肺癌患者T淋巴细胞rDNA转录活性分析(附112例报道)
作者：王俊杰 贾廷珍 杨建良 孙凌飞 申文江
单位：王俊杰(北京医科大学第三医院肿瘤科 北京 100083)；贾廷珍(北京医科大学第三医院肿瘤科 北京 100083)；杨建良(北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心)；孙凌飞(北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心)；申文江(北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心)
关键词：rDNA；核仁组成区嗜银蛋白；I.S%；I.O.D%
New Page 1 〔摘要〕 目的 通过肺癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性分析，探讨其对肺癌辅助诊断、治疗结果判定和预后监测的意义。方法 利用CIAS-1000型细胞图像分析系统及相关的细胞培养、银染等技术，对20例健康人、20例炎症患者和112例肺癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性进行分析，结果以核仁积分面积与细胞核积分面积的比值(I.S%)和核仁银染积分光密度与细胞核银染积分光密度的比值(I.O.D%)表达。结果 肿瘤患者外周血T淋巴细胞的rDNA转录活性明显下降，与健康人比较，差异有显著意义(P<0.01)；肿瘤转移和/或复发时，T淋巴细胞rDNA转录活性进一步下降(P<0.05)。结论 外周血T淋巴细胞rDNA转录活性分析可以做为肺癌的辅助诊断、治疗疗效的判定和预后的监测指标。
, http://www.100md.com
〔中图分类号〕 R734.2 〔文献标识码〕B
Study on rDNA transcription activity of peripheral blood T lymphocyte cell in lung cancer patients
WANG Jun-jie,JIA Ting-zhen et al.
Beijing Medical University,Beijing 100083
〔Abstract〕 Objective To investigate the clinical significance of rDNA transcription activity of peripheral blood T lymphocytes in lung cancer patients.Methods rDNA transcription activity of T lymphocytes was detected by CIAS-1000 image analysis system in 20 cases of health controls、20 cases of inflammatory patients and 112 patients.Results The rDNA transcription activity of peripheral blood T lymphocytes increased in inflammatory patients and decreased in lung cancer patients(P<0.01).There was a significant difference between early stage and late stage cancer patients(P<0.05).Conclusions The analysis of rDNA transcription activity of peripheral blood T lymphocytes may serve as a lung cancer marker for diagnosis and differential diagnosis、prediction of clinical treatment and as well as for follow-up for lung cancer.
, 百拇医药
〔Key words〕 rDNA;AgNOR;I.S%;I.O.D%
细胞核的核仁组成区(nucleolar organizer region,NOR)在细胞周期的中期存在于13、14、15、21、22号染色体短臂的次缢痕上，间期以核仁的形式存在，其主要功能是构成核仁。rDNA周围的生物活性非组蛋白，指导核仁合成和组装rDNA，其相关蛋白(AgNOR)可通过银染方法显示[1]。AgNOR的相对含量更早期、更精确地反映了细胞rDNA转录活性和蛋白质合成的状态[2，3，4]，而且许多研究证实其对肿瘤良、恶性鉴别和肿瘤恶性程度分级上具有诊断价值，但是关于肿瘤患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性分析国内外尚未见报道。
材料和方法
一、研究对象 健康人20例，炎症患者20例及我院1997年9月～1999年4月收治的肺癌患者112例，男78例，女34例，其中鳞癌58例，腺癌45例，小细胞肺癌9例，肺癌术后15例；肺癌Ⅰ～Ⅱ期37例，肺癌Ⅲ期16例，肺癌Ⅳ期44例，其中肺癌术后骨转移14例，肺癌和肺癌术后颅内转移18例，肺癌术后淋巴和肝转移12例，以上均以病理诊断和CT检查结果为依据。
, 百拇医药
