绞股蓝影响白斑癌变过程中Ha-ras基因突变的实验研究
作者：周曾同 唐国瑶 钟文静 丁端宇 毛德 李伟国
单位：周曾同 唐国瑶 钟文静 丁端宇 李伟国(上海第二医科大学口腔医学院口腔内科，200011)；(国家医药管理局上海医药工业研究所)
关键词：粘膜白斑病口腔；基因；ras；聚合酶链反应；多态现象；单链构象
因与白斑癌变动态变化过程的关系进行研究【摘要】 目的 观察绞股蓝对白斑癌变过程中Ha-ras癌基因突变的影响，从分子水平探讨绞股蓝防癌、抑癌的机理，并对Ha-ras基因与白斑癌变动态变化过程的关系进行研究。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析法，检测经绞股蓝总甙、甙元、C20-OH皂甙等处理的金地鼠颊囊白斑癌变模型标本，观察 Ha-ras基因含第61位密码子突变的阳性信号。结果 白斑癌变模型组突变率达 22.96%，绞股蓝处理组平均为7.59%；绞股蓝各组抗突变率效佳依次为C20-OH组、总甙组、甙元组，其突变率分别为5.32%、6.25%、11.00%;DMBA诱导癌变4～8周时白斑模型组突变率为11.10%～40.00%,绞股蓝处理组为0～10.70%。结论 绞股蓝具有显著的抗癌基因突变功效，其有效成分与C20带游离羟基有关。Ha-ras基因突变在白斑癌变中起重要作用。
Experimental study on the influence of Gynostemma pentaphyllam Mak upon point mutation of Ha-ras oncogene in blocking leukoplakia from canceration
Zhou Zengtong, Tang Guoyao, Zhong Wenjing, et al.
(Department of Oral Medicine，School of Stomatology，Shanghai Second Medical University，Shanghai 200011， China)
【Abstract】 Objective To study the influence of Gynostemma pentaphyllam Mak (GP) upon point mutation of Ha-ras oncogene the molecular mechanism of GP in blocking canceration ,and the relationship between Ha-ras oncogene and canceration of leukoplakia . Methods DMBA induced carcinogeneses of the buccal pouch mucosa of the hamsters were divided into leukoplakia model group(LKG)and GP treated group(GPG). Point mutation (codon 61) of Ha-ras oncogene was detected by PCR-SSCP in both groups. Results The mutation incidence of LKG was 22.96% , while the mean incidence of GPG was 7.59% (The incidences of C20-OH group, glucoside group and aglucon group were 5.32%, 6.25% and 11.00% respectively). When treated with DMBA for 4 to 8 weeks, the mutation incidence of LKG ranged from 11.10% to 40.00%, while GPG ranged from 0 to 10.70%. Conclusions GP has outstanding cancer blocking effect chiefly affected by free C20-OH. Mutation of Ha-ras oncogence plays an important role in leukoplakia canceration.
