睫状神经营养因子对应激引起行为障碍的作用
作者：严进 路长林 何成 王雪琦 黄爱军 王成海
单位：
关键词：睫状神经营养因子；应激；开场行为
中国行为医学科学000201【摘要】 目的 探讨睫状神经营养因子对应激引起行为障碍的作用。方法 采用open field测定，观察急性和慢性足底电击应激大鼠的open field行为变化，及双侧海马注射睫状神经营养因子对其影响。结果 急性应激大鼠open field行为活动增加,慢性应激大鼠open field行为活动减少；睫状神经营养因子对对照组大鼠和急性应激大鼠的open field行为无明显作用，但可显著改善慢性应激大鼠的行为障碍。结论 适宜浓度的睫状神经营养因子可改善慢性应激大鼠的行为障碍。
Effects of ciliary neurotrophic factor on behavioral disorder induced by chronic stress in rat
, http://www.100md.com
Yan Jin, Lu Changlin, He Cheng,et al.
(Dept. of Neurobiology, Second Military University, Shanghai 200433)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of ciliary neurotrophic factor (CNTF) on behavioral disorder induced by stress in rat. Methods The irregular light and footshocks were applied to rats for 7 days with first day as acute stress and final day as chronic stress. The effects of 0Uμl-1, 100Uμl-1, 500Uμl-1 and 1000Uμl-1 CNTF administrated daily into bilateral hippocampus before stress on the changes were observed by open field test. Results The open field behaviors were increase during acute stress and decrease during chronic stress in rats. Any concentration of CNTF administratedinto bilateral hippocampus had no effect to behaviors in control and acute stressful rats. But 500Uμl-1 and 1000Uμl-1CNTF significantly raised depressive behavior induced by chronic stress. Conclusion 500Uμl-1 and 1000Uμl-1 CNTF could improve behavioral disorder induced by chronic stress.
, 百拇医药
【Key words】 Ciliary neurotrophic factor Stress Open-field behavior
我们曾提出，应激可以引起中枢神经元的形态产生变化[1～3]。时至今日已有许多证据表明，慢性的躯体性、心理性或复合应激都可能导致海马神经元形态改变，甚至死亡[4～5]。应激引起的海马神经细胞损伤，既可能是诸多诱因的一个结果，也可能是许多继发反应的一个原因。应激对整体动物生理功能的影响中也包括与海马相关的功能障碍。因此保护海马神经元免受伤害，可能是防治应激相关疾病的重要措施之一。
睫状神经营养因子(CNTF)是与神经生长因子(NGF)家族无同源性的另一类神经营养因子，其特点有：(1) CNTF基因转录起始点(tsp)上游有与应激关系密切的Jun和Fos家族的二聚体结合位点5'-TGAGTCA；(2) 在中枢，海马是CNTF受体分布较多的脑区之一。我们已有的工作表明，应激时海马谷氨酸(Glu)水平显著升高[6]，CNTF可通过影响Glu离子型通道和细胞内钙库对Ca++的摄取，抑制Glu引起的胞浆Ca++浓度升高，从而对原代培养的海马神经元有保护作用。因此本实验旨在观察，在整体动物，CNTF是否能减轻应激引起的表观行为障碍，从而探讨CNTF在应激反应中的作用。
