端粒酶活性在肺癌中表达的临床研究
作者：徐晓玲 戴海明 夏淮玲 祝怀平 吴竟生 崔皖芳
单位：徐晓玲 夏淮玲 崔皖芳(230001 合肥，安徽省立医院呼吸内科)；戴海明 祝怀平 吴竟生(中心实验室)
关键词：端粒酶；肺肿瘤
中国肺癌杂志000204 【摘要】 目的 研究端粒酶活性在肺癌中的表达及临床应用价值。方法 应用改良PCR-ELISA法对29例经临床及胸部X光片和CT检查高度怀疑为肺癌的患者通过纤维支气管镜所取的病变组织进行端粒酶活性检测，同时行病理学、支刷脱落细胞和抗酸杆菌检查。结果 病理证实为肺癌的22例中有18例端粒酶活性表达阳性，阳性率为81.81%；4例异型细胞中端粒酶活性表达阳性1例；2例慢性炎症中端粒酶活性表达阳性1例；1例肺结核患者端粒酶活性表达阴性。12例淋巴结转移的患者均呈端粒酶活性表达阳性，10例无淋巴结转移的患者中6例表达阳性，其差异有显著性(P<0.05)。结论 端粒酶的活化不仅与肺癌的发生、发展有关，可以作为肺癌的标志物，并与肺癌的浸润转移有关，有临床应用价值。
, 百拇医药
Expression of telomerase activity in human lung cancer
XU Xiaoling, DAI Haiming, XIA Huailing, ZHU Huaiping, WU Jingsheng, CUI Wanfang. Department of Respiratory Diseases, Anhui Provincial Hospital, Hefei, Anhui 230001, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of telomerase activity in lung cancer tissue and the correlation with the oncogenesis, progression and metastasis of lung cancer. Methods Telomerase activity in specimens obtained by fiberbrochoscopy from 29 patients with suspected lung cancer was detected by polymerase chain reaction-ELISA. Resutls The telomerase activity was positive in 18 cases of primary lung cancer and the positive rate was 81.81%(18/22). Two of other seven specimens were positive for telomerase activity. Twelve lung cancer cases with lymph node metastasis showed positive expression, whereas only 6 of 10 cases without lymph node metastasis showed positive expression. Conclusion Telomerase activity may be useful both as a diagnostic marker to detect the existence of lung cancer and as a potential of high risk for lymph node metastasis.
, 百拇医药
【Key words】 Telomerase activity Lung neoplasms
肺癌是恶性程度和发病率均较高的肿瘤之一，尽管人们进行了大量的研究，现有的肺癌肿瘤标记物在早期诊断、监测转移和估计预后方面均有所不足。近年的研究发现，人类绝大部分恶性肿瘤都有端粒酶活性表达[1]，而正常的体细胞则无，提示端粒酶可以作为肿瘤的标志物。我们用改良PCR-ELISA法检测经纤维支气管镜所取病变组织的端粒酶的活性表达，探讨其与肺癌发生、发展的关系，以及临床应用的价值。
1 资料和方法
1.1 临床资料 本组共有29例经临床及胸部X线片和CT检查高度怀疑为肺癌的患者，在纤维支气管镜下可见新生物、粘膜肥厚、僵硬和管腔狭窄，其中男性21例，女性8例，平均年龄(58±5.32)岁(37～77岁)；21例有吸烟史。
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1.2 方法 用Olympus BFB3R型纤维支气管镜在病变部位取组织行病理检查、支刷脱落细胞学和抗酸杆菌检查，将端粒酶检测用活组织放入-80℃冻存。
1.3 主要试剂 PCR-ELISA端粒酶检测试剂盒购于Boehringer Mannheim公司。
1.4 实验方法 按照Kim等[2]描述的PCR-ELISA法进行改良，检测病变组织的端粒酶活性。
1.4.1 端粒酶的提取 取标本(约10～20mg)加入100μl裂解液，匀浆器打匀，冰溶30min后，在4℃、12000r/min离心机上离心20min，取上清液检测。
1.4.2 RT-PCR扩增 取上清液2μl，加入48μl效应体系，包括dNTP酶，生物素标记的引物Ⅰ和引物Ⅱ。经25℃30min，94℃5min，50℃30min，72℃90s，循环30次，最后72℃10min。
