCR products not found in 12 other species. Conclusion All of the 68 clinical isolates were minimally toxic strains.
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【Key words】 Actinobacillus； Cytotoxins； Periodontitis
放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomy-cetemcomitans, Aa)是重要的可疑牙周致病菌，近年来一直受到牙周病学者的广泛关注。现已发现Aa分泌白细胞毒素,并认为它是Aa的主要致病因子。Aa不同菌株分泌白细胞毒素的水平不同，最早报道与血清型有关, 尤其是b型，b型多存在于青少年牙周炎个体[1]。一般认为b型更易分泌白细胞毒素，具有更强的致病性。我们也对来自不同牙周状况的Aa临床分离菌株进行了血清分型，却发现包括青少年牙周炎在内检出的大部分是c型。随着分子生物学技术的发展，Aa白细胞毒素基因已克隆并测序。有研究报道 Aa白细胞毒素水平的差异与它们的基因结构有关[2] ，高毒株JP2启动子与低毒株652启动子相比缺少了530 bp的基因片段。根据这一特点设计合适的引物应用PCR技术可区别白细胞毒素高毒株与低毒株[3]。我们应用这一技术检测分离、保存的不同血清型Aa临床菌株的白细胞毒素水平，以期进一步了解Aa及其白细胞毒素与牙周病的关系。
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材料及方法
1.菌株：①参考菌株：放线共生放线杆菌JP2(血清型b)， ATCC43717(血清型a)， ATCC43718(血清型b)， ATCC43719(血清型c)，ATCC29523(血清型a)，ATCC24523(血清型a)，侵蚀埃肯菌ATCC23834，中间普氏菌ATCC25261，牙龈朴啉单孢菌P381, 14-3-2, ATCC35406, ATCC33547, 47-1，具核梭杆菌ATCC25586，亲缘链球菌ATCC22607，粘性放线菌ATCC19246，变型链球菌(血清型c)。以上菌株来源于美国宾西法尼亚大学和日本鹤见大学。嗜沫嗜血杆菌654(华西医科大学)。②临床菌株：68株Aa分别来自13例龈炎，8例青少年牙周炎，3例成年人牙周炎及1名牙周健康者, 共计25例，其中b型17株，c型42株，a型(可能包括d，e型)9株[4]。
2.DNA模板：所有菌株菌体放入微量离心管，生理盐水洗2遍，加入100 μl TE-Triton X-100裂解液(10 mmol/L Tris HCl 1 mmol/L EDTA 1% Triton X-100)， 100℃ 10 min，取上清加入饱和NaCl，剧烈震荡15 s，8 000 r/min，离心10 min，取上清加入无水乙醇，-20℃ 1 h 12 000 r/min，离心20 min，弃上清，70% 乙醇洗2遍，DNA加入TE液溶解，-20℃保存备用。
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3.引物：两条合成引物核苷酸序列分别为5＇-TCCATATTAAATCT-CCTTGT-3＇和-5＇-AACCTGATAACA-GTATT-3＇，扩增片段为白细胞毒素启动子+5到-487，总长度高毒株JP2为492 bp，低毒株ATCC43717为1 022 bp。
4.PCR：总反应体积为20 μl，重蒸水11 μl， dNTP(含4种脱氧核糖核苷酸各2.5 mmol/L)2 μl，10×缓冲液2 μl，(Mg离子浓度1.6 mmol/L)，引物4 μl(20 pmol)，模板l μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl(含1U)混匀后加20 μl石蜡油覆盖混合液，放入DNA扩增仪(PCR-90AR)。94℃预变性5 min; 然后94℃变性40 s，48℃变性40 s，72℃延伸3 min，共计35个循环; 最后延伸9 min。每批反应设置阳性对照为JP2，ATCC43717，阴性对照为654及不加DNA模板的空白对照。
5.扩增产物检测：1% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪(UVP ZmageStore 7500)观察扩增片段。相对分子质量大小参照物为ΦX174/HaeⅢ和PBR322/MSPI。