, 百拇医药
材料和方法
一、动物 雄性Sprague-Dawley大鼠,体重180～220g(由上海市计划生育研究所实验动物中心提供),自由饮食,在光/暗周期为12hr/12hr(光照时间0600～1800hr), 背景噪音(40±10db)、温度(20±3℃)条件限制下饲养。
二、双侧海马给药方法及动物应激方式 动物在戊巴比妥钠(35mg/kg,腹腔注射)麻醉下，按L.J.Pellegrino鼠脑定向图谱，经江湾I-C型立体定向仪引导，双侧埋植微量注射套管(以前囟为中点，AP-0.2，LR±2.5，H2.0)。术后七天的清醒动物进行如下实验。所有动物适应环境一周并筛选之后被随机分组：对照组，实验中动物除不接受电击外，余与实验组相同；应激组，动物在每50s内随机接受一次光照和足底电击；CNTF+应激组(CNTF为0、100、500、1000 Uμl-1);CNTF+对照组。在应激实验开始前2天，每天于双侧海马各注射1μl CNTF(本室基因工程产品)。高压恒流刺激仪电刺激参数：波宽2ms，频率50Hz，串长1s，电流2.0mA。每只大鼠一次实验为30min，每次实验在8:00～12:30进行，持续一周。根据文献将电刺激第一天视为急性应激期，第七天视为慢性应激期。
, 百拇医药
三、open-field行为测定 分别在应激实验前一天(D-1)、第一天(D1)和第七天(D7)，测定实验动物的open-field行为。每只动物仅做一次行为测定,每组动物为12只。
四、资料的统计学处理 实验结果均采用均数±标准差(
±s)表示， 两组均数间比较用t检验，多组间比较用F检验。
结 果
一、应激动物的行为变化 图1显示了实验组大鼠在急性应激期(D1)的水平运动和垂直活动都增加，而慢性应激期的水平运动和垂直活动都减少至低于对照组(每组n=12)。
, 百拇医药
图1. 大鼠应激时的open field行为的变化
二、 CNTF对对照组大鼠行为的作用 如图2所示，CNTF对对照组大鼠行为无明显作用(每组n=12)。
图2.CNTF对对照组大鼠open field行为的影响
三、CNTF对应激大鼠行为障碍的影响
1.CNTF对急性应激大鼠焦虑样行为的作用 图3表明, CNTF对急性应激大鼠的兴奋或焦虑样行为也无明显作用(每组n=12)。
, 百拇医药
图3.CNTF对急性应激(D1)大鼠open field行为的影响
2.CNTF对慢性应激大鼠抑郁样行为的作用 从图4的结果可以看出，CNTF对慢性应激大鼠抑郁样行为都有非常明显的改善作用，使之接近应激前水平(每组n=12)。
**: P<0.01, vs group injected with 0 Uμl-1 ( n=12)
图4.CNTF对慢性应激(D7)大鼠open field行为的影响
讨 论
以往的研究表明，在多种应激方式下动物都可产生行为障碍。应激导致的行为障碍随应激时程长短而有不同表现，急性应激可导致动物行为活动增加，慢性应激可导致行为活动减少。本实验结果与文献报道一致。
, http://www.100md.com
动物随应激源刺激的时程延长，其行为表现为由兴奋、焦虑状态转变为抑制、抑郁状态。虽然这一现象已被大多数研究者认可，但对于这一转变过程，至今尚未作出较为合理的解释。由于动物的行为与中枢神经系统关系最为密切，因此中枢神经系统受到大多数研究者的关注。
动物在急性应激期，与行为相关的脑区神经元尚未受损，中枢神经系统仍保持其完整性。因此，中枢神经递质系统和神经内分泌系统功能活动加强。而在慢性应激期，机体(尤其是中枢神经系统)在调动各种代偿机制应对过程中，中枢内一些物质持续作用的负效应，随应激时程延长而逐渐显现出来。国外一些学者和我们的以往研究表明，慢性应激时海马内Glu长期处于显著高于基础值的水平[6～7]。当海马Glu水平升高时，在短时间内可兴奋神经元，加强突触传递，而Glu水平持续升高，则引起受体过度兴奋，产生兴奋性毒作用，导致神经元死亡。Glu对细胞的损害作用还表现在抑制海马神经元的保护因子的合成与释放[9]。应激引起海马的NTFsmRNA减少，而Glu的non-NMDA受体参与介导海马神经元NTF表达和释放。另外，Glu脱羧酶与NTFsmRNA在海马神经细胞内共存。这些报道都强烈提示，海马的持续性高水平Glu，对海马神经元有损害作用。这种损害作用不仅是Glu本身直接作为攻击因子，作用于受损细胞，引发细胞损伤反应，而且还通过抑制保护因子(如NTFs等)的合成和释放，降低受损细胞的抗伤害能力，从而使细胞更易受到伤害性攻击。