二、试剂 1.外周血细胞rDNA转录活性分析培养试剂盒由北京福瑞生物工程公司提供。2.银染液：A液为50%AgNO3水溶液，B液为3%甲酸+2%明胶。3.低渗液为0.07mol/L NaCl。
三、实验方法：培养：无菌取静脉血0.5ml，加到rDNA培养瓶中(内有肝素培养液4ml)，置于37℃、CO2培养箱中孵育72小时，每24小时摇晃2～3次。分离：1.取出含血培养液，用吸管将其混匀，吸到5ml离心管中，离心2000转/分，10分钟。2.弃上清液，留底物，加入低渗液5ml，用吸管将其混匀，离心2000转/分。3.弃上清液，留底物，加入固定液5ml，离心。重复。4.弃上清液，留0.5ml，滴在冰冻的载玻片上，每片2～3滴，室温或37℃烘箱中烘干。银染：制好的玻片上分别加3滴A液和3滴B液，加盖玻片，放入80℃～90℃水浴箱中的铝板上，待涂片转变成深黄色时取出，去盖玻片，用水冲去浮色，空气中干燥。
四、图象分析 利用CIAS-1000型细胞图像分析系统(中国科学院大恒集团北京大恒图像视觉有限公司提供)对选择好的T淋巴细胞进行自动化分析，其中I.S%为核仁积分面积与细胞核积分面积的比值，I.O.D%为核仁银染积分光密度与细胞核银染积分光密度的比值，数学模式为：
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式中 m：每组制片数；n：每张制片上被观察的细胞数；a：每个细胞中银染核仁积分总面积；b：每个细胞核的积分面积；c：每个细胞中银染核仁的I.O.D值；d：每个细胞核的I.O.D值。每张涂片计数10个以上细胞，所得结果为计数细胞的平均值。
统计学处理：计算机SAS软件进行F和D检验。
结果
附表 肺癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性分析
例数
I.S%
I.O.D%
健康人
20
, 百拇医药
7.78±1.40
6.41±0.99
炎症患者
20
11.89±1.56*
9.30±0.98*
肺癌术后
15
5.38±0.92*
4.57±0.58*
Ⅰ～Ⅱ期
, 百拇医药
37
4.25±1.03*
4.03±0.41*
Ⅲ期
16
4.21±0.97*
3.59±0.55*
Ⅳ期
44
3.78±1.03**
2.95±1.06**
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肺癌骨转移
14
3.67±0.81**
3.03±0.58**
肺癌颅内转移
18
3.86±1.12**
3.26±0.85**
肺癌术后
其他部位转移
12
, http://www.100md.com
4.15±1.30**
3.45±1.06**
±S.D *与健康人比较P<0.01；**与Ⅰ～Ⅱ期肿瘤组比较P<0.05
由附表可见炎症患者淋巴细胞的I.S%和I.O.D%比值明显高于健康人，而肺癌患者的I.S%和I.O.D%比值均明显低于健康人(P<0.01)，肺癌术后的I.S%和I.O.D%比值明显回升，当肿瘤转移和复发时，I.S%和I.O.D%比值进一步降低，与早期患者比较降低明显，统计学处理差别显著(P<0.05)。
讨论
肺癌是临床预后较差的肿瘤，其原因主要是由于临床发现时大多数处于晚期。寻找特异性标记物是临床肺癌早期发现、早期治疗和改善预后的关键。
, 百拇医药
病理切片肿瘤细胞核仁的AgNOR颗粒数量，在恶性肿瘤时明显增大和增多，而且分化程度与细胞核仁AgNOR的颗粒数量呈相关关系，目前国内已将其定为肿瘤良恶性的判定标准之一。王恩华等[6]研究发现，AgNOR计数不仅在肿瘤的良恶性鉴别，而且在肺腺癌的分型和分级上，也具有重要的参考价值。另外对宫颈癌和胰腺癌研究也发现[7，8]，AgNOR数量和形态变化不仅可以用于良恶性疾病的鉴别诊断，而且可以用于肿瘤的分型、分级以及判断预后。由于临床需要采集组织标本，操作过程烦琐，使其临床扩大应用受到很大程度限制。
肿瘤的发生和发展受人体免疫系统的监视和抑制，尤其T淋巴细胞是人体的主要免疫效应细胞。体内T淋巴细胞的生物活性变化是反映体内肿瘤恶性程度的重要参数之一。许多关于肿瘤患者T细胞亚群的观察和报道，由于试验方法、观察标准和结果判定的不一致，至今仍没有对临床提供有意义的和结论性的指导。
利用计算机和高分便率图象分析系统对肺癌患者外周血T淋巴细胞转录活性进行自动化定量分析，结果证明炎症患者的rDNA转录活性明显升高，提示炎症反应时人体免疫系统被激活。肺癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性明显低于正常人，而且随着疾病的进展肿瘤患者rDNA转录活性下降越明显。当肿瘤切除后，患者T淋巴细胞rDNA转录活性得到一定程度回升，分析可能是肿瘤切除术后对机体的免疫抑制作用解除的缘故。当肿瘤转移和/或复发时，rDNA转录活性明显下降，说明肿瘤患者的免疫功能进一步受到抑制。
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我们认为肿瘤患者外周血T淋巴细胞转录活性分析可以做为临床肺癌诊断的辅助指标、肺癌治疗的疗效判定、预后追踪观察的指标等，值得进一步全面深入研究。
作者简介：王俊杰，男，内蒙乌兰浩特人，硕士，主治医师。从事临床肿瘤放疗专业。
参考文献
1，Ochs RL,Busch H.Further evidence that phosphoprotein C23(110KD/P15.1) is the nucleolar silver staining protein.Exp Cell Res,1984；152:260