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结果
以JP2及其他5株Aa参考菌株DNA为模板，分别扩增出相对分子质量大小不同的DNA片段，与DNA相对分子质量标准物对比，片段大小分别为492 bp和1 022 bp，与预计大小一致，12株口腔常见异种菌参考菌株DNA模板均未出现扩增产物，不加模板的空白对照无扩增产物出现(图1, 2)，68株临床菌株DNA模板均扩增出1 022 bp片段(图3)。
讨论
Aa白细胞毒素一直是牙周细菌学研究的一个热点。白细胞毒素特异地破坏人类和灵长类的多形核白细胞和巨噬细胞，抑制和破坏宿主的免疫防御机制，但对其他动物的白细胞及人类的其他细胞无杀伤作用。Aa白细胞毒素与溶血巴斯德菌的白细胞毒素及大肠杆菌的α-溶血素，在基因结构上存在广泛的同源序列，目前认为是Aa最重要的潜在致病因子。
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1：ΦX 174/Hae III; 2：JP2； 3：ATCC 43717； 4：654；5：空白对照
图1 Aa国际参考菌株PCR扩增产物
1：ΦX 174/Hae III; 2：ATCC 43717； 3：ATCC 43718；
4：ATCC 43719； 5：ATCC 29523； 6：ATCC 24523
图2 Aa国际参考菌株PCR扩增产物
1：ΦX174/Hae III; 2：ATCC 43717； 3：654；
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4～10：Aa临床分离菌株
图3 Aa临床分离菌株PCR扩增产物
Aa白细胞毒素操纵子由4个基因组成，分别由ltxC，ltxA，ltxB和ltxD表示。ltxA是结构基因，负责编码116 000的白细胞毒素肽链；其他3个基因位于ltxA两侧，推测可能与白细胞毒素的活性及转运有关[5]。目前研究认为白细胞毒素操纵子存在于所有Aa中，白细胞毒素水平的差异可能是由于启动子基因序列的不同。早期进行这方面研究的Brogan等[6] 检测了2株JP2样菌，13株652样菌的白细胞毒素水平。两株含有JP2样启动子的Aa白细胞毒素水平高于含652样菌启动子的Aa 10～20倍，说明白细胞毒素表达水平与启动子基因型有关。Zamban等[2]根据白细胞毒素的基因结构，设计一对引物检测了37例牙周炎患者的105株Aa，其中12例的44株Aa均为JP2样菌，且全部出现在局部型青少年牙周炎患者。对比非常明显的是成人牙周炎及牙周健康者均为652样菌。这一结果强烈提示，JP2样菌及Aa白细胞毒素水平的差异可能与局部型青少年牙周炎相关。基于以上研究结果，我们应用同样引物检测了来自13例龈炎、8例青少年牙周炎、3例成人牙周炎及1名牙周健康者的68株临床分离菌株 ，其中包括b型17株，c型42株，a型(可能包括血清型d，e)9株，结果显示全部为652样菌。 Haubek1995年曾检测了88株来自芬兰的Aa和60多株来自北欧的Aa均为652样菌[2]，但在另两项实验中[7, 8]从来自非洲或历史上与非洲大陆有密切联系的LJP患者中均检出了JP2样菌。这一结果提示，JP2样菌的分布是否存在地域或种族差异，青少年牙周炎在黑人中的患病率比较高，JP2菌的分布特点也从另一方面解释了青少年牙周炎流行病学的特点。我们的结果也提供了这方面的支持。另外JP2样菌可能与Aa 的b型有关。 Haubek等[7]检测了来自27个国家的193株Aa，检出JP2样菌36株，全部为b型。Mombelli等[9]1998年在中国37名成人中检出的Aa 中未检出b型和d型，也未发现JP2样菌。本实验68株菌大部分为c型，b型仅有17株，是否存在JP2样菌尚需要进一步观察。
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JP2样菌是一个独特的克隆型，可能与一部分青少年牙周炎的发病相关，但目前报道及我们的实验结果均提示并不是所有青少年牙周炎都存在JP2样菌。从这个意义上讲青少年牙周炎可能至少存在两种类型，即单克隆感染和多克隆感染[7]。区别这两种类型在牙周病的预防、诊断和治疗上都有实际意义。单克隆感染多属外源性感染，诊断以定性为主，防治上以切断传播途径去除致病菌为目的；而多克隆感染则多属内源性感染，诊断的关键是定量，防治上应以调整菌群平衡为目地。另外从我们的实验结果看，Aa白细胞毒素可能也不是青少年牙周炎发病的唯一因素。近年来不少研究提出个体遗传因素在青少年牙周炎发病中的作用，如白细胞Fc受体的多态性，白细胞趋化异常等。可能还有其他因素。但具体到每例患者的发病因素不一定全部存在。