【Key words】 Leukoplakia，oral；Genes，ras；Polymerase chain reaction；Polymorphism，single-stranded conformational
口腔白斑(oral leukoplakia, OLK)为国际公认的癌前病变，其患病率和癌变率分别高达4.9%～48.9%及3.4%～19.8%，是口腔鳞癌的重要病源之一。Ha-ras癌基因在口腔癌的发生中有重要作用，有研究发现口腔鳞癌标本中 Ha-ras基因产物p21有高表达[1]。我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction-single-stranded conformational polymorphism，PCR-SSCP)技术，对具有多种生物活性的中药绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Mak, GP)[2，3]干预的金地鼠颊囊白斑模型进行动态研究,检测OLK癌变过程中Ha-ras癌基因含第61位密码子突变的情况，探讨GP对癌基因激活的影响及其防癌、抑癌的分子机理。
材料和方法
一、材料
1.实验动物：叙利亚金地鼠 195只，清洁级，周龄 4～8周，体重 80～100 g，封闭群。上海西普尔BK实验动物公司提供。
2.实验致癌剂：二甲基苯并蒽(dimethylbenzanthracene, DMBA) 1 g，室温下加入到200 ml丙酮液中，配置成0.5% 的DMBA液。
3. PCR仪：型号GENIUS。
4. PCR-SSCP有关引物和试剂：含61位密码子特异反应的引物序列：引物1为 5＇ACGGAATATAAGCTGGTGG3＇，引物2为 5＇CGGCGGCAGGTCCACGGTC3＇，蛋白酶K、裂解液、PCR试剂盒由上海第二医科大学提供。自配试剂：变性液(95% 甲酰胺、2 mmol/L EDTA Na2, 0.05% 溴酚蓝、0.05% 二甲苯青)；固定液(10% 乙醇、0.5% 冰醋酸)；显色液(0.4% 甲醛、1.5%氢氧化钠)。
5. 绞股蓝：云南产绞股蓝干全草。由国家医药局上海医药工业研究院中药研究室参照竹本常松法[4]提取GP总甙(简称GP-A)、GP甙元(简称GP-B)和含C20位游离羟基的GP(简称GP-C)。
二、方法
1.实验动物分组及处理：①空白对照组(2只)：空气流通、室温23～26℃、相对湿度 75%～80%环境下分笼养，每笼≤10只。食用金地鼠全价营养颗粒饲料和1%维生素C液。双侧颊囊粘膜涂布生理盐水，于实验结束时处死。Salley[5]在1954年建立此模型时已证实丙酮在金地鼠颊囊癌前病变的诱导实验中不具致癌作用，故本实验未设丙酮对照组。②OLK模型组(48只)：相同条件下饲养，双颊涂布DMBA诱导致癌，分别在涂布满4、5、6、7、8周时分批处死9～10只。③GP处理组(145只)：其中 GP-A 48只，GP-B 50只，GP-C 47只。相同条件下饲养，并按每天3.5 mg/只剂量灌胃喂服GP，12周后开始DMBA涂布双颊，分别在涂布DMBA满4、5、6、7、8周后各处理组分批处死9～10只。
2. OLK模型制作：参照Selly法[5]。乙醚麻醉金地鼠后，大直镊撑开双侧颊囊口，以1号油画笔蘸取少量DMBA液，以颊囊前静脉为中心作圆周式涂布10次，禁食禁水2 h，每周重复3次。
3. 标本处理：处死后，取两侧颊囊组织，每只金地鼠可制标本2例。将新鲜标本用甲醛固定，石蜡包埋，常规切片。分别作PCR-SSCP检测及HE染色，常规镜检。
4. PCR-SSCP检测： ① DNA抽提：上述标本经 TES缓冲液(pH 7.8)去蜡→2 μl蛋白酶K及40 μl 裂解液消化(50℃，24～36 h)。② PCR：取标本 4 μl 注入 19.2 μl PCR反应液中(含 Taq酶 0.8 μl)，并给予 1滴石蜡油进行外反应(94℃ 90 s→94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 60 s，循环30次)；将标本稀释25倍后进行内反应(同外反应程序，循环37次)；2%琼脂糖凝胶电泳( 0.5 h，电压110 V)，观察泳动带，收集产物。③SSCP：25 μl PCR反应产物加入12 μl变性液，经97℃ 10 min→ 冰浴5 min→30% 聚丙烯酰胺凝胶电泳→固定液中固定15 min→洗脱→染色液中染色10 min→洗脱→显色液中显色。④观察摄片：观察PCR-SSCP反应结果，摄取泳动带，比较条带分布情况。空白对照组标本显示两条单链影像，发生Ha-ras基因含第61位密码子突变的标本在两条单链前出现第3条链影像。
