原发性食管鳞癌组织p16基因缺失的检测
作者：李向成 王心南 朱穆忠 苏伟强 姚立新
单位：李向成(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)；王心南(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)；朱穆忠(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)；苏伟强(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)；姚立新(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)
关键词：食管肿瘤；基因缺失；聚合酶链反应；p16基因
原发性食管鳞癌组织p16基因缺失的检测 〔摘要〕 目的 研究p16基因缺失与原发性食管鳞癌的相关性。方法 采用PCR方法检测41例原发性食管鳞癌组织中p16基因的缺失情况。结果 41例食管鳞癌组织有6例p16基因缺失，缺失率为14.6%。低分化食管癌p16基因缺失率为50%，高于中分化(p=0.0009)和高分化食管癌(p=0.022)。有淋巴结转移缺失率高于无淋巴结转移(p=0.003)。结论 p16基因缺失与食管鳞癌的发生发展有相关性。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R735.1 〔文献标识码〕B
Investigation on p16 gene deletion in tissues of primary squamous cell carcinoma of esophagus
LI Xiang-cheng,WANG Xin-nan,ZHU Mu-qiang, et al.
(The Second People′s Hopital of Wuxi City,Wuxi 214002)
〔Abstract〕 Objective To study the relationship between deletion of p16 gene and primary human esophageal carcinoma.Methods A total of 41 human esophageal squamous cell carcinoma specimens were examined for homozygous deletion of p16 gene using PCR method.Results The homozygous deletion of p16 gene was confirmed by PCR in 6 cases,with a rate of 14.6%.Compared to high-or mild differentiated cancer,the homozygous deletion of p16 gene was higher in lower defferentiated cancer.The homozygous deletion of p16 gene was higher in the cases with lymphatic metastasis than in those without lymphatic metastasis.Conclusions The homozygous deletion of p16 gene is correlated with the progression of primary human esophageal carcinoma.
, http://www.100md.com
〔Key words〕 esophageal neoplasm;gene deletion;PCR; p16 gene
食管癌发生发展的分子事件与细胞癌基因的激活和/或抑癌基因的失活有关[1-6]。自从1994年发现位于人类染色体9p21的p16基因以来，已就其在多种肿瘤进行了广泛研究，p16基因的缺失率依肿瘤类型及研究者的不同有巨大差异。但在对食管鳞癌的研究中以手术切除的石蜡标本为材料的研究较少。为此本研究采用PCR技术，对41例食管鳞癌手术标本进行了p16基因缺失检测，旨在探讨p16基因纯合性缺失与原发性食管鳞癌的相关性。
材料和方法
标本：收集江苏省无锡市第二人民医院1995年1月以后连续手术切除的41例食管癌标本，所有标本均经病理证实为原发性食管鳞癌，患者年龄39～73岁，平均55.6±10.1岁。以国内学者孙绍谦鳞癌分级法，属高分化者9例，中分化者22例，低分化者10例。据1987年国际UICC的TNM新标准有淋巴结转移者39例，无转移者2例。
, http://www.100md.com
手术切取标本立即用10%福尔马林固定，石蜡包埋。以层厚10μ连续切取5切片，置入1ml Eppendorf管内备用。
PCR基因引物：p16基因引物和内对照β-actin基因引物均由北京医科大学设计合成。p16基因外显子2全长片段顺序为：5′ACA AGC TTC CTT TCC GTC ATG CCG3′；5′TCT GAG CTT TGG AAG CTC TCA G3′。β-actin基因顺序为：5′ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA3′；5′ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG3。