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我们的实验结果表明，CNTF不仅对正常动物的行为无影响，而且对短时应激的行为障碍也无影响。但在慢性应激期则不同，给予500nμ/μl以上剂量CNTF后，动物的抑郁样行为有明显改善。表现为自发活动增加，提示运动活性增加;探究行为增加，提示对新异环境的兴趣增加。CNTF对急性应激大鼠的行为变化无影响，而对慢性应激导致的抑郁样行为有改善的这一效应，可能与本实验所观察到的海马神经元在不同应激期的形态变化有关。
有文献报道，有些内源性神经营养因子在损伤时，细胞虽然大量表达，包括CNTF、NGF、成纤维细胞生长抑因子等，但这种内源性CNTF不能激活其受体，也不能抵抗兴奋性毒性引起的神经损害[10]。外源性CNTF则不同，它可使神经元LIFRβ与gp130磷酸化，处于激活状态。同时外源性CNTF可使星形细胞上出现这些受体(可能是封闭受体被暴露)，并被CNTF激活，而星形细胞对维持神经元的存活有重要意义。CNTF对海马神经元无损伤的正常大鼠和急性应激大鼠行为不产生作用这一结果提示，CNTF极可能是通过保护海马神经元，从而改善慢性应激动物的表观抑郁样行为。
, 百拇医药
本实验结果结合我们以往的研究及国外文献资料，可以有根据地推论：慢性应激可以导致海马神经元损伤；慢性应激时海马Glu持续高水平可能是启动这一损伤过程的一个重要因素；CNTF可以保护海马神经元，减轻慢性应激导致的损害，从而改善慢性应激动物的表观行为。
参考文献
1，严进，王春安，陈宜张，等.躯体性和心理性应激对大鼠血浆皮质酮变化的影响.心理学报，1991，23(4)：418～425.
2，王旭民，严进，陈坚，等.血浆糖皮质激素升高条件下海马神经元的形态变化.解剖学杂志，1991，14(4)：330～333.
3，朱成，严进，刘淑琴，等.大鼠下丘脑视交叉上核内加压素神经元心理应激后的变化.解剖学杂志，1992，15(6)：434～436.
4，Mizoguchi K, Kunishita T, Chui DH, et al. Stress induced neural death in the hippocampus of castrated rat. Neurosci.Lett, 1992,138:157～160.
, http://www.100md.com
5，Markowitsch HJ, Kessler J, Van-Der-Ven C, et al. Psychic trauma causing grossly reduced brain metabolism and cognitive deterioration. Neuropsychologia, 1998,36:77～82.
6，严进，王春安，陈宜张，等.应激对大鼠行为和部分脑区谷氨酸含量的影响.心理学报，1995，27(4)：422～427.
7，Moghaddam B, Bolinao ML, Stein-Behrens B, et al. Glucocorticoids mediate the stress-induced extracellular accumulation of glutamate. Brain Res， 1994,655(1～2)：251～254.
, 百拇医药 8，罗焕敏.海马结构：从形态、功能到可塑性、衰老性变化.神经解剖学杂志，1996，12(2)：177～184 .
9，Smith MA, Makino S, Kvetnansky R, et al. Effects of stress on neurotrophic factor expression in the rat brain. Ann.N.Y.Aced Sci. 1995,771:234～239.
10，Rhdge JS, Pasnikowski EM, Holst P, et al. Change in neurotrophic factoe expression and receptor activation following exposure of hippocampal neuron/astrocyte cocultures to kainic acid. J Neurosci， 1995,15:6856～6867.