结果
1.金地鼠颊囊粘膜上皮重度异常增生及原位癌组织病理切片见图1，2。分别取自OLK模型组涂布DMBA 5周和7周标本。
图1 粘膜上皮重度异常增生(×100) 图2 粘膜原位癌(×100)
2.Ha-ras突变阳性信号见图3。图中5号标本为阳性对照，取自上海第二医科大学口腔医学院SCC标本，表现为Ha-ras基因突变的第3条链影像。6号标本为阴性对照，取自本实验空白对照组。8号标本取自本实验OLK模型组，显示有Ha-ras基因突变的泳动带。其余各标本均为本实验GP处理组，标本时间点为涂DMBA 5～7周。
图3 Ha-ras突变阳性信号电泳结果
3.光镜观察GP各处理组与OLK模型组重度异常增生及原位癌发生情况比较见表1。 将GP各组资料归总计算重度异常增生及原位癌发生率为8.6%。经χ2检验，OLK、GP组间差异有显著性，P<0.05；而GP各处理组间 P>0.05。
4. GP各组与 OLK模型组 Ha-ras基因突变阳性信号出现率比较见表2。经χ2检验，OLK、GP间P<0.01，差异有高度显著性。GP-A、GP-B、GP-C各组间差异无显著性，P>0.05。
表1 GP组与模型组重度异常增生及原位癌发生率比较
项目
OLK
模型组
GP组
空白组
GP-A
GP-B
GP-C
重度异常增生/
标本数
10/96
8/96
8/100
6/94
0/4
原位癌/标本数
6/96
1/96
2/100
0/94
0/4
合计
16/96
9/96
10/100
6/94
0/4
发生率(%)
16.67
9.38
10.00
6.38
0
注：OLK：口腔白斑；GP：绞股蓝；GP-A：GP总甙；GP-B：GP甙元；GP-C：含C20位游离羟基的GP；表2，3，4同表2 GP处理各组与OLK模型组Ha-ras突变率比较
项目
OLK
模型组
GP组
空白组
GP-A
GP-B
GP-C
阳性例数/标本数
22/96
6/96
11/100
5/94
0/4
突变率(%)
22.92
6.25
11.00
5.32
0
合计
22.92
7.59
0
5.DMBA诱导白斑癌变 4～8周各组的 Ha-ras基因突变率见表3。经χ2检验，涂布DMBA 4、5、6周时处死的OLK模型组与GP组间Ha-ras基因突变率差异有高度显著性( P<0.01)，第7、8周GP组亦低于OLK模型组，但差异无显著性(P>0.05)。
6.含或不含游离羟基的GP各组间突变率比较见表4。GP-B是经彻底水解处理过的GP，已将所有的糖结构全部切除，因此不再含有游离羟基。而GP-C是经特异作用于 C20位的酶处理过的GP，因而能保证 C20位上有游离羟基。而GP-A则是没有经过水解或特殊酶处理的GP，存有某些带游离羟基的成分。因此，比较GP-B与GP-A+GP-C，可以发现含游离羟基的癌基因突变率低于不含游离羟基的近2倍，但χ2检验结果 P>0.05。表3 DMBA诱导4～8周Ha-ras突变率比较
组别
项目
涂DMBA时间(周)
4
5
6
7
8
OLK
模型
阳性例数/
标本数
5/20
8/20
3/20
2/18
4/18
突变率
(%)
25.00
40.00
15.00
11.11
22.22
GP
阳性例数/
标本数
0/60
6/58
3/56
6/56
6/60
突变率
(%)
0
10.34
5.36
10.71
10.00
表4 含或不含-OH的GP处理组间Ha-ras突变率比较
项目
不含-OH(GP-B)
含-OH(GP-A+GP-C)
阳性例数/标本数
11/100
11/190
突变率(%)
11.00
5.79
讨论
一、 Ha-ras基因突变与OLK癌变的关系