, 百拇医药
1.4.3 扩增产物的检测 取5μl扩增产物，加变性液20μl，室温下孵育10min，加入225μl杂交液(含有地高辛标记的特异探针)，充分混匀，吸取100μl混合液加入抗生物素蛋白包被的微孔板中，加入与过氧化物酶结合的抗地高辛抗体(anti-DIG-PODase)100μl，18～22℃30min，最后加入100μlPODase的底物TMG显色10min，加入终止液终止反应，测量450nm和690nm处的吸光度(A450nm和A690nm)，计算其差值A(A＝A450nm-A690nm)。
1.4.4 阳性标准 A≥0.2为阳性，弱阳性(+)为0.2≤A<0.4，阳性(++)为0.4≤A<1，强阳性(+++)为A≥1。
1.5 数据处理 采用四格表的直接计算概率法。
2 结果
, 百拇医药
2.1 端粒酶活性表达 29例患者经纤维支气管镜活检病理证实为肺癌22例(鳞癌15例，腺癌4例，小细胞肺癌3例)，异型细胞4例，慢性炎症2例，支刷找到抗酸杆菌1例。22例肺癌组织中18例端粒酶活性表达阳性，阳性率为81.81%，其中小细胞肺癌为66.67%(2/3)，非小细胞肺癌为84.21%(16/19)；慢性炎症和异型细胞中各有1例端粒酶活性表达阳性，肺结核患者端粒酶活性表达阴性。端粒酶活性阳性表达与病理结果的关系见表1。
表1 端粒酶活性表达与肺癌病理组织分类的关系
Tab 1 Relation between telomerase activity
and pathological classification of lung cancer Pathology
No. of
, http://www.100md.com
cases
+++
++
+
No. of positive cases
(positive rate)
Squamous cell carcinoma
15
1
8
4
13(86.67%)
, 百拇医药
Adenocarcinoma
4
1
2
3(75%)
Small cell lung cancer
3
1
1
2(66.67%)
Atypical cells
4
, 百拇医药 1
1(25%)
Chronic inflammation
3
1
1(33.33%)
2.2 端粒酶活性表达与肺癌淋巴结转移和临床分期的关系 在22例病理证实为肺癌的患者中，根据胸部CT检查发现12例有淋巴结转移，12例端粒酶均呈阳性表达；10例无淋巴结转移的患者中，6例为阳性，差异有显著性(P<0.05)。根据1997年国际抗癌联盟制订的TNM分期标准[3]，22例肺癌患者中有Ⅰ期9例，Ⅱ期6例，Ⅲ期6例，Ⅳ期1例，在Ⅰ期中有5例端粒酶表达阳性，Ⅱ～Ⅳ期的13例患者全部呈阳性表达，其中3例Ⅲ或Ⅳ期患者端粒酶活性表达呈强阳性(表2)。表2 端粒酶阳性表达与肺癌病理特征的关系
, http://www.100md.com
Tab 2 Relation between telomerase activity
and pathological characteristics of lung cancer Pathological charcteristics
No. of
cases
+++
++
+
No. of positive cases
(positive rate)
Lymph node metastasis
, 百拇医药
N0
10
4
2
6(60%)
N1
5
3
2
5(100%)
N2
6
2
4
, http://www.100md.com
6(100%)
N3
1
1
1(100%)
Stage
Ⅰ
9
3
2
5(55.55%)
Ⅱ
6
, 百拇医药
4
2
6(100%)
Ⅲ
6
2
4
6(100%)
Ⅳ
1
1
1(100%)
3 讨论
, 百拇医药 端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的特殊逆转录酶，与真核生物细胞线状染色体末端特定的核苷酸序列和结构即端粒的合成有关。端粒对染色体的稳定和末断复制具有重要的作用。研究表明人类发生的大部分恶性肿瘤都有端粒酶活性的表达[4]，因此提出了恶性肿瘤发生的端粒酶学说，认为端粒酶的激活是细胞获得无限增殖能力的共同途径。国外学者对肺癌的研究结果显示，非小细胞肺癌端粒酶活性表达为81.8%，小细胞肺癌为100%，癌旁组织为4.4%，同时发现小细胞肺癌与非小细胞肺癌活性强度有差异，小细胞肺癌为强阳性，非小细胞肺癌为弱到中度阳性[5]。本研究观察到肺癌端粒酶活性阳性表达为81.81%，非小细胞肺癌为84.21%(16/19)，小细胞肺癌为66.66%(2/3)，活性强度与组织类型无明显关系，可能与本组例数较少有关。研究结果表明端粒酶活性与淋巴结转移有一定的关系，在12例发生淋巴结转移的患者，端粒酶活性均呈阳性表达，而无淋巴结转移的10例患者中仅6例阳性，两组间有显著差异，这预示端粒酶有可能作为诊断肺癌淋巴结转移的辅助指标；此外，本研究还观察到Ⅱ～Ⅳ期肺癌患者端粒酶均为阳性，且分期越高，活性表达越强，提示端粒酶的活化不仅与肺癌的发生有关，且可作为肺癌的标志物，并对预后的推测有一定的价值。
, 百拇医药