2，Crocker J.Skilbeck N.Nucleolar organizer region associated proteins in cutaneous melanotic lesion:a quantitative study.J Clin Pathol,1987；40:885
, 百拇医药
3，Egan MJ,Crocker J.Nucleolar organizer region in cutaneous tumours.J Pathlo,1987；154:247
4，Anonymous.NORs-a new method for the pathologist.Lancet,1987；1:1413
5，许良中.关于核仁组织区(AgNOR)研究工作的标准化方案.肿瘤，1996；3：402
6，王恩华，戴晓淳，何安光等.AgNOR计数在肺癌诊断及肺腺癌分型中的应用研究.中国医科大学学报，1995；2：132
7，李庆菊，刘秀云，陈正勤等.AgNOR检测对宫颈癌预后的意义.肿瘤防治研究，1996；1：21
8，胡育新，许国铭.胰腺癌AgNORs的定量分析.第二军医大学学报，1995；16(2)：158
收稿日期：1999-7-5, 百拇医药
单位：王俊杰(北京医科大学第三医院肿瘤科 北京 100083)；贾廷珍(北京医科大学第三医院肿瘤科 北京 100083)；杨建良(北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心)；孙凌飞(北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心)；申文江(北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心)
关键词：rDNA；核仁组成区嗜银蛋白；I.S%；I.O.D%
New Page 1 〔摘要〕 目的 通过肺癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性分析，探讨其对肺癌辅助诊断、治疗结果判定和预后监测的意义。方法 利用CIAS-1000型细胞图像分析系统及相关的细胞培养、银染等技术，对20例健康人、20例炎症患者和112例肺癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性进行分析，结果以核仁积分面积与细胞核积分面积的比值(I.S%)和核仁银染积分光密度与细胞核银染积分光密度的比值(I.O.D%)表达。结果 肿瘤患者外周血T淋巴细胞的rDNA转录活性明显下降，与健康人比较，差异有显著意义(P<0.01)；肿瘤转移和/或复发时，T淋巴细胞rDNA转录活性进一步下降(P<0.05)。结论 外周血T淋巴细胞rDNA转录活性分析可以做为肺癌的辅助诊断、治疗疗效的判定和预后的监测指标。
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〔中图分类号〕 R734.2 〔文献标识码〕B
Study on rDNA transcription activity of peripheral blood T lymphocyte cell in lung cancer patients
WANG Jun-jie,JIA Ting-zhen et al.
Beijing Medical University,Beijing 100083
〔Abstract〕 Objective To investigate the clinical significance of rDNA transcription activity of peripheral blood T lymphocytes in lung cancer patients.Methods rDNA transcription activity of T lymphocytes was detected by CIAS-1000 image analysis system in 20 cases of health controls、20 cases of inflammatory patients and 112 patients.Results The rDNA transcription activity of peripheral blood T lymphocytes increased in inflammatory patients and decreased in lung cancer patients(P<0.01).There was a significant difference between early stage and late stage cancer patients(P<0.05).Conclusions The analysis of rDNA transcription activity of peripheral blood T lymphocytes may serve as a lung cancer marker for diagnosis and differential diagnosis、prediction of clinical treatment and as well as for follow-up for lung cancer.