DNA提取及PCR扩增 食管鳞癌组织DNA提取按Drbeau等[7]方法进行。25μL反应体系中包括基因组DNA 200ng，一对引物各15pmol/L,dNTP 10mmol/L,Tris.HCL(PH8.3)10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl2 2mmol/L，0.01%明胶，0.05%甲酰胺和Tag DNA多聚酶1.0u(上海复华公司)。用NT-1109型PCR反应仪(军事医科院北京新技术应用研究所生产)扩增条件为：94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟。35个循环后延伸5分钟。每一标本均重复二次以上PCR扩增，以p16基因的扩增产物荧光强度密度小于25%的β-actin基因产物强度为基因缺失的判断标准。
, 百拇医药
PCR扩增产物电泳 取10μL的PCR扩增产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色，紫外线灯下观察结果并照像分析。
统计学方法 Fisher直接概率法检验。
结果
p16基因纯合性缺失检验结果 41例食管鳞癌中有p16基因纯合缺失者6例，缺失率为(6/41)14.6%。
p16基因纯合缺失与临床TMN分期和分化程度关系 本组食管癌高、中、低分化者p16基因纯合缺失率分别为0(0/9)、1(1/22，4.5%)、5(5/10，50%)例。低分化者p16基因纯合缺失率高于中、高分化者。有淋巴结有转移者p16基因缺失率高于无淋巴结转移者(p=0.003)。
p16基因缺失与临床TMN分期和分化程度关系
, 百拇医药
项 目
例数
缺失例数
缺失率(%)
P值
临床分期
T2N0M0
2
0
T3N1M0
18
1
, http://www.100md.com
5.6
T4N1M0
21
5
23.8
0.012
肿瘤分化程度
高分化
9
0
0
中分化
, 百拇医药 22
1
4.5
低分化
10
5
50
0.003
讨论
p16基因定位于9号染色体短臂21区(9p21)，由3个外显子和2个内含子构成，126bp的外显子和307bp的外显子构成了该基因97%的编码区，其编码产物直接参与细胞周期调节，是细胞G1期的重要负反馈调节蛋白[8]。在体内p16蛋白与cyclinD1蛋白竞争结合CDK4和CDK6，并抑制其催化RB蛋白磷酸化的活性，进而阻止细胞周期进展。当p16基因失活不能正常表达时，其竞争结合CDK4和CDK6的功能下降。而CyclinD1与CDK4和CDK6结合使Rb蛋白磷酸化失活，导致细胞增殖失控，终致肿瘤形成。本组41例原发性食管鳞癌中有6例p16基因缺失，缺失率为14.6%。与Igaki(16%，4/25)等[9]和Chan(12%,3/25)等[10]的研究结果相似。表明p16基因缺失与原发食管鳞癌有相关性。但此结果远低于体外肿瘤细胞系中p16基因缺失频率(92%)[11]。据文献报道p16基因缺失在肿瘤细胞株发生率相当高，而在实体肿瘤低得多[8，12]。对于这种差异有几种解释：一是认为基因缺失赋予细胞选择性优势性生长，使其在培养基中易于存活。而且培养条件下细胞传代过程中增加基因异常的机会。因此易于检出；另一种解释是在实体肿瘤中非肿瘤细胞存在不可避免，这些非肿瘤细胞中的DNA的污染可能造成实验结果的差异。
, 百拇医药
本研究还显示，低分化食管鳞癌p16基因缺失率显著高于中、高分化者；有局部淋巴结转移较无淋巴结转移的高，提示p16基因缺失与原发性食管鳞癌的恶性生物学行为相关，晚期食管癌p16基因缺失率高，是否能够说明p16基因缺失为食管癌发生的晚期事件，因例数较少，还有待于进一步的研究证实。原发性食管癌中p16基因有多种变异形式，并且其他癌基因或抑癌基因也可能参与肿瘤的发生发展，均有待进一步研究。p16基因的变异与原发性食管癌的发生和恶性程度呈一定的相关性，因此研究它们将可能揭示p16基因在食管肿瘤发生和发展中的作用。
作者简介：李向成(1962-)，男，江苏无锡人，硕士，从事胸外科专业。
参考文献
1，ZHANG,Lijian,CHEN Keneng,XU Guangwei,et al.Congenital expression of mdr-1 gene in cancer tissues from several high-incidence neoplasms without preoperative chemotherapy and its association with morphological indexes of esophageal carcinoma in Anyang.J World Gestrogenterology,1999,5:54
, 百拇医药
2，殷丽明，陈克能，李殿发，等.常见肿瘤组织中mdr-1 基因表达的初步研究.中华肿瘤学杂志，1997，19(6)：420-2
3，陈克能，邢海平，程邦昌，等.食管癌组织中多药耐药基因的表达与外科形态学的关系，中华医学杂志，1998，78(6)：462-3
4，Chen KN,et al.Congenial expression of mdr-1 gene in esophageal cancer and its correlation with morphological indexes.Chin J Cancer Res,1997,9(3):41-4
5，陈克能，师晓天，程邦昌.食管、胃癌的分子生物学研究进展.中华实验外科杂志，1996，13(6)：383-4
6，陈克能.食管癌基因分子水平的研究进展.中国胸心血管外科临床杂志，1999，5(1)：57
, 百拇医药