在本组资料中有1例慢性炎症和1例异型细胞患者端粒酶呈阳性表达，该2例患者经随访证实1例为类癌。由于经纤维支气管镜取材不易，所取的组织较少或是表浅组织，肺癌组织病理检查可能会得到假阴性结果[6]；而端粒酶检测所采用的PCR-ELISA法具有敏感性高、特异性强的特点，只要在癌肿病变部位取到组织就可能呈阳性表达，因此在这种情况下对诊断尤其具有重要的意义。
综上所述，我们认为端粒酶的活化不仅与肺癌的发生、发展有关，可以作为肺癌的标志物，并与肺癌的浸润转移有关，有临床应用价值。
参 考 文 献
1，莫晓能.端粒、端粒酶与肺癌.国外医学呼吸系统分册，1998，18(1)∶11-13.
2，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science,1994,266(5193)∶2011-2015.
, 百拇医药
3，吴怀申.肺癌最新TNM分类和分期.中国肿瘤临床，1998，20(5)∶398-401.
4，Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase in Tetrahymena extracts. Cell,1985,43(2)∶405-413.
5，Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. Telomerase activity in small cell and non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst,1995,87(12)∶895-902.
6，林耀广，刘春艳，王虹，等.肺癌在支气管镜下的特征.中华内科杂志，37(4)∶235-238.
(收稿：1999-11-02 修回：2000-03-18), 百拇医药
单位：徐晓玲 夏淮玲 崔皖芳(230001 合肥，安徽省立医院呼吸内科)；戴海明 祝怀平 吴竟生(中心实验室)
关键词：端粒酶；肺肿瘤
中国肺癌杂志000204 【摘要】 目的 研究端粒酶活性在肺癌中的表达及临床应用价值。方法 应用改良PCR-ELISA法对29例经临床及胸部X光片和CT检查高度怀疑为肺癌的患者通过纤维支气管镜所取的病变组织进行端粒酶活性检测，同时行病理学、支刷脱落细胞和抗酸杆菌检查。结果 病理证实为肺癌的22例中有18例端粒酶活性表达阳性，阳性率为81.81%；4例异型细胞中端粒酶活性表达阳性1例；2例慢性炎症中端粒酶活性表达阳性1例；1例肺结核患者端粒酶活性表达阴性。12例淋巴结转移的患者均呈端粒酶活性表达阳性，10例无淋巴结转移的患者中6例表达阳性，其差异有显著性(P<0.05)。结论 端粒酶的活化不仅与肺癌的发生、发展有关，可以作为肺癌的标志物，并与肺癌的浸润转移有关，有临床应用价值。
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Expression of telomerase activity in human lung cancer
XU Xiaoling, DAI Haiming, XIA Huailing, ZHU Huaiping, WU Jingsheng, CUI Wanfang. Department of Respiratory Diseases, Anhui Provincial Hospital, Hefei, Anhui 230001, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of telomerase activity in lung cancer tissue and the correlation with the oncogenesis, progression and metastasis of lung cancer. Methods Telomerase activity in specimens obtained by fiberbrochoscopy from 29 patients with suspected lung cancer was detected by polymerase chain reaction-ELISA. Resutls The telomerase activity was positive in 18 cases of primary lung cancer and the positive rate was 81.81%(18/22). Two of other seven specimens were positive for telomerase activity. Twelve lung cancer cases with lymph node metastasis showed positive expression, whereas only 6 of 10 cases without lymph node metastasis showed positive expression. Conclusion Telomerase activity may be useful both as a diagnostic marker to detect the existence of lung cancer and as a potential of high risk for lymph node metastasis.
