脑星形细胞瘤中IL-6mRNA的表达研究
作者：李增生 王雪梅 张可成 杨辉
单位：李增生(解放军323医院神经外科 陕西 西安 710054)；王雪梅(解放军临潼第一疗养院)；张可成(第三军医大学新桥医院) 杨辉(第三军医大学新桥医院)
关键词：白细胞介素-6；星形细胞瘤；原位杂交
脑星形细胞瘤中IL 〔摘要〕 目的 研究IL-6mRNA在星形细胞瘤中的表达及其与星形细胞瘤病理分级的关系。方法 采用地高辛标记IL-6cDNA探针，运用原位杂交技术检测IL-6mRNA在31例星形细胞瘤和10例正常脑组织中表达。结果 星形细胞瘤低分化组、高分化组表达率均高于对照组，有显著性差异，分别为P<0.01及P<0.05。星形细胞瘤低分化组表达率大于高分化组，P<0.05。表明IL-6mRNA表达率与组织类型及星形细胞瘤的分化程度有关。结论 IL-6可能参与星形细胞瘤的发生、发展过程，高分化的星形细胞瘤向恶性转化可能与IL-6mRNA过度表达有关系。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R739.41 〔文献标识码〕B
Study on interleukin-6mRNA expression in brain astrocytomas
LI Zeng-sheng, WANG Xue-mei ZHANG Ke-cheng et al
(Department of Neurosurgery,323 Hospital of PLA,Xi′An 710054)
〔Abstract〕 Objective To study the significance of IL-6 mRNA expression in astrocytomas and its relation with pathological grade in astrocytoma.Methods Digoxin-labelled IL-6cDNA probe was used to detect the expression of IL-6mRNA by in situ hybridization in 31 cases of astrocytomas and 10 cases of normal brain tissues.Results The expression rates in poorly differentiated astrocytomas and well differentiated astrocytomas were much higher than that in normal brain tissues (P<0.01,P<0.05).In well differentiated astrocytomas however,IL-6mRNA was much lower than in poorly differentiated astrocytomas (P<0.05).The expression of IL-6mRNA was associated with the type of the tissue and the pathological grade in astrocytoma.Conclusions IL-6 might play an imporant role in oncogenesis and development of astrocytoma.The deterioration of highly differentiated astrocytomas may be associated with over-expression of IL-6 gene.
, 百拇医药
〔Key words〕 interleukin-6;astrocytoma;in situ hybridization
某些肿瘤的发生和发展与白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)的过度表达有关[1]，为探索IL-6在星形细胞瘤发生、发展过程中的作用，本研究应用地高辛标记IL-6cDNA探针和原位杂交技术检测IL-6mRNA在星形细胞瘤的表达水平，分析其与星形细胞瘤病理分级的关系，对肿瘤的治疗和预后评估可能提供依据。
材料和方法
一、病历资料：组织材料为第三军医大学新桥医院神经外科手术切除的星形细胞瘤31例。按Kernohan分类法将星形细胞瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅰ级6例，Ⅱ级11例，Ⅲ级10例，Ⅳ级4例，Ⅰ、Ⅱ级为高分化组，Ⅲ、Ⅳ级为低分化组，均经病理切片确诊，另取新鲜尸体正常脑组织10例作对照。
, 百拇医药
二、主要方法步骤[2]：
1.标本处理：手术切除的标本一部分用10%甲醛固定行常规病理学检查，其余部分经液氮速冻后-70℃保存备用。每一标本有三张组织切片，进行杂交和杂交对照用。
2.IL-6cDNA探针的制备：将质粒HIL-6PMX309cDNA(大坪医院周向东博士惠赠)转化到大肠杆菌JM109中，经含氨苄青霉素的LB培养基筛选，转化阳性菌落种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中扩增，碱裂解法大量提取质粒，用EcoⅠ酶切，上样于1.0%的琼脂糖凝胶电泳，将载体质粒与目的基因分开，酶切片段约1.2kb，用凝胶电泳透析袋回收目的基因片段，经酚氯仿抽提，乙醇沉淀、纯化。