本实验所用引物合成片段JP2为492 bp，其他Aa均为1 022 bp，两类菌结果不存在交叉，其他12种异种菌均无扩增产物出现，结果明确，说明引物特异性好。另外，本实验全部菌株均为分纯菌株，并进行过形态、生化及抗体鉴定，也避免了假阳性结果的出现。
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参考文献：
[1] Zambon JJ, Slots J, Genco RJ. Serology of oral Actinobacillus actonomycetemcomitans and serotype distribution in human periodontal disease. Infect Immun, 1983,41:19-27.
[2] Zambon JJ, Haraszthy VI，Hariharan G ,et al. The microbiology of early-onset periodontitis: association of highly toxic Actinobacillus actinomycetemcomitans strains with localized juvenile periodontitis . J Periodontol, 1996,67:282-290.
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[3] Spitznagel J Jr, Kraig E, Kolodrubetz D. Regulation of leukotoxin in leukotoxic and nonleukotoxic strains of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect Immun ,1991,59:1394-1401.
[4] 王者玲，杨圣辉，尚佳健. 放线共生放线杆菌的血清型分布. 中华口腔医学杂志，1997，32：7-9.
[5] Lally ET, Kieba IR, Golub EE ,et al. Structure/Function aspects of Aa leukotoxin. J Periodontol, 1996,67:298-308.
[6] Brogan JM, Lally ET, Poulsen K, et al. Regulation of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin expression: analysis of the promoter regions of leukotoxic and minimally leukotoxic strains. Infect Immun, 1994,62:501-508.
, 百拇医药
[7] Haubek D， Poulsen K, Westergaard J, et al. Highly toxic clone of Actinobacillus actinomycetemcomitans in geographically widespread cases of juvenile periodontitis in adolescents of African origin. J Clin Microbiology, 1996,34:1576-1578.
[8] Haubek D, DiRienzo J, Tinocolo E, et al. Dissemination of a highly toxic clonal type of A. Actinomycetemcomitans. J Dent Res, 1997,76:225.
[9] Mombelli A, Gmur R, Frey J, et al. Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in young Chinese adults. Oral Microbiol Immunol, 1998,13:231-237.