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【Key words】 Telomerase activity Lung neoplasms
肺癌是恶性程度和发病率均较高的肿瘤之一，尽管人们进行了大量的研究，现有的肺癌肿瘤标记物在早期诊断、监测转移和估计预后方面均有所不足。近年的研究发现，人类绝大部分恶性肿瘤都有端粒酶活性表达[1]，而正常的体细胞则无，提示端粒酶可以作为肿瘤的标志物。我们用改良PCR-ELISA法检测经纤维支气管镜所取病变组织的端粒酶的活性表达，探讨其与肺癌发生、发展的关系，以及临床应用的价值。
1 资料和方法
1.1 临床资料 本组共有29例经临床及胸部X线片和CT检查高度怀疑为肺癌的患者，在纤维支气管镜下可见新生物、粘膜肥厚、僵硬和管腔狭窄，其中男性21例，女性8例，平均年龄(58±5.32)岁(37～77岁)；21例有吸烟史。
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1.2 方法 用Olympus BFB3R型纤维支气管镜在病变部位取组织行病理检查、支刷脱落细胞学和抗酸杆菌检查，将端粒酶检测用活组织放入-80℃冻存。
1.3 主要试剂 PCR-ELISA端粒酶检测试剂盒购于Boehringer Mannheim公司。
1.4 实验方法 按照Kim等[2]描述的PCR-ELISA法进行改良，检测病变组织的端粒酶活性。
1.4.1 端粒酶的提取 取标本(约10～20mg)加入100μl裂解液，匀浆器打匀，冰溶30min后，在4℃、12000r/min离心机上离心20min，取上清液检测。
1.4.2 RT-PCR扩增 取上清液2μl，加入48μl效应体系，包括dNTP酶，生物素标记的引物Ⅰ和引物Ⅱ。经25℃30min，94℃5min，50℃30min，72℃90s，循环30次，最后72℃10min。
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1.4.3 扩增产物的检测 取5μl扩增产物，加变性液20μl，室温下孵育10min，加入225μl杂交液(含有地高辛标记的特异探针)，充分混匀，吸取100μl混合液加入抗生物素蛋白包被的微孔板中，加入与过氧化物酶结合的抗地高辛抗体(anti-DIG-PODase)100μl，18～22℃30min，最后加入100μlPODase的底物TMG显色10min，加入终止液终止反应，测量450nm和690nm处的吸光度(A450nm和A690nm)，计算其差值A(A＝A450nm-A690nm)。
1.4.4 阳性标准 A≥0.2为阳性，弱阳性(+)为0.2≤A<0.4，阳性(++)为0.4≤A<1，强阳性(+++)为A≥1。
1.5 数据处理 采用四格表的直接计算概率法。
2 结果
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2.1 端粒酶活性表达 29例患者经纤维支气管镜活检病理证实为肺癌22例(鳞癌15例，腺癌4例，小细胞肺癌3例)，异型细胞4例，慢性炎症2例，支刷找到抗酸杆菌1例。22例肺癌组织中18例端粒酶活性表达阳性，阳性率为81.81%，其中小细胞肺癌为66.67%(2/3)，非小细胞肺癌为84.21%(16/19)；慢性炎症和异型细胞中各有1例端粒酶活性表达阳性，肺结核患者端粒酶活性表达阴性。端粒酶活性阳性表达与病理结果的关系见表1。
表1 端粒酶活性表达与肺癌病理组织分类的关系
Tab 1 Relation between telomerase activity
and pathological classification of lung cancer Pathology
No. of
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cases
+++
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No. of positive cases
(positive rate)
Squamous cell carcinoma
15
1
8
4
13(86.67%)
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Adenocarcinoma
4
1
2
3(75%)
Small cell lung cancer
3
1
1
2(66.67%)
Atypical cells
4
, 百拇医药 1
1(25%)
Chronic inflammation
3
1
1(33.33%)
2.2 端粒酶活性表达与肺癌淋巴结转移和临床分期的关系 在22例病理证实为肺癌的患者中，根据胸部CT检查发现12例有淋巴结转移，12例端粒酶均呈阳性表达；10例无淋巴结转移的患者中，6例为阳性，差异有显著性(P<0.05)。根据1997年国际抗癌联盟制订的TNM分期标准[3]，22例肺癌患者中有Ⅰ期9例，Ⅱ期6例，Ⅲ期6例，Ⅳ期1例，在Ⅰ期中有5例端粒酶表达阳性，Ⅱ～Ⅳ期的13例患者全部呈阳性表达，其中3例Ⅲ或Ⅳ期患者端粒酶活性表达呈强阳性(表2)。表2 端粒酶阳性表达与肺癌病理特征的关系