3.探针标记及杂交反应：将纯化的IL-6cDNA片段煮沸变性，加入六聚核苷酸混合物及dNTP标记混合物，试剂盒由德国Boehringer Mannheim公司提供。在Klenow大片段酶的作用下37℃反应4小时，-20℃保存备用。组织切片蛋白酶K37℃消化30～60分钟，4%的多聚甲醛固定5分钟，置盛有2×SSC湿合内预杂交42℃2h(预杂交液含50%甲酰胺，2×SSC)，置盛有2×SSC湿合内杂交，每片杂交液15ul(杂交液含50%甲酰胺，硫酸葡聚糖，Deuhadts液，变性的地高辛标记探针)42℃ 20小时，加入1∶1000抗地高辛抗体，室温孵育2h，加入NBT显示，镜下控制温度，二甲笨透明封片。
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4.杂交对照：(1)每次杂交均设一组不加入标记探针，操作过程同原位杂交。(2)切片在杂交前用RNase 37℃消化2小时，程序同原位杂交，RNase消化后仍有mRNA表达，说明是非特异性连接。
三、结果判定：用光学显微镜观察组织切片的显色反应，阳性呈兰色或紫兰色。IL-6mRNA表达阳性均在细胞内出显兰色或紫兰色沉淀。在整个切片中随机观察10个高倍视野，阳性细胞数>50%为强阳性(++)，>10%为弱阳性(+),<10%为阴性(-)。
四、统计学处理X2检验
结果
一、IL-6mRNA表达如附表所示，41例标本中表达率最高是星形细胞瘤低分化组(Ⅲ、Ⅳ)，依次为星形细胞瘤高分化组(Ⅰ、Ⅱ)、对照组。总体比较有显著性差异，各组两两比较，星形细胞瘤低分化组、高分化组均高于对照组，分别为P<0.01，P<0.05，星形细胞瘤低分化组大于高分化组，P<0.05。IL-6mRNA在对照组、星形细胞瘤高分化组及低分化组的表达强度，有从弱到强的递增趋势，低分化组多为强阳性。
, 百拇医药
附表 IL-6mRNA在各组的表达
组别
n
-
+
++
阳性率(%)
对照组
10
9
1
0
10.00
, 百拇医药
星形细胞瘤高分化组
17
8
7
2
52.94*
Ⅰ
6
3
3
0
Ⅱ
11
, 百拇医药
5
4
2
星形细胞瘤低分化组
14
1
4
9
92.15**
Ⅲ
10
1
4
, 百拇医药
5
Ⅳ
4
0
0
4
*、**与对照组比较P<0.05，P<0.01 **与*比较P<0.05
二、对照试验结果：未标记探针及RNase消化的切片均呈阴性。
讨论
恶性肿瘤的形成过程及机制十分复杂，与各种癌基因激活或抑癌基因失活及多种细胞生长因子过度表达密切相关。许多研究表明，IL-6基因调控异常及过度表达，能引起细胞分裂增殖失控，促使肿瘤细胞生长和增殖[1，3，4]。本组资料显示，星形细胞瘤低分化组、高分化组IL-6mRNA表达率均明显高于对照组，有显著性差异，分别为P<0.01及P<0.05。结果表明IL-6mRNA表达率与组织类型有关。星形细胞瘤能表达IL-6mRNA，并分泌IL-6，因而存在着自分泌效应，瘤细胞能通过自分泌大量的IL-6来促进自身无限增殖，推测IL-6可能参与星形细胞瘤的发生、发展过程。
, 百拇医药
星形细胞瘤起源于神经间质细胞，其生物学行为特殊，在早期可以是分化较好相对良性的，但以后可转变为高度恶性。对于肿瘤的转化，细胞分泌信号肽和免疫监视两者关系极为重要，这两个过程由细胞因子介导[5]，IL-6是机体重要的信息传递介质[6]，IL-6基因过度表达可影响免疫系统监视和杀伤作用，促发肿瘤转化。作者研究发现，星形细胞瘤低分化组IL-6mRNA表达率大于星形细胞瘤高分化组，组间相互差异有统计学意义，P<0.05。结果表明IL-6mRNA表达率与星形细胞瘤分化程度有关。提示IL-6对星形细胞瘤高分化组向恶性转化可能起重要作用。本研究结果显示，IL-6mRNA在对照组、星形细胞瘤高分化组及低分化组的表达强度，有从弱到强的递增趋势，恶性程度高的低分化星形细胞瘤呈高强度表达，结果说明IL-6mRNA的表达强度能反映其预后。
作者简介：李增生(1951-)，男，河北武安人，副主任医师。从事神经外科专业。
参考文献
, 百拇医药
1，Kwano M,Kuramoto A,Kishimoto,T.Cytokins as autocrine factors in malignancies.Cancer suru,1989；8:905
2，蔡文琴，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.第1版.成都：四川科学技术出版社，1994；419
3，Ykoi K,Miyamaki T,Yachic A.Epstein-Barr virus immortalized B cell produces IL-6 as autocrine growth factor.Immunol,1990；70:100
4，Lichor-T,Libermaun-TA,Coexpression of interleukin-1 β interleukin-6 in human brain tumors Neurosurgery,1994;34:669
5，Aronson S.A.Growth factor and cancer.Science,1991;254:1146
6，Huettenr C,paulus W,Roggendoyf W.Messenger RNA expression of the immunosuppressive cytokine IL-10 in human gliomas.AM J Pathol, 1995;146(2):317
收稿日期：1999-5-31, http://www.100md.com
单位：李增生(解放军323医院神经外科 陕西 西安 710054)；王雪梅(解放军临潼第一疗养院)；张可成(第三军医大学新桥医院) 杨辉(第三军医大学新桥医院)
关键词：白细胞介素-6；星形细胞瘤；原位杂交