7，Drbeau L,Chandler LA,Gralow JR,et al.Southern blot analysis of DNA extracted from formalin-fixed pathology specimens.Cancer Res,1986,46:2964-2966
8，Kamb A,Gruis NA,Weaver FJ,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436-440
9，Igaki H,Sasaki H,Tachimori Y,et al.Mutation frequency of the p16/CDKN2 gene in primary cancer in the upper digestive tract.Cancer Research,1995,55:3421-3423
, 百拇医药
10，Wai Chichan,Cecilla Man Ching Tang,Kwok Wai Lau,et al.P16 tumor suppressor gene mutations in Chinese esophageal carcinomas in Hong Kong.Cancer Letters,1997,115:201-206
11，Igaki H,Sasaki H,Kishi T,et al.Highly frequent homozygous deletion of the p16 gene in esophageal cancer cell lines.Biochemical and biophysical research communication,1994,203(2)1090-1095
12，Zhang GSY,Klein-Szanto AJP,Sauter ER,et al.Higher frequency of alteration in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumor of the head and neck.Cancer Research,1994,54:505-5053
收稿日期：1999-6-20, 百拇医药
单位：李向成(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)；王心南(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)；朱穆忠(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)；苏伟强(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)；姚立新(无锡市第二人民医院胸外科 江苏 无锡 214002)
关键词：食管肿瘤；基因缺失；聚合酶链反应；p16基因
原发性食管鳞癌组织p16基因缺失的检测 〔摘要〕 目的 研究p16基因缺失与原发性食管鳞癌的相关性。方法 采用PCR方法检测41例原发性食管鳞癌组织中p16基因的缺失情况。结果 41例食管鳞癌组织有6例p16基因缺失，缺失率为14.6%。低分化食管癌p16基因缺失率为50%，高于中分化(p=0.0009)和高分化食管癌(p=0.022)。有淋巴结转移缺失率高于无淋巴结转移(p=0.003)。结论 p16基因缺失与食管鳞癌的发生发展有相关性。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R735.1 〔文献标识码〕B
Investigation on p16 gene deletion in tissues of primary squamous cell carcinoma of esophagus
LI Xiang-cheng,WANG Xin-nan,ZHU Mu-qiang, et al.
(The Second People′s Hopital of Wuxi City,Wuxi 214002)
〔Abstract〕 Objective To study the relationship between deletion of p16 gene and primary human esophageal carcinoma.Methods A total of 41 human esophageal squamous cell carcinoma specimens were examined for homozygous deletion of p16 gene using PCR method.Results The homozygous deletion of p16 gene was confirmed by PCR in 6 cases,with a rate of 14.6%.Compared to high-or mild differentiated cancer,the homozygous deletion of p16 gene was higher in lower defferentiated cancer.The homozygous deletion of p16 gene was higher in the cases with lymphatic metastasis than in those without lymphatic metastasis.Conclusions The homozygous deletion of p16 gene is correlated with the progression of primary human esophageal carcinoma.
