角膜中期保存过程中细胞凋亡的研究
作者：钟兴武 龚向明 杨培增 刘红山 刘祖国
单位：钟兴武(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)；龚向明(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)；杨培增(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)；刘祖国(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)；刘红山(广州市眼库)
关键词：
中华眼科杂志000220
一、 材料与方法
1.角膜中期保存液：采用M-K液，M-K+表皮生长因子(EGF，德国产品)液和Optisol液。
2.实验动物与角膜保存：纯种新西兰白兔10只，雌雄兼有，体重2.0～2.5 kg，处死后立即摘出眼球共20只，随机取2个角膜片，用4%的多聚甲醛固定作为正常对照。剩余的18个角膜片随机分为3组，每组6个角膜片。按常规角膜中期保存方法，分别置于 M-K液、M-K + EGF液和Optisol液内，4℃冰箱保存。
, http://www.100md.com
3.末端转移酶介导的DNA缺口生物素-dUTP标记法(TdT mediated biotin dUTP nick-end labelling, TUNEL)原位标记：保存第3、5、7天，每组各取2个角膜片，每个角膜片的一半用4%多聚甲醛固定，同正常对照的2个角膜片一样行常规石蜡包埋切片。组织切片按常规方法脱蜡、脱水，用0.5%胃蛋白酶，37℃下处理60 min，PBS轻洗2次；再加0.1%TritonX-100和0.1%枸橼酸钠液处理2 min，PBS轻洗2次；每个标本加入5 μl 的TUNEL酶和45 μl 的TUNEL标记的混和物，阴性对照组仅加TUNEL标记，阳性对照组在加入TUNEL反应混和物之前,先用DNaseⅠ在室温下处理10 min；最后将其置入37℃湿房中30 min，再用 PBS轻洗3次，加盖玻片。用荧光显微镜，在同一放大倍率下，对不同保存时间的角膜，各随机取6个视野，进行TUNEL阳性细胞记数。
4.透射电镜检查：分别于保存第3、5、7天，每组各取2个角膜片，每个角膜片的另一半行透射电镜观察。
, 百拇医药
5.M-K液和Optisol液保存人角膜的细胞凋亡检测：取眼库在M-K液和Optisol液中常规保存第4天的人角膜各2个，每个角膜的一半，按上述方法进行TUNEL原位标记，另一半行透射电镜观察。
6.统计学方法：采用F检验和q检验。
二、结果
1.角膜透明度及厚度：3种保存液保存3 、5、7d的角膜均可见轻度水肿、增厚，但外观保持透明或半透明。
2.TUNEL原位标记：所有阴性对照组均未见TUNEL阳性细胞；阳性对照组可见大量TUNEL阳性细胞。正常对照组有一个标本在较周边部的上皮细胞基底层可见几个TUNEL阳性细胞。3种保存液保存3、5、7 d的角膜，在上皮、基质及内皮细胞层均可见 TUNEL阳性细胞，其细胞计数见表1。在每种保存液保存不同时间的兔角膜TUNEL阳性细胞数比较，差异有显著性(M-K液，F=97.454, P<0.01；M-K+EGF液，F=49.301，P<0.01；Optisol液，F=83.167, P<0.01)。在3～7 d内，随着保存时间的延长，TUNEL阳性细胞数明显增加。M-K液和M-K+EGF液保存相同时间的角膜，其TUNEL阳性细胞数比较，差异均无显著性(保存3、5、7 d，F值分别为1.112、0.590、0.096，P>0.05)；而它们与Optisol液保存相同时间的角膜比较差异均有显著性(保存3、5、7 d，F值分别为14.205、15.622、18.348，P<0.01)。
, 百拇医药
表1 3种保存液中保存不同时间兔角膜的TUNEL阳性细胞数 组别
不同时间TUNEL阳性细胞数(
±s)
3 d
5 d
7 d
M-K液
4.67±0.82
19.67±2.50
36.33±4.03
M-K+EGF液
, 百拇医药
5.83±1.72
17.83±3.31
35.17±5.08
Optisol液
1.00±0.63
11.83±1.47
18.67±2.50
3.透射电镜检查：3种保存液保存3、5、7 d的角膜，在上皮、基质及内皮细胞层均可见典型的凋亡细胞。
4.M-K液和Optisol液保存人角膜的细胞凋亡检测：保存4 d的人角膜，其上皮、基质及内皮细胞层均可见TUNEL阳性细胞；透射电镜观察可见典型的凋亡细胞。
, 百拇医药
三、讨论
多年以来人们一直在探寻延长角膜保存时间的方法，细胞凋亡的概念为角膜保存研究提供了另一思路。我们应用光镜、电镜及TUNEL原位标记等检查方法证实，兔和人角膜中期保存过程中角膜上皮、基质及内皮细胞均有典型的细胞凋亡发生，并且在一定时间内，随着保存时间的延长，细胞凋亡发生率也明显增加。表明细胞凋亡是角膜中期保存过程中细胞丧失的一种可能机制。细胞凋亡的发生也很显然对角膜中期保存效果有一定的影响，而表皮生长因子在角膜中期保存过程中无阻止角膜细胞凋亡发生的作用。
基金项目：广州市科委重点科技攻关项目(98Z03101)
(收稿日期：1999-02-03), 百拇医药