收稿日期：1999-06-17, 百拇医药
单位：王者玲 杨圣辉(首都医科大学附属北京口腔医院口腔医学研究所，100050)；张廷发(北京医院口腔科)；肖白(首都医科大学附属朝阳医院分子生物学实验室)
关键词：放线杆菌属；细胞毒素类；牙周炎
中华口腔医学杂志000212 【摘要】 目的 检测放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)临床分离菌株白细胞毒素水平，区分高毒株与低毒株。方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测白细胞毒素操纵子启动子区域基因序列的差异。检测临床菌株68株，其中b型17株，c型42株，a型9株。阳性对照高毒株为JP2，低毒株为ATCC43717等5株Aa国际参考菌株，阴性对照为12株异种菌国际参考菌株。结果 68株临床分离菌株扩增片段均为1 022 bp, JP2扩增片段为492 bp，ATCC43717等5株扩增片段均为1 022 bp，12株异种菌参考菌株无扩增片段出现。结论 68株临床分离菌株全部为低毒株。
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Detecting the level of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin
WANG Zheling
(Research Institute of Stomatology，Beijing Stomatological Hospital，Beijing 100050，China)
ZHANG Tingfa ,XIAO Bai
【Abstract】 Objective To detect the level of Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) leukotoxin and distinguish the highly and the minimally toxic strains. Methods The polymerase chain reaction (PCR) assay was used to detect the difference of the nucleotide sequence of Aa leukotoxic promoter. 68 Aa isolates were examined, including 17 serotype b,42 serotype c and 9 serotype a strains. The positive control strains were the highly toxic strain JP2 and 7 minimally toxic strains such as ATCC43717; the negative control strains were 12 other species of reference strains. Results The PCR fragments of JP2 was about 492 bp and that of the other Aa reference strains and 68 clinical isolates were 1 022 bp. PCR products not found in 12 other species. Conclusion All of the 68 clinical isolates were minimally toxic strains.
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【Key words】 Actinobacillus； Cytotoxins； Periodontitis
放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomy-cetemcomitans, Aa)是重要的可疑牙周致病菌，近年来一直受到牙周病学者的广泛关注。现已发现Aa分泌白细胞毒素,并认为它是Aa的主要致病因子。Aa不同菌株分泌白细胞毒素的水平不同，最早报道与血清型有关, 尤其是b型，b型多存在于青少年牙周炎个体[1]。一般认为b型更易分泌白细胞毒素，具有更强的致病性。我们也对来自不同牙周状况的Aa临床分离菌株进行了血清分型，却发现包括青少年牙周炎在内检出的大部分是c型。随着分子生物学技术的发展，Aa白细胞毒素基因已克隆并测序。有研究报道 Aa白细胞毒素水平的差异与它们的基因结构有关[2] ，高毒株JP2启动子与低毒株652启动子相比缺少了530 bp的基因片段。根据这一特点设计合适的引物应用PCR技术可区别白细胞毒素高毒株与低毒株[3]。我们应用这一技术检测分离、保存的不同血清型Aa临床菌株的白细胞毒素水平，以期进一步了解Aa及其白细胞毒素与牙周病的关系。
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材料及方法
1.菌株：①参考菌株：放线共生放线杆菌JP2(血清型b)， ATCC43717(血清型a)， ATCC43718(血清型b)， ATCC43719(血清型c)，ATCC29523(血清型a)，ATCC24523(血清型a)，侵蚀埃肯菌ATCC23834，中间普氏菌ATCC25261，牙龈朴啉单孢菌P381, 14-3-2, ATCC35406, ATCC33547, 47-1，具核梭杆菌ATCC25586，亲缘链球菌ATCC22607，粘性放线菌ATCC19246，变型链球菌(血清型c)。以上菌株来源于美国宾西法尼亚大学和日本鹤见大学。嗜沫嗜血杆菌654(华西医科大学)。②临床菌株：68株Aa分别来自13例龈炎，8例青少年牙周炎，3例成年人牙周炎及1名牙周健康者, 共计25例，其中b型17株，c型42株，a型(可能包括d，e型)9株[4]。