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〔Key words〕 rDNA;AgNOR;I.S%;I.O.D%
细胞核的核仁组成区(nucleolar organizer region,NOR)在细胞周期的中期存在于13、14、15、21、22号染色体短臂的次缢痕上，间期以核仁的形式存在，其主要功能是构成核仁。rDNA周围的生物活性非组蛋白，指导核仁合成和组装rDNA，其相关蛋白(AgNOR)可通过银染方法显示[1]。AgNOR的相对含量更早期、更精确地反映了细胞rDNA转录活性和蛋白质合成的状态[2，3，4]，而且许多研究证实其对肿瘤良、恶性鉴别和肿瘤恶性程度分级上具有诊断价值，但是关于肿瘤患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性分析国内外尚未见报道。
材料和方法
一、研究对象 健康人20例，炎症患者20例及我院1997年9月～1999年4月收治的肺癌患者112例，男78例，女34例，其中鳞癌58例，腺癌45例，小细胞肺癌9例，肺癌术后15例；肺癌Ⅰ～Ⅱ期37例，肺癌Ⅲ期16例，肺癌Ⅳ期44例，其中肺癌术后骨转移14例，肺癌和肺癌术后颅内转移18例，肺癌术后淋巴和肝转移12例，以上均以病理诊断和CT检查结果为依据。
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二、试剂 1.外周血细胞rDNA转录活性分析培养试剂盒由北京福瑞生物工程公司提供。2.银染液：A液为50%AgNO3水溶液，B液为3%甲酸+2%明胶。3.低渗液为0.07mol/L NaCl。
三、实验方法：培养：无菌取静脉血0.5ml，加到rDNA培养瓶中(内有肝素培养液4ml)，置于37℃、CO2培养箱中孵育72小时，每24小时摇晃2～3次。分离：1.取出含血培养液，用吸管将其混匀，吸到5ml离心管中，离心2000转/分，10分钟。2.弃上清液，留底物，加入低渗液5ml，用吸管将其混匀，离心2000转/分。3.弃上清液，留底物，加入固定液5ml，离心。重复。4.弃上清液，留0.5ml，滴在冰冻的载玻片上，每片2～3滴，室温或37℃烘箱中烘干。银染：制好的玻片上分别加3滴A液和3滴B液，加盖玻片，放入80℃～90℃水浴箱中的铝板上，待涂片转变成深黄色时取出，去盖玻片，用水冲去浮色，空气中干燥。
四、图象分析 利用CIAS-1000型细胞图像分析系统(中国科学院大恒集团北京大恒图像视觉有限公司提供)对选择好的T淋巴细胞进行自动化分析，其中I.S%为核仁积分面积与细胞核积分面积的比值，I.O.D%为核仁银染积分光密度与细胞核银染积分光密度的比值，数学模式为：
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式中 m：每组制片数；n：每张制片上被观察的细胞数；a：每个细胞中银染核仁积分总面积；b：每个细胞核的积分面积；c：每个细胞中银染核仁的I.O.D值；d：每个细胞核的I.O.D值。每张涂片计数10个以上细胞，所得结果为计数细胞的平均值。
统计学处理：计算机SAS软件进行F和D检验。
结果
附表 肺癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性分析
例数
I.S%
I.O.D%
健康人
20
, 百拇医药
7.78±1.40
6.41±0.99
炎症患者
20
11.89±1.56*
9.30±0.98*
肺癌术后
15
5.38±0.92*
4.57±0.58*
Ⅰ～Ⅱ期
, 百拇医药
37
4.25±1.03*
4.03±0.41*
Ⅲ期
16
4.21±0.97*
3.59±0.55*
Ⅳ期
44
3.78±1.03**
2.95±1.06**
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肺癌骨转移
14
3.67±0.81**
3.03±0.58**
肺癌颅内转移
18
3.86±1.12**
3.26±0.85**
肺癌术后
其他部位转移
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4.15±1.30**