, http://www.100md.com
〔Key words〕 esophageal neoplasm;gene deletion;PCR; p16 gene
食管癌发生发展的分子事件与细胞癌基因的激活和/或抑癌基因的失活有关[1-6]。自从1994年发现位于人类染色体9p21的p16基因以来，已就其在多种肿瘤进行了广泛研究，p16基因的缺失率依肿瘤类型及研究者的不同有巨大差异。但在对食管鳞癌的研究中以手术切除的石蜡标本为材料的研究较少。为此本研究采用PCR技术，对41例食管鳞癌手术标本进行了p16基因缺失检测，旨在探讨p16基因纯合性缺失与原发性食管鳞癌的相关性。
材料和方法
标本：收集江苏省无锡市第二人民医院1995年1月以后连续手术切除的41例食管癌标本，所有标本均经病理证实为原发性食管鳞癌，患者年龄39～73岁，平均55.6±10.1岁。以国内学者孙绍谦鳞癌分级法，属高分化者9例，中分化者22例，低分化者10例。据1987年国际UICC的TNM新标准有淋巴结转移者39例，无转移者2例。
, http://www.100md.com
手术切取标本立即用10%福尔马林固定，石蜡包埋。以层厚10μ连续切取5切片，置入1ml Eppendorf管内备用。
PCR基因引物：p16基因引物和内对照β-actin基因引物均由北京医科大学设计合成。p16基因外显子2全长片段顺序为：5′ACA AGC TTC CTT TCC GTC ATG CCG3′；5′TCT GAG CTT TGG AAG CTC TCA G3′。β-actin基因顺序为：5′ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA3′；5′ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG3。
DNA提取及PCR扩增 食管鳞癌组织DNA提取按Drbeau等[7]方法进行。25μL反应体系中包括基因组DNA 200ng，一对引物各15pmol/L,dNTP 10mmol/L,Tris.HCL(PH8.3)10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl2 2mmol/L，0.01%明胶，0.05%甲酰胺和Tag DNA多聚酶1.0u(上海复华公司)。用NT-1109型PCR反应仪(军事医科院北京新技术应用研究所生产)扩增条件为：94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟。35个循环后延伸5分钟。每一标本均重复二次以上PCR扩增，以p16基因的扩增产物荧光强度密度小于25%的β-actin基因产物强度为基因缺失的判断标准。
, 百拇医药
PCR扩增产物电泳 取10μL的PCR扩增产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色，紫外线灯下观察结果并照像分析。
统计学方法 Fisher直接概率法检验。
结果
p16基因纯合性缺失检验结果 41例食管鳞癌中有p16基因纯合缺失者6例，缺失率为(6/41)14.6%。
p16基因纯合缺失与临床TMN分期和分化程度关系 本组食管癌高、中、低分化者p16基因纯合缺失率分别为0(0/9)、1(1/22，4.5%)、5(5/10，50%)例。低分化者p16基因纯合缺失率高于中、高分化者。有淋巴结有转移者p16基因缺失率高于无淋巴结转移者(p=0.003)。
p16基因缺失与临床TMN分期和分化程度关系
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项 目
例数
缺失例数
缺失率(%)
P值
临床分期
T2N0M0
2
0
T3N1M0
18
1
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5.6
T4N1M0
21
5
23.8
0.012
肿瘤分化程度
高分化
9
0
0
中分化
, 百拇医药 22
1
4.5
低分化
10
5
50
0.003
讨论
p16基因定位于9号染色体短臂21区(9p21)，由3个外显子和2个内含子构成，126bp的外显子和307bp的外显子构成了该基因97%的编码区，其编码产物直接参与细胞周期调节，是细胞G1期的重要负反馈调节蛋白[8]。在体内p16蛋白与cyclinD1蛋白竞争结合CDK4和CDK6，并抑制其催化RB蛋白磷酸化的活性，进而阻止细胞周期进展。当p16基因失活不能正常表达时，其竞争结合CDK4和CDK6的功能下降。而CyclinD1与CDK4和CDK6结合使Rb蛋白磷酸化失活，导致细胞增殖失控，终致肿瘤形成。本组41例原发性食管鳞癌中有6例p16基因缺失，缺失率为14.6%。与Igaki(16%，4/25)等[9]和Chan(12%,3/25)等[10]的研究结果相似。表明p16基因缺失与原发食管鳞癌有相关性。但此结果远低于体外肿瘤细胞系中p16基因缺失频率(92%)[11]。据文献报道p16基因缺失在肿瘤细胞株发生率相当高，而在实体肿瘤低得多[8，12]。对于这种差异有几种解释：一是认为基因缺失赋予细胞选择性优势性生长，使其在培养基中易于存活。而且培养条件下细胞传代过程中增加基因异常的机会。因此易于检出；另一种解释是在实体肿瘤中非肿瘤细胞存在不可避免，这些非肿瘤细胞中的DNA的污染可能造成实验结果的差异。