脑星形细胞瘤中IL 〔摘要〕 目的 研究IL-6mRNA在星形细胞瘤中的表达及其与星形细胞瘤病理分级的关系。方法 采用地高辛标记IL-6cDNA探针，运用原位杂交技术检测IL-6mRNA在31例星形细胞瘤和10例正常脑组织中表达。结果 星形细胞瘤低分化组、高分化组表达率均高于对照组，有显著性差异，分别为P<0.01及P<0.05。星形细胞瘤低分化组表达率大于高分化组，P<0.05。表明IL-6mRNA表达率与组织类型及星形细胞瘤的分化程度有关。结论 IL-6可能参与星形细胞瘤的发生、发展过程，高分化的星形细胞瘤向恶性转化可能与IL-6mRNA过度表达有关系。
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〔中图分类号〕 R739.41 〔文献标识码〕B
Study on interleukin-6mRNA expression in brain astrocytomas
LI Zeng-sheng, WANG Xue-mei ZHANG Ke-cheng et al
(Department of Neurosurgery,323 Hospital of PLA,Xi′An 710054)
〔Abstract〕 Objective To study the significance of IL-6 mRNA expression in astrocytomas and its relation with pathological grade in astrocytoma.Methods Digoxin-labelled IL-6cDNA probe was used to detect the expression of IL-6mRNA by in situ hybridization in 31 cases of astrocytomas and 10 cases of normal brain tissues.Results The expression rates in poorly differentiated astrocytomas and well differentiated astrocytomas were much higher than that in normal brain tissues (P<0.01,P<0.05).In well differentiated astrocytomas however,IL-6mRNA was much lower than in poorly differentiated astrocytomas (P<0.05).The expression of IL-6mRNA was associated with the type of the tissue and the pathological grade in astrocytoma.Conclusions IL-6 might play an imporant role in oncogenesis and development of astrocytoma.The deterioration of highly differentiated astrocytomas may be associated with over-expression of IL-6 gene.
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〔Key words〕 interleukin-6;astrocytoma;in situ hybridization
某些肿瘤的发生和发展与白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)的过度表达有关[1]，为探索IL-6在星形细胞瘤发生、发展过程中的作用，本研究应用地高辛标记IL-6cDNA探针和原位杂交技术检测IL-6mRNA在星形细胞瘤的表达水平，分析其与星形细胞瘤病理分级的关系，对肿瘤的治疗和预后评估可能提供依据。
材料和方法
一、病历资料：组织材料为第三军医大学新桥医院神经外科手术切除的星形细胞瘤31例。按Kernohan分类法将星形细胞瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅰ级6例，Ⅱ级11例，Ⅲ级10例，Ⅳ级4例，Ⅰ、Ⅱ级为高分化组，Ⅲ、Ⅳ级为低分化组，均经病理切片确诊，另取新鲜尸体正常脑组织10例作对照。
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二、主要方法步骤[2]：
1.标本处理：手术切除的标本一部分用10%甲醛固定行常规病理学检查，其余部分经液氮速冻后-70℃保存备用。每一标本有三张组织切片，进行杂交和杂交对照用。
2.IL-6cDNA探针的制备：将质粒HIL-6PMX309cDNA(大坪医院周向东博士惠赠)转化到大肠杆菌JM109中，经含氨苄青霉素的LB培养基筛选，转化阳性菌落种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中扩增，碱裂解法大量提取质粒，用EcoⅠ酶切，上样于1.0%的琼脂糖凝胶电泳，将载体质粒与目的基因分开，酶切片段约1.2kb，用凝胶电泳透析袋回收目的基因片段，经酚氯仿抽提，乙醇沉淀、纯化。
3.探针标记及杂交反应：将纯化的IL-6cDNA片段煮沸变性，加入六聚核苷酸混合物及dNTP标记混合物，试剂盒由德国Boehringer Mannheim公司提供。在Klenow大片段酶的作用下37℃反应4小时，-20℃保存备用。组织切片蛋白酶K37℃消化30～60分钟，4%的多聚甲醛固定5分钟，置盛有2×SSC湿合内预杂交42℃2h(预杂交液含50%甲酰胺，2×SSC)，置盛有2×SSC湿合内杂交，每片杂交液15ul(杂交液含50%甲酰胺，硫酸葡聚糖，Deuhadts液，变性的地高辛标记探针)42℃ 20小时，加入1∶1000抗地高辛抗体，室温孵育2h，加入NBT显示，镜下控制温度，二甲笨透明封片。