2.DNA模板：所有菌株菌体放入微量离心管，生理盐水洗2遍，加入100 μl TE-Triton X-100裂解液(10 mmol/L Tris HCl 1 mmol/L EDTA 1% Triton X-100)， 100℃ 10 min，取上清加入饱和NaCl，剧烈震荡15 s，8 000 r/min，离心10 min，取上清加入无水乙醇，-20℃ 1 h 12 000 r/min，离心20 min，弃上清，70% 乙醇洗2遍，DNA加入TE液溶解，-20℃保存备用。
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3.引物：两条合成引物核苷酸序列分别为5＇-TCCATATTAAATCT-CCTTGT-3＇和-5＇-AACCTGATAACA-GTATT-3＇，扩增片段为白细胞毒素启动子+5到-487，总长度高毒株JP2为492 bp，低毒株ATCC43717为1 022 bp。
4.PCR：总反应体积为20 μl，重蒸水11 μl， dNTP(含4种脱氧核糖核苷酸各2.5 mmol/L)2 μl，10×缓冲液2 μl，(Mg离子浓度1.6 mmol/L)，引物4 μl(20 pmol)，模板l μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl(含1U)混匀后加20 μl石蜡油覆盖混合液，放入DNA扩增仪(PCR-90AR)。94℃预变性5 min; 然后94℃变性40 s，48℃变性40 s，72℃延伸3 min，共计35个循环; 最后延伸9 min。每批反应设置阳性对照为JP2，ATCC43717，阴性对照为654及不加DNA模板的空白对照。
5.扩增产物检测：1% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪(UVP ZmageStore 7500)观察扩增片段。相对分子质量大小参照物为ΦX174/HaeⅢ和PBR322/MSPI。
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结果
以JP2及其他5株Aa参考菌株DNA为模板，分别扩增出相对分子质量大小不同的DNA片段，与DNA相对分子质量标准物对比，片段大小分别为492 bp和1 022 bp，与预计大小一致，12株口腔常见异种菌参考菌株DNA模板均未出现扩增产物，不加模板的空白对照无扩增产物出现(图1, 2)，68株临床菌株DNA模板均扩增出1 022 bp片段(图3)。
讨论
Aa白细胞毒素一直是牙周细菌学研究的一个热点。白细胞毒素特异地破坏人类和灵长类的多形核白细胞和巨噬细胞，抑制和破坏宿主的免疫防御机制，但对其他动物的白细胞及人类的其他细胞无杀伤作用。Aa白细胞毒素与溶血巴斯德菌的白细胞毒素及大肠杆菌的α-溶血素，在基因结构上存在广泛的同源序列，目前认为是Aa最重要的潜在致病因子。
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1：ΦX 174/Hae III; 2：JP2； 3：ATCC 43717； 4：654；5：空白对照
图1 Aa国际参考菌株PCR扩增产物
1：ΦX 174/Hae III; 2：ATCC 43717； 3：ATCC 43718；
4：ATCC 43719； 5：ATCC 29523； 6：ATCC 24523
图2 Aa国际参考菌株PCR扩增产物
1：ΦX174/Hae III; 2：ATCC 43717； 3：654；
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4～10：Aa临床分离菌株
图3 Aa临床分离菌株PCR扩增产物
Aa白细胞毒素操纵子由4个基因组成，分别由ltxC，ltxA，ltxB和ltxD表示。ltxA是结构基因，负责编码116 000的白细胞毒素肽链；其他3个基因位于ltxA两侧，推测可能与白细胞毒素的活性及转运有关[5]。目前研究认为白细胞毒素操纵子存在于所有Aa中，白细胞毒素水平的差异可能是由于启动子基因序列的不同。早期进行这方面研究的Brogan等[6] 检测了2株JP2样菌，13株652样菌的白细胞毒素水平。两株含有JP2样启动子的Aa白细胞毒素水平高于含652样菌启动子的Aa 10～20倍，说明白细胞毒素表达水平与启动子基因型有关。Zamban等[2]根据白细胞毒素的基因结构，设计一对引物检测了37例牙周炎患者的105株Aa，其中12例的44株Aa均为JP2样菌，且全部出现在局部型青少年牙周炎患者。对比非常明显的是成人牙周炎及牙周健康者均为652样菌。这一结果强烈提示，JP2样菌及Aa白细胞毒素水平的差异可能与局部型青少年牙周炎相关。基于以上研究结果，我们应用同样引物检测了来自13例龈炎、8例青少年牙周炎、3例成人牙周炎及1名牙周健康者的68株临床分离菌株 ，其中包括b型17株，c型42株，a型(可能包括血清型d，e)9株，结果显示全部为652样菌。 Haubek1995年曾检测了88株来自芬兰的Aa和60多株来自北欧的Aa均为652样菌[2]，但在另两项实验中[7, 8]从来自非洲或历史上与非洲大陆有密切联系的LJP患者中均检出了JP2样菌。这一结果提示，JP2样菌的分布是否存在地域或种族差异，青少年牙周炎在黑人中的患病率比较高，JP2菌的分布特点也从另一方面解释了青少年牙周炎流行病学的特点。我们的结果也提供了这方面的支持。另外JP2样菌可能与Aa 的b型有关。 Haubek等[7]检测了来自27个国家的193株Aa，检出JP2样菌36株，全部为b型。Mombelli等[9]1998年在中国37名成人中检出的Aa 中未检出b型和d型，也未发现JP2样菌。本实验68株菌大部分为c型，b型仅有17株，是否存在JP2样菌尚需要进一步观察。