大量研究表明，肿瘤的发生与原癌基因被激活密切相关。Ha-ras基因是原癌基因C-ras家族中的重要一员。它与另外两种C-ras家族成员 Ki-ras、N-ras一样，其表达产物均为相对分子质量为21 000的蛋白，称为 p21。正常情况下 Ha-ras基因不表达，但一旦其中某个碱基发生点突变就会活化为癌基因。研究发现它的点突变位置局限于第12、13、 61位密码子上。被激活了的Ha-ras基因可以在不需要生长因子的条件下活化GTP，而高水平的GTP则是正常细胞增生为癌细胞的必不可少的条件[6]。国内外学者已在大量实验中证实口腔癌的Ha-ras基因突变阳性率高于正常细胞2～16倍[1]。DMBA诱导的OLK模型有高达22.92%的Ha-ras基因突变阳性信号，而未接触致癌剂的空白组为0(表2)，说明Ha-ras基因突变与OLK癌变紧密相关。此外，以往的实验研究表明，DMBA诱导金地鼠颊囊粘膜产生OLK以及OLK癌变有一个动态发展过程。涂布DMBA 4～8周是粘膜上皮细胞由正常→轻度异常增生→中度异常增生→重度异常增生→原位癌的序列变化的关键时期[7]。其中，涂布DMBA 4～5周的病理表现以轻～中度上皮异常增生为主。5～6周以重度异常增生及原位癌为主，7周以上几乎全部出现原位癌。表3显示出在此时期内，OLK模型组持续维持高突变率，说明Ha-ras基因突变贯穿于OLK癌变的全过程，从而证实了Ha-ras癌基因在白斑癌变的发生中有很重要的作用。
二、 GP在白斑癌变过程中的抗Ha-ras基因突变作用
近20年来，经中日学者大量研究，发现GP成分中含有人参甙，并有抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗衰老、抗心肌缺氧等多种生物活性。其作用机理可能与提高机体抗氧化、调节免疫等作用有关。以往应用金地鼠颊囊白斑模型所做的实验证实，GP有明显的抑制细胞异常增殖的作用，经GP喂食的金地鼠DMBA诱导癌变率比对照组低2倍多[6]。本实验再次证实GP有明显的抑癌作用，但从分子水平阐述机理未见报道。为此，我们采用相同诱癌条件，比较GP组与OLK模型组间Ha-ras基因突变的阳性率，发现GP组只及OLK模型组的1/3(表2)，且与光镜观察结果基本相符(表1)，提示了GP抗基因突变的作用可能是抑制细胞异常增殖的分子学基础。从表3可以看出，在OLK癌变的全过程中，GP组的Ha-ras基因突变率均低于模型组，尤其在接触化学诱癌剂的早、中期，在粘膜上皮尚处于轻、中度异常增生阶段，GP的抗突变保护作用更加显著，说明GP确有保护正常细胞、防止癌变的功效。同时提示接受GP保护的时间越早越好，即GP在阻止白斑癌变进程中的预防作用比治疗作用更重要。
三、GP抗癌基因突变有效成分的探讨
GP总甙是一个多成分的混合体，目前已明确结构的皂甙即有70余种。1983年，日本竹本常松等报道了GP皂甙都具有四玢三萜的达玛烷型结构和低聚糖糖基，并提出20位或21位碳原子上带有游离羟基的GP甙与抑制肿瘤细胞有关[4]。本实验发现 C20带游离羟基的GP-C在GP各组中抗基因点突变效果最佳，含有不明部位带游离羟基的GP-A效果次之，而不含游离羟基的GP-B效果最差。将GP-A与GP-C合并后与GP-B比较，两者效果相差1倍左右(表2，4)，提示游离羟基可能是维持GP抗癌有效分子结构或构型的重要因素。本实验结果提示，游离羟基是GP防止 Ha-ras基因突变的有效成分的标志，进一步的机理还有待深入探讨，游离羟基GP的效果尚待扩大样本以得到明确结论。
参考文献：
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[2] 周曾同 ,张水龙 ,徐维宁. 中药绞股蓝研究进展 .上海中医药杂志 ,1996,7:42.
[3] 周曾同 ,徐维宁 ,张水龙,等. 绞股蓝对金地鼠颊囊癌前病变细胞动力学影响的研究 .上海口腔医学 ,1997,6:65-68.
[4] 竹本常松 ,在原重信 ,中岛正,他. アマチヤツルの成分研究(第1报). Gypenoside I-XIVの化学构造 (日)药学杂志, 1983,103:173-185.
[5] Salley JJ. Experimental Carcinogenesis in the cheek pouch of the syrian hamster. J Dent Res, 1954,33:253-262.
[6] 周曾同, 金芝贵 ,张水龙,等. 绞股蓝阻断金地鼠颊囊癌变的光镜观察. 实用口腔医学杂志 ,1995,11:244.
[7] Zhou ZT, Wang Y, Zhou YM, et al. Effect of gynostemma pentaphyllum mak on carcinomatous conversions of golden hamster cheek pouches induced by dimethyl benxanthracene: histological study. Chin Med J, 1998,111:847-850.
收稿日期：1999-03-16