3.45±1.06**
±S.D *与健康人比较P<0.01；**与Ⅰ～Ⅱ期肿瘤组比较P<0.05由附表可见炎症患者淋巴细胞的I.S%和I.O.D%比值明显高于健康人，而肺癌患者的I.S%和I.O.D%比值均明显低于健康人(P<0.01)，肺癌术后的I.S%和I.O.D%比值明显回升，当肿瘤转移和复发时，I.S%和I.O.D%比值进一步降低，与早期患者比较降低明显，统计学处理差别显著(P<0.05)。
讨论
肺癌是临床预后较差的肿瘤，其原因主要是由于临床发现时大多数处于晚期。寻找特异性标记物是临床肺癌早期发现、早期治疗和改善预后的关键。
, 百拇医药
病理切片肿瘤细胞核仁的AgNOR颗粒数量，在恶性肿瘤时明显增大和增多，而且分化程度与细胞核仁AgNOR的颗粒数量呈相关关系，目前国内已将其定为肿瘤良恶性的判定标准之一。王恩华等[6]研究发现，AgNOR计数不仅在肿瘤的良恶性鉴别，而且在肺腺癌的分型和分级上，也具有重要的参考价值。另外对宫颈癌和胰腺癌研究也发现[7，8]，AgNOR数量和形态变化不仅可以用于良恶性疾病的鉴别诊断，而且可以用于肿瘤的分型、分级以及判断预后。由于临床需要采集组织标本，操作过程烦琐，使其临床扩大应用受到很大程度限制。
肿瘤的发生和发展受人体免疫系统的监视和抑制，尤其T淋巴细胞是人体的主要免疫效应细胞。体内T淋巴细胞的生物活性变化是反映体内肿瘤恶性程度的重要参数之一。许多关于肿瘤患者T细胞亚群的观察和报道，由于试验方法、观察标准和结果判定的不一致，至今仍没有对临床提供有意义的和结论性的指导。
利用计算机和高分便率图象分析系统对肺癌患者外周血T淋巴细胞转录活性进行自动化定量分析，结果证明炎症患者的rDNA转录活性明显升高，提示炎症反应时人体免疫系统被激活。肺癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性明显低于正常人，而且随着疾病的进展肿瘤患者rDNA转录活性下降越明显。当肿瘤切除后，患者T淋巴细胞rDNA转录活性得到一定程度回升，分析可能是肿瘤切除术后对机体的免疫抑制作用解除的缘故。当肿瘤转移和/或复发时，rDNA转录活性明显下降，说明肿瘤患者的免疫功能进一步受到抑制。
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我们认为肿瘤患者外周血T淋巴细胞转录活性分析可以做为临床肺癌诊断的辅助指标、肺癌治疗的疗效判定、预后追踪观察的指标等，值得进一步全面深入研究。
作者简介：王俊杰，男，内蒙乌兰浩特人，硕士，主治医师。从事临床肿瘤放疗专业。
参考文献
1，Ochs RL,Busch H.Further evidence that phosphoprotein C23(110KD/P15.1) is the nucleolar silver staining protein.Exp Cell Res,1984；152:260
2，Crocker J.Skilbeck N.Nucleolar organizer region associated proteins in cutaneous melanotic lesion:a quantitative study.J Clin Pathol,1987；40:885
, 百拇医药
3，Egan MJ,Crocker J.Nucleolar organizer region in cutaneous tumours.J Pathlo,1987；154:247
4，Anonymous.NORs-a new method for the pathologist.Lancet,1987；1:1413
5，许良中.关于核仁组织区(AgNOR)研究工作的标准化方案.肿瘤，1996；3：402
6，王恩华，戴晓淳，何安光等.AgNOR计数在肺癌诊断及肺腺癌分型中的应用研究.中国医科大学学报，1995；2：132
7，李庆菊，刘秀云，陈正勤等.AgNOR检测对宫颈癌预后的意义.肿瘤防治研究，1996；1：21
8，胡育新，许国铭.胰腺癌AgNORs的定量分析.第二军医大学学报，1995；16(2)：158
收稿日期：1999-7-5, 百拇医药