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Tab 2 Relation between telomerase activity
and pathological characteristics of lung cancer Pathological charcteristics
No. of
cases
+++
++
+
No. of positive cases
(positive rate)
Lymph node metastasis
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N0
10
4
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N1
5
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6(100%)
N3
1
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Stage
Ⅰ
9
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5(55.55%)
Ⅱ
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4
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Ⅲ
6
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Ⅳ
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3 讨论
, 百拇医药 端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的特殊逆转录酶，与真核生物细胞线状染色体末端特定的核苷酸序列和结构即端粒的合成有关。端粒对染色体的稳定和末断复制具有重要的作用。研究表明人类发生的大部分恶性肿瘤都有端粒酶活性的表达[4]，因此提出了恶性肿瘤发生的端粒酶学说，认为端粒酶的激活是细胞获得无限增殖能力的共同途径。国外学者对肺癌的研究结果显示，非小细胞肺癌端粒酶活性表达为81.8%，小细胞肺癌为100%，癌旁组织为4.4%，同时发现小细胞肺癌与非小细胞肺癌活性强度有差异，小细胞肺癌为强阳性，非小细胞肺癌为弱到中度阳性[5]。本研究观察到肺癌端粒酶活性阳性表达为81.81%，非小细胞肺癌为84.21%(16/19)，小细胞肺癌为66.66%(2/3)，活性强度与组织类型无明显关系，可能与本组例数较少有关。研究结果表明端粒酶活性与淋巴结转移有一定的关系，在12例发生淋巴结转移的患者，端粒酶活性均呈阳性表达，而无淋巴结转移的10例患者中仅6例阳性，两组间有显著差异，这预示端粒酶有可能作为诊断肺癌淋巴结转移的辅助指标；此外，本研究还观察到Ⅱ～Ⅳ期肺癌患者端粒酶均为阳性，且分期越高，活性表达越强，提示端粒酶的活化不仅与肺癌的发生有关，且可作为肺癌的标志物，并对预后的推测有一定的价值。
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在本组资料中有1例慢性炎症和1例异型细胞患者端粒酶呈阳性表达，该2例患者经随访证实1例为类癌。由于经纤维支气管镜取材不易，所取的组织较少或是表浅组织，肺癌组织病理检查可能会得到假阴性结果[6]；而端粒酶检测所采用的PCR-ELISA法具有敏感性高、特异性强的特点，只要在癌肿病变部位取到组织就可能呈阳性表达，因此在这种情况下对诊断尤其具有重要的意义。
综上所述，我们认为端粒酶的活化不仅与肺癌的发生、发展有关，可以作为肺癌的标志物，并与肺癌的浸润转移有关，有临床应用价值。
参 考 文 献
1，莫晓能.端粒、端粒酶与肺癌.国外医学呼吸系统分册，1998，18(1)∶11-13.
2，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science,1994,266(5193)∶2011-2015.
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3，吴怀申.肺癌最新TNM分类和分期.中国肿瘤临床，1998，20(5)∶398-401.
4，Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase in Tetrahymena extracts. Cell,1985,43(2)∶405-413.
5，Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. Telomerase activity in small cell and non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst,1995,87(12)∶895-902.
6，林耀广，刘春艳，王虹，等.肺癌在支气管镜下的特征.中华内科杂志，37(4)∶235-238.
(收稿：1999-11-02 修回：2000-03-18), 百拇医药