单位：钟兴武(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)；龚向明(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)；杨培增(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)；刘祖国(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)；刘红山(广州市眼库)
关键词：
中华眼科杂志000220
一、 材料与方法
1.角膜中期保存液：采用M-K液，M-K+表皮生长因子(EGF，德国产品)液和Optisol液。
2.实验动物与角膜保存：纯种新西兰白兔10只，雌雄兼有，体重2.0～2.5 kg，处死后立即摘出眼球共20只，随机取2个角膜片，用4%的多聚甲醛固定作为正常对照。剩余的18个角膜片随机分为3组，每组6个角膜片。按常规角膜中期保存方法，分别置于 M-K液、M-K + EGF液和Optisol液内，4℃冰箱保存。
, http://www.100md.com
3.末端转移酶介导的DNA缺口生物素-dUTP标记法(TdT mediated biotin dUTP nick-end labelling, TUNEL)原位标记：保存第3、5、7天，每组各取2个角膜片，每个角膜片的一半用4%多聚甲醛固定，同正常对照的2个角膜片一样行常规石蜡包埋切片。组织切片按常规方法脱蜡、脱水，用0.5%胃蛋白酶，37℃下处理60 min，PBS轻洗2次；再加0.1%TritonX-100和0.1%枸橼酸钠液处理2 min，PBS轻洗2次；每个标本加入5 μl 的TUNEL酶和45 μl 的TUNEL标记的混和物，阴性对照组仅加TUNEL标记，阳性对照组在加入TUNEL反应混和物之前,先用DNaseⅠ在室温下处理10 min；最后将其置入37℃湿房中30 min，再用 PBS轻洗3次，加盖玻片。用荧光显微镜，在同一放大倍率下，对不同保存时间的角膜，各随机取6个视野，进行TUNEL阳性细胞记数。
4.透射电镜检查：分别于保存第3、5、7天，每组各取2个角膜片，每个角膜片的另一半行透射电镜观察。
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5.M-K液和Optisol液保存人角膜的细胞凋亡检测：取眼库在M-K液和Optisol液中常规保存第4天的人角膜各2个，每个角膜的一半，按上述方法进行TUNEL原位标记，另一半行透射电镜观察。
6.统计学方法：采用F检验和q检验。
二、结果
1.角膜透明度及厚度：3种保存液保存3 、5、7d的角膜均可见轻度水肿、增厚，但外观保持透明或半透明。
2.TUNEL原位标记：所有阴性对照组均未见TUNEL阳性细胞；阳性对照组可见大量TUNEL阳性细胞。正常对照组有一个标本在较周边部的上皮细胞基底层可见几个TUNEL阳性细胞。3种保存液保存3、5、7 d的角膜，在上皮、基质及内皮细胞层均可见 TUNEL阳性细胞，其细胞计数见表1。在每种保存液保存不同时间的兔角膜TUNEL阳性细胞数比较，差异有显著性(M-K液，F=97.454, P<0.01；M-K+EGF液，F=49.301，P<0.01；Optisol液，F=83.167, P<0.01)。在3～7 d内，随着保存时间的延长，TUNEL阳性细胞数明显增加。M-K液和M-K+EGF液保存相同时间的角膜，其TUNEL阳性细胞数比较，差异均无显著性(保存3、5、7 d，F值分别为1.112、0.590、0.096，P>0.05)；而它们与Optisol液保存相同时间的角膜比较差异均有显著性(保存3、5、7 d，F值分别为14.205、15.622、18.348，P<0.01)。
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表1 3种保存液中保存不同时间兔角膜的TUNEL阳性细胞数 组别
不同时间TUNEL阳性细胞数(
±s)3 d
5 d
7 d
M-K液
4.67±0.82
19.67±2.50
36.33±4.03
M-K+EGF液
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5.83±1.72
17.83±3.31
35.17±5.08
Optisol液
1.00±0.63
11.83±1.47
18.67±2.50
3.透射电镜检查：3种保存液保存3、5、7 d的角膜，在上皮、基质及内皮细胞层均可见典型的凋亡细胞。
4.M-K液和Optisol液保存人角膜的细胞凋亡检测：保存4 d的人角膜，其上皮、基质及内皮细胞层均可见TUNEL阳性细胞；透射电镜观察可见典型的凋亡细胞。
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三、讨论
多年以来人们一直在探寻延长角膜保存时间的方法，细胞凋亡的概念为角膜保存研究提供了另一思路。我们应用光镜、电镜及TUNEL原位标记等检查方法证实，兔和人角膜中期保存过程中角膜上皮、基质及内皮细胞均有典型的细胞凋亡发生，并且在一定时间内，随着保存时间的延长，细胞凋亡发生率也明显增加。表明细胞凋亡是角膜中期保存过程中细胞丧失的一种可能机制。细胞凋亡的发生也很显然对角膜中期保存效果有一定的影响，而表皮生长因子在角膜中期保存过程中无阻止角膜细胞凋亡发生的作用。
基金项目：广州市科委重点科技攻关项目(98Z03101)
(收稿日期：1999-02-03), 百拇医药