大鼠肠缺血灌注肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡 坏死及继发性坏死与肺损伤
作者：尹晓林 黄建华 金丽娟
单位：尹晓林(广西柳州解放军第158医院内科，545005)；黄建华(解放军第157医院)；金丽娟(第一军医大学)
关键词：
肺泡 肺泡Ⅱ型上皮细胞(EPⅡ)是肺泡膜的重要组成部分。我们观察了肠缺血再灌注时EPⅡ凋亡率、坏死率及继发性坏死及其在肺损伤中的作用，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物分组与模型制作 健康雄性成年Wistar大鼠40只，随机分为正常对照组(N)、肠缺血2 h组(I)、肠缺血2 h再灌注15 min组(R1)、30 min组(R2)、60 min组(R3)共5组，每组8只。1%戊巴比妥0.3 ml/100 g背部皮下注射麻醉，无菌条件下开腹，微动脉夹闭肠系膜上动脉2 h后松夹再灌注。不同时间点活杀动物，留取血浆及肺泡灌洗液(BALF)。
, http://www.100md.com
1.2 EPⅡ分离及鉴定 参考文献[1]，略加改动。动物于不同时间点活杀，生理盐水灌肺驱尽肺内残血，自气管内注入消化液(0.05%胰蛋白酶，0.1%弹性蛋白酶，0.01 DNase,0.01%胶原酶溶于D-Hanks液中)消化20 min，剪碎，过滤，细胞悬液洗3次后以3×106/ml接种，培养3～3.5 h后收集悬浮细胞，Hanks液洗3次，改良巴氏染色法示其纯度为75%～80%。
1.3 细胞凋亡率、坏死率、继发性坏死率测定 采用Annexin-V、PI(碘化丙啶)双标染色法。取1×106个细胞，加入100 μl标记液(Annexin-V原液20 μl，宝灵曼公司2 mg/ml PI 20 μl加入孵化液1 ml)重悬，避光保存10～15 min，加入0.4 ml孵化液，过滤后上流式细胞仪测试分析。
1.4 通透指数测定 紫外光光度法测定BALF、血浆蛋白含量，通透指数(LI)=BALF蛋白含量/血浆蛋白含量。
, 百拇医药
1.5 统计分析 采用单因素方差分析和相关分析。
2 结果
2.1 肠缺血再灌注时肺通透指数变化 单纯肠缺血再灌注并不引起肺损伤，再灌注后迅速出现肺通透指数的升高，并随再灌注时间延长而增加(见附表)。
2.2 肠缺血再灌注时EPⅡ凋亡率、坏死率及继发性坏死率变化 单纯PI染色阴性为凋亡细胞，PI染色阳性为坏死细胞，双标染色阳性为继发性坏死细胞。观察表明，肠缺血再灌注时早期出现细胞凋亡，再灌注晚期细胞坏死率上升，其中部分为凋亡后继发性坏死(见附表)。
附表 大鼠肠缺血再灌注时肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡、坏死、继发性坏死率及肺通透指数变化(
±s，n=8)
, 百拇医药
N
Ⅰ
R1
R2
R3
LI×10[-2]
3.12+1.57
3.90+0.98
5.24+1.06△
5.94+2.27△*
7.11+2.10△*
, 百拇医药
凋亡率(%)
0.38+0.41
2.15+3.72
12.73+5.08△
31.25+14.47△*
8.72+6.93
坏死率(%)
1.12+1.89
1.85+2.21
2.18+1.93
7.92+4.33
, 百拇医药
14.27+10.84△*
继发性坏
0.13+0.18
0.27+0.22
0.45+0.37
1.57+0.93
5.11+3.14△*
死率(%)
△：与N组比较，P<0.05；*：与I组比较，P<0.05
2.3 相关分析 相关分析表明，肠缺血再灌注30 min时通透指数与凋亡率相关(P<0.05)，再灌注60 min时肺通透指数与坏死率相关(P<0.05)，其余均无显著相关。
, 百拇医药
3 讨论
细胞凋亡是一种与坏死截然不同的细胞自主性死亡方式，细胞凋亡时胞浆、染色质浓缩、DNA降解为180 bp不同整数倍片段，出现凋亡小体，细胞膜完整，内容物不溢出，凋亡小体迅速为邻近细胞吞噬而不引起炎症反应[2]。细胞凋亡后若不被邻近细胞吞噬可以发生继发性坏死，即原来凋亡的细胞表现出坏死的性质如膜通透性增高，内容物溢出，核碎裂等[3]。Annexin-V可特异性识别凋亡细胞，PI则只能通过坏死细胞的细胞膜，因而双标法可将细胞分为正常、凋亡、坏死、继发性坏死细胞群。近年来逐渐注意到多器官功能不全综合征(MODS)中有广泛的细胞凋亡[4]。大量的细胞凋亡无疑会影响脏器功能，另一方面，调亡细胞不引起炎症反应，因而可能是机体清除衰老细胞和不适应细胞的一种保护机制。然而，凋亡细胞若不及时清除，又会发生继发性坏死而触发炎症反应，因而细胞凋亡在MODS中的作用并未肯定。