(收稿日期：1999-10-25), 百拇医药
单位：
关键词：睫状神经营养因子；应激；开场行为
中国行为医学科学000201【摘要】 目的 探讨睫状神经营养因子对应激引起行为障碍的作用。方法 采用open field测定，观察急性和慢性足底电击应激大鼠的open field行为变化，及双侧海马注射睫状神经营养因子对其影响。结果 急性应激大鼠open field行为活动增加,慢性应激大鼠open field行为活动减少；睫状神经营养因子对对照组大鼠和急性应激大鼠的open field行为无明显作用，但可显著改善慢性应激大鼠的行为障碍。结论 适宜浓度的睫状神经营养因子可改善慢性应激大鼠的行为障碍。
Effects of ciliary neurotrophic factor on behavioral disorder induced by chronic stress in rat
, http://www.100md.com
Yan Jin, Lu Changlin, He Cheng,et al.
(Dept. of Neurobiology, Second Military University, Shanghai 200433)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of ciliary neurotrophic factor (CNTF) on behavioral disorder induced by stress in rat. Methods The irregular light and footshocks were applied to rats for 7 days with first day as acute stress and final day as chronic stress. The effects of 0Uμl-1, 100Uμl-1, 500Uμl-1 and 1000Uμl-1 CNTF administrated daily into bilateral hippocampus before stress on the changes were observed by open field test. Results The open field behaviors were increase during acute stress and decrease during chronic stress in rats. Any concentration of CNTF administratedinto bilateral hippocampus had no effect to behaviors in control and acute stressful rats. But 500Uμl-1 and 1000Uμl-1CNTF significantly raised depressive behavior induced by chronic stress. Conclusion 500Uμl-1 and 1000Uμl-1 CNTF could improve behavioral disorder induced by chronic stress.
, 百拇医药
【Key words】 Ciliary neurotrophic factor Stress Open-field behavior
我们曾提出，应激可以引起中枢神经元的形态产生变化[1～3]。时至今日已有许多证据表明，慢性的躯体性、心理性或复合应激都可能导致海马神经元形态改变，甚至死亡[4～5]。应激引起的海马神经细胞损伤，既可能是诸多诱因的一个结果，也可能是许多继发反应的一个原因。应激对整体动物生理功能的影响中也包括与海马相关的功能障碍。因此保护海马神经元免受伤害，可能是防治应激相关疾病的重要措施之一。
睫状神经营养因子(CNTF)是与神经生长因子(NGF)家族无同源性的另一类神经营养因子，其特点有：(1) CNTF基因转录起始点(tsp)上游有与应激关系密切的Jun和Fos家族的二聚体结合位点5'-TGAGTCA；(2) 在中枢，海马是CNTF受体分布较多的脑区之一。我们已有的工作表明，应激时海马谷氨酸(Glu)水平显著升高[6]，CNTF可通过影响Glu离子型通道和细胞内钙库对Ca++的摄取，抑制Glu引起的胞浆Ca++浓度升高，从而对原代培养的海马神经元有保护作用。因此本实验旨在观察，在整体动物，CNTF是否能减轻应激引起的表观行为障碍，从而探讨CNTF在应激反应中的作用。