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本研究还显示，低分化食管鳞癌p16基因缺失率显著高于中、高分化者；有局部淋巴结转移较无淋巴结转移的高，提示p16基因缺失与原发性食管鳞癌的恶性生物学行为相关，晚期食管癌p16基因缺失率高，是否能够说明p16基因缺失为食管癌发生的晚期事件，因例数较少，还有待于进一步的研究证实。原发性食管癌中p16基因有多种变异形式，并且其他癌基因或抑癌基因也可能参与肿瘤的发生发展，均有待进一步研究。p16基因的变异与原发性食管癌的发生和恶性程度呈一定的相关性，因此研究它们将可能揭示p16基因在食管肿瘤发生和发展中的作用。
作者简介：李向成(1962-)，男，江苏无锡人，硕士，从事胸外科专业。
参考文献
1，ZHANG,Lijian,CHEN Keneng,XU Guangwei,et al.Congenital expression of mdr-1 gene in cancer tissues from several high-incidence neoplasms without preoperative chemotherapy and its association with morphological indexes of esophageal carcinoma in Anyang.J World Gestrogenterology,1999,5:54
, 百拇医药
2，殷丽明，陈克能，李殿发，等.常见肿瘤组织中mdr-1 基因表达的初步研究.中华肿瘤学杂志，1997，19(6)：420-2
3，陈克能，邢海平，程邦昌，等.食管癌组织中多药耐药基因的表达与外科形态学的关系，中华医学杂志，1998，78(6)：462-3
4，Chen KN,et al.Congenial expression of mdr-1 gene in esophageal cancer and its correlation with morphological indexes.Chin J Cancer Res,1997,9(3):41-4
5，陈克能，师晓天，程邦昌.食管、胃癌的分子生物学研究进展.中华实验外科杂志，1996，13(6)：383-4
6，陈克能.食管癌基因分子水平的研究进展.中国胸心血管外科临床杂志，1999，5(1)：57
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7，Drbeau L,Chandler LA,Gralow JR,et al.Southern blot analysis of DNA extracted from formalin-fixed pathology specimens.Cancer Res,1986,46:2964-2966
8，Kamb A,Gruis NA,Weaver FJ,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436-440
9，Igaki H,Sasaki H,Tachimori Y,et al.Mutation frequency of the p16/CDKN2 gene in primary cancer in the upper digestive tract.Cancer Research,1995,55:3421-3423
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10，Wai Chichan,Cecilla Man Ching Tang,Kwok Wai Lau,et al.P16 tumor suppressor gene mutations in Chinese esophageal carcinomas in Hong Kong.Cancer Letters,1997,115:201-206
11，Igaki H,Sasaki H,Kishi T,et al.Highly frequent homozygous deletion of the p16 gene in esophageal cancer cell lines.Biochemical and biophysical research communication,1994,203(2)1090-1095
12，Zhang GSY,Klein-Szanto AJP,Sauter ER,et al.Higher frequency of alteration in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumor of the head and neck.Cancer Research,1994,54:505-5053
收稿日期：1999-6-20, 百拇医药