肠缺血再灌注可以引起肝、肾、肺损伤，因而可以复制MODS[5]。双标法表明，肠缺血再灌注早期以EPⅡ凋亡为主，晚期以坏死为主。观察肠缺血再灌注引起的MODS中肺损伤与EPⅡ凋亡、坏死及继发性坏死为主。发现早期的损伤与EPⅡ的凋亡相关，晚期肺损伤与EPⅡ坏死相关。虽然统计分析并不能证明EPⅡ继发性坏死与肺损伤有关，但是坏死细胞其中相当部分是由凋亡后继发性坏死而来，这表明继发性坏死部分参与了晚期肺损伤的发生。
, 百拇医药
总之，实验表明肠缺血再灌注时EPⅡ凋亡对肺损伤有着不利作用，EPⅡ的凋亡不但参与了早斯的肺损伤，还可以通过继发性坏死而影响晚期肺损伤的发生。■
参考文献：
[1]Meredith Dand Boud CA.Dipeptide transport characteristics of the apical membrane of rat typeⅡepthelail pneumocytes.Am J Physiol,1995,269:L137-132.
[2]Cobb JP,Hotchkiss RS,Kort IE,et al .Mechanism of cell injury and death.Br J Aneathesia,1999,77:3-10.
[3]Vermes I,Haenne C,Kiches DJ,et al.Apoptosis and secondory necrosis of lymphocytes in culture.Acta Haematol, 1997,98:1.
, 百拇医药
[4]Bone RC,Grodzia CJ,Balk RA,et al.Sepisis:A new hypothesis for pathogenesis of the diseases process.Chest ,1997,112:235-243.
[5]Oldham KT,Guea KS,Magee JC,et al.The systemic consequences of intestinal ischemia reperfusion injury.J Vas Sury,1997,18:137-138.
收稿日期：1999-09-13
修回日期：1999-10-25, http://www.100md.com
单位：尹晓林(广西柳州解放军第158医院内科，545005)；黄建华(解放军第157医院)；金丽娟(第一军医大学)
关键词：
肺泡 肺泡Ⅱ型上皮细胞(EPⅡ)是肺泡膜的重要组成部分。我们观察了肠缺血再灌注时EPⅡ凋亡率、坏死率及继发性坏死及其在肺损伤中的作用，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物分组与模型制作 健康雄性成年Wistar大鼠40只，随机分为正常对照组(N)、肠缺血2 h组(I)、肠缺血2 h再灌注15 min组(R1)、30 min组(R2)、60 min组(R3)共5组，每组8只。1%戊巴比妥0.3 ml/100 g背部皮下注射麻醉，无菌条件下开腹，微动脉夹闭肠系膜上动脉2 h后松夹再灌注。不同时间点活杀动物，留取血浆及肺泡灌洗液(BALF)。
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1.2 EPⅡ分离及鉴定 参考文献[1]，略加改动。动物于不同时间点活杀，生理盐水灌肺驱尽肺内残血，自气管内注入消化液(0.05%胰蛋白酶，0.1%弹性蛋白酶，0.01 DNase,0.01%胶原酶溶于D-Hanks液中)消化20 min，剪碎，过滤，细胞悬液洗3次后以3×106/ml接种，培养3～3.5 h后收集悬浮细胞，Hanks液洗3次，改良巴氏染色法示其纯度为75%～80%。
1.3 细胞凋亡率、坏死率、继发性坏死率测定 采用Annexin-V、PI(碘化丙啶)双标染色法。取1×106个细胞，加入100 μl标记液(Annexin-V原液20 μl，宝灵曼公司2 mg/ml PI 20 μl加入孵化液1 ml)重悬，避光保存10～15 min，加入0.4 ml孵化液，过滤后上流式细胞仪测试分析。
1.4 通透指数测定 紫外光光度法测定BALF、血浆蛋白含量，通透指数(LI)=BALF蛋白含量/血浆蛋白含量。
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1.5 统计分析 采用单因素方差分析和相关分析。
2 结果
2.1 肠缺血再灌注时肺通透指数变化 单纯肠缺血再灌注并不引起肺损伤，再灌注后迅速出现肺通透指数的升高，并随再灌注时间延长而增加(见附表)。
2.2 肠缺血再灌注时EPⅡ凋亡率、坏死率及继发性坏死率变化 单纯PI染色阴性为凋亡细胞，PI染色阳性为坏死细胞，双标染色阳性为继发性坏死细胞。观察表明，肠缺血再灌注时早期出现细胞凋亡，再灌注晚期细胞坏死率上升，其中部分为凋亡后继发性坏死(见附表)。