, 百拇医药
材料和方法
一、动物 雄性Sprague-Dawley大鼠,体重180～220g(由上海市计划生育研究所实验动物中心提供),自由饮食,在光/暗周期为12hr/12hr(光照时间0600～1800hr), 背景噪音(40±10db)、温度(20±3℃)条件限制下饲养。
二、双侧海马给药方法及动物应激方式 动物在戊巴比妥钠(35mg/kg,腹腔注射)麻醉下，按L.J.Pellegrino鼠脑定向图谱，经江湾I-C型立体定向仪引导，双侧埋植微量注射套管(以前囟为中点，AP-0.2，LR±2.5，H2.0)。术后七天的清醒动物进行如下实验。所有动物适应环境一周并筛选之后被随机分组：对照组，实验中动物除不接受电击外，余与实验组相同；应激组，动物在每50s内随机接受一次光照和足底电击；CNTF+应激组(CNTF为0、100、500、1000 Uμl-1);CNTF+对照组。在应激实验开始前2天，每天于双侧海马各注射1μl CNTF(本室基因工程产品)。高压恒流刺激仪电刺激参数：波宽2ms，频率50Hz，串长1s，电流2.0mA。每只大鼠一次实验为30min，每次实验在8:00～12:30进行，持续一周。根据文献将电刺激第一天视为急性应激期，第七天视为慢性应激期。
, 百拇医药
三、open-field行为测定 分别在应激实验前一天(D-1)、第一天(D1)和第七天(D7)，测定实验动物的open-field行为。每只动物仅做一次行为测定,每组动物为12只。
四、资料的统计学处理 实验结果均采用均数±标准差(
±s)表示， 两组均数间比较用t检验，多组间比较用F检验。结 果
一、应激动物的行为变化 图1显示了实验组大鼠在急性应激期(D1)的水平运动和垂直活动都增加，而慢性应激期的水平运动和垂直活动都减少至低于对照组(每组n=12)。
, 百拇医药
图1. 大鼠应激时的open field行为的变化
二、 CNTF对对照组大鼠行为的作用 如图2所示，CNTF对对照组大鼠行为无明显作用(每组n=12)。
图2.CNTF对对照组大鼠open field行为的影响
三、CNTF对应激大鼠行为障碍的影响
1.CNTF对急性应激大鼠焦虑样行为的作用 图3表明, CNTF对急性应激大鼠的兴奋或焦虑样行为也无明显作用(每组n=12)。
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图3.CNTF对急性应激(D1)大鼠open field行为的影响
2.CNTF对慢性应激大鼠抑郁样行为的作用 从图4的结果可以看出，CNTF对慢性应激大鼠抑郁样行为都有非常明显的改善作用，使之接近应激前水平(每组n=12)。
**: P<0.01, vs group injected with 0 Uμl-1 ( n=12)
图4.CNTF对慢性应激(D7)大鼠open field行为的影响
讨 论
以往的研究表明，在多种应激方式下动物都可产生行为障碍。应激导致的行为障碍随应激时程长短而有不同表现，急性应激可导致动物行为活动增加，慢性应激可导致行为活动减少。本实验结果与文献报道一致。
, http://www.100md.com
动物随应激源刺激的时程延长，其行为表现为由兴奋、焦虑状态转变为抑制、抑郁状态。虽然这一现象已被大多数研究者认可，但对于这一转变过程，至今尚未作出较为合理的解释。由于动物的行为与中枢神经系统关系最为密切，因此中枢神经系统受到大多数研究者的关注。
动物在急性应激期，与行为相关的脑区神经元尚未受损，中枢神经系统仍保持其完整性。因此，中枢神经递质系统和神经内分泌系统功能活动加强。而在慢性应激期，机体(尤其是中枢神经系统)在调动各种代偿机制应对过程中，中枢内一些物质持续作用的负效应，随应激时程延长而逐渐显现出来。国外一些学者和我们的以往研究表明，慢性应激时海马内Glu长期处于显著高于基础值的水平[6～7]。当海马Glu水平升高时，在短时间内可兴奋神经元，加强突触传递，而Glu水平持续升高，则引起受体过度兴奋，产生兴奋性毒作用，导致神经元死亡。Glu对细胞的损害作用还表现在抑制海马神经元的保护因子的合成与释放[9]。应激引起海马的NTFsmRNA减少，而Glu的non-NMDA受体参与介导海马神经元NTF表达和释放。另外，Glu脱羧酶与NTFsmRNA在海马神经细胞内共存。这些报道都强烈提示，海马的持续性高水平Glu，对海马神经元有损害作用。这种损害作用不仅是Glu本身直接作为攻击因子，作用于受损细胞，引发细胞损伤反应，而且还通过抑制保护因子(如NTFs等)的合成和释放，降低受损细胞的抗伤害能力，从而使细胞更易受到伤害性攻击。