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JP2样菌是一个独特的克隆型，可能与一部分青少年牙周炎的发病相关，但目前报道及我们的实验结果均提示并不是所有青少年牙周炎都存在JP2样菌。从这个意义上讲青少年牙周炎可能至少存在两种类型，即单克隆感染和多克隆感染[7]。区别这两种类型在牙周病的预防、诊断和治疗上都有实际意义。单克隆感染多属外源性感染，诊断以定性为主，防治上以切断传播途径去除致病菌为目的；而多克隆感染则多属内源性感染，诊断的关键是定量，防治上应以调整菌群平衡为目地。另外从我们的实验结果看，Aa白细胞毒素可能也不是青少年牙周炎发病的唯一因素。近年来不少研究提出个体遗传因素在青少年牙周炎发病中的作用，如白细胞Fc受体的多态性，白细胞趋化异常等。可能还有其他因素。但具体到每例患者的发病因素不一定全部存在。
本实验所用引物合成片段JP2为492 bp，其他Aa均为1 022 bp，两类菌结果不存在交叉，其他12种异种菌均无扩增产物出现，结果明确，说明引物特异性好。另外，本实验全部菌株均为分纯菌株，并进行过形态、生化及抗体鉴定，也避免了假阳性结果的出现。
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参考文献：
[1] Zambon JJ, Slots J, Genco RJ. Serology of oral Actinobacillus actonomycetemcomitans and serotype distribution in human periodontal disease. Infect Immun, 1983,41:19-27.
[2] Zambon JJ, Haraszthy VI，Hariharan G ,et al. The microbiology of early-onset periodontitis: association of highly toxic Actinobacillus actinomycetemcomitans strains with localized juvenile periodontitis . J Periodontol, 1996,67:282-290.
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[3] Spitznagel J Jr, Kraig E, Kolodrubetz D. Regulation of leukotoxin in leukotoxic and nonleukotoxic strains of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect Immun ,1991,59:1394-1401.
[4] 王者玲，杨圣辉，尚佳健. 放线共生放线杆菌的血清型分布. 中华口腔医学杂志，1997，32：7-9.
[5] Lally ET, Kieba IR, Golub EE ,et al. Structure/Function aspects of Aa leukotoxin. J Periodontol, 1996,67:298-308.
[6] Brogan JM, Lally ET, Poulsen K, et al. Regulation of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin expression: analysis of the promoter regions of leukotoxic and minimally leukotoxic strains. Infect Immun, 1994,62:501-508.
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[7] Haubek D， Poulsen K, Westergaard J, et al. Highly toxic clone of Actinobacillus actinomycetemcomitans in geographically widespread cases of juvenile periodontitis in adolescents of African origin. J Clin Microbiology, 1996,34:1576-1578.
[8] Haubek D, DiRienzo J, Tinocolo E, et al. Dissemination of a highly toxic clonal type of A. Actinomycetemcomitans. J Dent Res, 1997,76:225.
[9] Mombelli A, Gmur R, Frey J, et al. Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in young Chinese adults. Oral Microbiol Immunol, 1998,13:231-237.
收稿日期：1999-06-17, 百拇医药