, http://www.100md.com
4.杂交对照：(1)每次杂交均设一组不加入标记探针，操作过程同原位杂交。(2)切片在杂交前用RNase 37℃消化2小时，程序同原位杂交，RNase消化后仍有mRNA表达，说明是非特异性连接。
三、结果判定：用光学显微镜观察组织切片的显色反应，阳性呈兰色或紫兰色。IL-6mRNA表达阳性均在细胞内出显兰色或紫兰色沉淀。在整个切片中随机观察10个高倍视野，阳性细胞数>50%为强阳性(++)，>10%为弱阳性(+),<10%为阴性(-)。
四、统计学处理X2检验
结果
一、IL-6mRNA表达如附表所示，41例标本中表达率最高是星形细胞瘤低分化组(Ⅲ、Ⅳ)，依次为星形细胞瘤高分化组(Ⅰ、Ⅱ)、对照组。总体比较有显著性差异，各组两两比较，星形细胞瘤低分化组、高分化组均高于对照组，分别为P<0.01，P<0.05，星形细胞瘤低分化组大于高分化组，P<0.05。IL-6mRNA在对照组、星形细胞瘤高分化组及低分化组的表达强度，有从弱到强的递增趋势，低分化组多为强阳性。
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附表 IL-6mRNA在各组的表达
组别
n
-
+
++
阳性率(%)
对照组
10
9
1
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10.00
, 百拇医药
星形细胞瘤高分化组
17
8
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52.94*
Ⅰ
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Ⅱ
11
, 百拇医药
5
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星形细胞瘤低分化组
14
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92.15**
Ⅲ
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Ⅳ
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*、**与对照组比较P<0.05，P<0.01 **与*比较P<0.05
二、对照试验结果：未标记探针及RNase消化的切片均呈阴性。
讨论
恶性肿瘤的形成过程及机制十分复杂，与各种癌基因激活或抑癌基因失活及多种细胞生长因子过度表达密切相关。许多研究表明，IL-6基因调控异常及过度表达，能引起细胞分裂增殖失控，促使肿瘤细胞生长和增殖[1，3，4]。本组资料显示，星形细胞瘤低分化组、高分化组IL-6mRNA表达率均明显高于对照组，有显著性差异，分别为P<0.01及P<0.05。结果表明IL-6mRNA表达率与组织类型有关。星形细胞瘤能表达IL-6mRNA，并分泌IL-6，因而存在着自分泌效应，瘤细胞能通过自分泌大量的IL-6来促进自身无限增殖，推测IL-6可能参与星形细胞瘤的发生、发展过程。
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星形细胞瘤起源于神经间质细胞，其生物学行为特殊，在早期可以是分化较好相对良性的，但以后可转变为高度恶性。对于肿瘤的转化，细胞分泌信号肽和免疫监视两者关系极为重要，这两个过程由细胞因子介导[5]，IL-6是机体重要的信息传递介质[6]，IL-6基因过度表达可影响免疫系统监视和杀伤作用，促发肿瘤转化。作者研究发现，星形细胞瘤低分化组IL-6mRNA表达率大于星形细胞瘤高分化组，组间相互差异有统计学意义，P<0.05。结果表明IL-6mRNA表达率与星形细胞瘤分化程度有关。提示IL-6对星形细胞瘤高分化组向恶性转化可能起重要作用。本研究结果显示，IL-6mRNA在对照组、星形细胞瘤高分化组及低分化组的表达强度，有从弱到强的递增趋势，恶性程度高的低分化星形细胞瘤呈高强度表达，结果说明IL-6mRNA的表达强度能反映其预后。
作者简介：李增生(1951-)，男，河北武安人，副主任医师。从事神经外科专业。
参考文献
, 百拇医药
1，Kwano M,Kuramoto A,Kishimoto,T.Cytokins as autocrine factors in malignancies.Cancer suru,1989；8:905
2，蔡文琴，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.第1版.成都：四川科学技术出版社，1994；419
3，Ykoi K,Miyamaki T,Yachic A.Epstein-Barr virus immortalized B cell produces IL-6 as autocrine growth factor.Immunol,1990；70:100
4，Lichor-T,Libermaun-TA,Coexpression of interleukin-1 β interleukin-6 in human brain tumors Neurosurgery,1994;34:669
5，Aronson S.A.Growth factor and cancer.Science,1991;254:1146
6，Huettenr C,paulus W,Roggendoyf W.Messenger RNA expression of the immunosuppressive cytokine IL-10 in human gliomas.AM J Pathol, 1995;146(2):317
收稿日期：1999-5-31, http://www.100md.com