, http://www.100md.com
我们的实验结果表明，CNTF不仅对正常动物的行为无影响，而且对短时应激的行为障碍也无影响。但在慢性应激期则不同，给予500nμ/μl以上剂量CNTF后，动物的抑郁样行为有明显改善。表现为自发活动增加，提示运动活性增加;探究行为增加，提示对新异环境的兴趣增加。CNTF对急性应激大鼠的行为变化无影响，而对慢性应激导致的抑郁样行为有改善的这一效应，可能与本实验所观察到的海马神经元在不同应激期的形态变化有关。
有文献报道，有些内源性神经营养因子在损伤时，细胞虽然大量表达，包括CNTF、NGF、成纤维细胞生长抑因子等，但这种内源性CNTF不能激活其受体，也不能抵抗兴奋性毒性引起的神经损害[10]。外源性CNTF则不同，它可使神经元LIFRβ与gp130磷酸化，处于激活状态。同时外源性CNTF可使星形细胞上出现这些受体(可能是封闭受体被暴露)，并被CNTF激活，而星形细胞对维持神经元的存活有重要意义。CNTF对海马神经元无损伤的正常大鼠和急性应激大鼠行为不产生作用这一结果提示，CNTF极可能是通过保护海马神经元，从而改善慢性应激动物的表观抑郁样行为。
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本实验结果结合我们以往的研究及国外文献资料，可以有根据地推论：慢性应激可以导致海马神经元损伤；慢性应激时海马Glu持续高水平可能是启动这一损伤过程的一个重要因素；CNTF可以保护海马神经元，减轻慢性应激导致的损害，从而改善慢性应激动物的表观行为。
参考文献
1，严进，王春安，陈宜张，等.躯体性和心理性应激对大鼠血浆皮质酮变化的影响.心理学报，1991，23(4)：418～425.
2，王旭民，严进，陈坚，等.血浆糖皮质激素升高条件下海马神经元的形态变化.解剖学杂志，1991，14(4)：330～333.
3，朱成，严进，刘淑琴，等.大鼠下丘脑视交叉上核内加压素神经元心理应激后的变化.解剖学杂志，1992，15(6)：434～436.
4，Mizoguchi K, Kunishita T, Chui DH, et al. Stress induced neural death in the hippocampus of castrated rat. Neurosci.Lett, 1992,138:157～160.
, http://www.100md.com
5，Markowitsch HJ, Kessler J, Van-Der-Ven C, et al. Psychic trauma causing grossly reduced brain metabolism and cognitive deterioration. Neuropsychologia, 1998,36:77～82.
6，严进，王春安，陈宜张，等.应激对大鼠行为和部分脑区谷氨酸含量的影响.心理学报，1995，27(4)：422～427.
7，Moghaddam B, Bolinao ML, Stein-Behrens B, et al. Glucocorticoids mediate the stress-induced extracellular accumulation of glutamate. Brain Res， 1994,655(1～2)：251～254.
, 百拇医药 8，罗焕敏.海马结构：从形态、功能到可塑性、衰老性变化.神经解剖学杂志，1996，12(2)：177～184 .
9，Smith MA, Makino S, Kvetnansky R, et al. Effects of stress on neurotrophic factor expression in the rat brain. Ann.N.Y.Aced Sci. 1995,771:234～239.
10，Rhdge JS, Pasnikowski EM, Holst P, et al. Change in neurotrophic factoe expression and receptor activation following exposure of hippocampal neuron/astrocyte cocultures to kainic acid. J Neurosci， 1995,15:6856～6867.
(收稿日期：1999-10-25), 百拇医药