附表 大鼠肠缺血再灌注时肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡、坏死、继发性坏死率及肺通透指数变化(
±s，n=8), 百拇医药
N
Ⅰ
R1
R2
R3
LI×10[-2]
3.12+1.57
3.90+0.98
5.24+1.06△
5.94+2.27△*
7.11+2.10△*
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凋亡率(%)
0.38+0.41
2.15+3.72
12.73+5.08△
31.25+14.47△*
8.72+6.93
坏死率(%)
1.12+1.89
1.85+2.21
2.18+1.93
7.92+4.33
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14.27+10.84△*
继发性坏
0.13+0.18
0.27+0.22
0.45+0.37
1.57+0.93
5.11+3.14△*
死率(%)
△：与N组比较，P<0.05；*：与I组比较，P<0.05
2.3 相关分析 相关分析表明，肠缺血再灌注30 min时通透指数与凋亡率相关(P<0.05)，再灌注60 min时肺通透指数与坏死率相关(P<0.05)，其余均无显著相关。
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3 讨论
细胞凋亡是一种与坏死截然不同的细胞自主性死亡方式，细胞凋亡时胞浆、染色质浓缩、DNA降解为180 bp不同整数倍片段，出现凋亡小体，细胞膜完整，内容物不溢出，凋亡小体迅速为邻近细胞吞噬而不引起炎症反应[2]。细胞凋亡后若不被邻近细胞吞噬可以发生继发性坏死，即原来凋亡的细胞表现出坏死的性质如膜通透性增高，内容物溢出，核碎裂等[3]。Annexin-V可特异性识别凋亡细胞，PI则只能通过坏死细胞的细胞膜，因而双标法可将细胞分为正常、凋亡、坏死、继发性坏死细胞群。近年来逐渐注意到多器官功能不全综合征(MODS)中有广泛的细胞凋亡[4]。大量的细胞凋亡无疑会影响脏器功能，另一方面，调亡细胞不引起炎症反应，因而可能是机体清除衰老细胞和不适应细胞的一种保护机制。然而，凋亡细胞若不及时清除，又会发生继发性坏死而触发炎症反应，因而细胞凋亡在MODS中的作用并未肯定。
肠缺血再灌注可以引起肝、肾、肺损伤，因而可以复制MODS[5]。双标法表明，肠缺血再灌注早期以EPⅡ凋亡为主，晚期以坏死为主。观察肠缺血再灌注引起的MODS中肺损伤与EPⅡ凋亡、坏死及继发性坏死为主。发现早期的损伤与EPⅡ的凋亡相关，晚期肺损伤与EPⅡ坏死相关。虽然统计分析并不能证明EPⅡ继发性坏死与肺损伤有关，但是坏死细胞其中相当部分是由凋亡后继发性坏死而来，这表明继发性坏死部分参与了晚期肺损伤的发生。
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总之，实验表明肠缺血再灌注时EPⅡ凋亡对肺损伤有着不利作用，EPⅡ的凋亡不但参与了早斯的肺损伤，还可以通过继发性坏死而影响晚期肺损伤的发生。■
参考文献：
[1]Meredith Dand Boud CA.Dipeptide transport characteristics of the apical membrane of rat typeⅡepthelail pneumocytes.Am J Physiol,1995,269:L137-132.
[2]Cobb JP,Hotchkiss RS,Kort IE,et al .Mechanism of cell injury and death.Br J Aneathesia,1999,77:3-10.
[3]Vermes I,Haenne C,Kiches DJ,et al.Apoptosis and secondory necrosis of lymphocytes in culture.Acta Haematol, 1997,98:1.
, 百拇医药
[4]Bone RC,Grodzia CJ,Balk RA,et al.Sepisis:A new hypothesis for pathogenesis of the diseases process.Chest ,1997,112:235-243.
[5]Oldham KT,Guea KS,Magee JC,et al.The systemic consequences of intestinal ischemia reperfusion injury.J Vas Sury,1997,18:137-138.
收稿日期：1999-09-13
修回日期：1999-10-25, http://www.100md.com