农杆菌介导的药用植物的转化
作者：宋经元 张荫麟 任春玲
单位：宋经元(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 100094)；张荫麟(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 100094)；任春玲(河北省科学院 微生物研究所，河北 保定 071051)
关键词：农杆菌；药用植物；毛状根；冠瘿组织；次生物质▲
摘 要摘 要：目的：介绍农杆菌转化药用植物的概况。方法：从外植体选择、转化的证实、转基因组织和器官培养生产次生物质、转基因植物的获得等方面棕述了农杆菌转化药用植物的概况，重点论述毛状根和冠瘿组织培养生产次生物质的研究进展。结果：利用转基因组织和器官培养能生产多种次生物质，通过农杆菌介导的转化可获得转基因药用植物。结论：农杆菌介导的转化在药用植物基因工程方面应用广泛，意义重大。
农杆菌介导的转化是外源DNA进入植物细胞的最成功和应用最广泛的方法，因为农杆菌可浸染大多数双子叶植物[1]和少数单子叶植物[2]，甚至是裸子植物[3]，并能以多种外植体作为浸染对象，转化频率较高，易于重复，方法简便。本文就农杆菌转化药用植物的概况作一综述，内容包括外植体选择、转化的证实、转基因组织和器官培养生产次生物质、转基因植物的获得等，重点论述转基因组织和器官培养生产次生物质。
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1 外植体选择
用农杆菌转化成功的报道中，外植体选择非常广泛，主要包括以下4大类，叶类：叶盘[4，5]、叶柄[6]、叶主脉[7]、子叶[8]；茎类：茎的节间薄片[9]、茎段共培养[10]、茎段末端接种[8，11]、无菌苗的茎穿刺接种[12，13]；下胚轴[14]和芽[15]。
以上表明茎与叶是使用最多的外植体，也是容易转化成功的外植体，转化组织的除菌大多在含抗生素的培养基上进行，也有用温度(37～40℃)除菌的[16]。为了提高转化频率，有报道在农杆菌培养液中加入少量酚类化合物(如乙酰丁香酮等)活化农杆菌，增强其致病力[15]。
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2 转化的证实
大多数转化组织和器官通过高压纸电泳检测相应冠瘿碱的存在和Southern blot杂交分析显示清晰条带证实转化成功。对于含有报告基因(如NPT-Ⅱ，GUS)的转化则检测报告基因的表达情况予以证实。
3 转基因组织和器官培养生产次生物质
由于常规细胞培养需要添加植物激素、生长慢、产物不稳定等缺点，而转基因组织和器官培养则具有生长迅速、不需外源添加植物激素、能较稳定地生产有效成分等优点，因此越来越受到人们的关注，成为近10年来植物细胞培养领域的研究热点，转基因组织和器官培养主要是指毛状根和冠瘿组织培养。冠瘿组是根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens侵染植物而形成的，这是由根癌农杆菌的Ti质粒(tumor-inducing plasmid)含有一段特殊的DNA即T-DNA(transferred DNA),T-DNA上具有编码生长素合成酶的基因iaaM(tms1)、iaaH(tms 2)及编码细胞分裂素合成酶的基因ipt(tmr)，当农杆菌侵染植物时可以将T-DNA整合到植物细胞的基因组，在植物细胞内iaaM和iaaH基因分别表达编码色氨酸单加氧酶及吲哚乙酸酰胺水解酶，这两个酶共同作用合成吲哚乙酸(IAA)，而ipt基因表达编码异戍烯基转移酶，该酶催化合成细胞分裂素——异戍烯腺嘌呤(iPA)。T-DNA指导的生长素及细胞分裂素的合成导致了转化植物组织出现冠瘿瘤(crown gall)的形态[17]。而毛状根的形成则与发根农杆菌A.rhizogenes的Ri质粒(root-inducing plasmid)有关，Ri质粒也含有一段将T-DNA(有的中间插入大约15 kb的不转移的DNA片段 T-DNA分成左右两段分别为TR-DNA，TL-DNA)，T-DNA上有与tms1及tms 2基因同源的片段，还有4个与根的形态发生有关的位点rolABCD，这些位点及tms基因的同源片段在植物细胞中表达导致了毛状根形态的发生[18]。
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3.1 毛状根培养与次生物质的产生
早在1987年，Hamill等[19]就评述了毛状根培养的优越性，认为毛状根培养是一种非常有前途的培养方法，近年来毛状根培养在许多药用植物上获得成功。
Parr等[20]用发根农杆菌LBA9402感染长春花Catharanthus roseus的叶片获得毛状根，无菌毛状根在修改的B5培养基中生长良好，毛状根除能产生阿吗碱、蛇根碱、文朵宁(vindolinine)、长春质碱以外，还可产生长春碱(0.05μg.g-1干重)，尽管含量非常低，但表明毛状根可以合成某些悬浮细胞培养不能合成的重要的次生物质。金鸡纳Cinchona ledgeriana的毛状根培养物可以合成一系列喹啉生物碱：奎宁、奎尼定、辛可尼定以及奎胺(quinamine)等，总生物碱中1%被分泌到培养基中[7]。Aoki等[21]的研究表明，颠茄Atropa belladonna的不同毛状根株系在生长与莨菪烷生物碱的产生上均不相同，并且与基本培养基有关，因此在毛状根的培养中株系选择也是非常重要的。在Datura candida杂种植物的毛状根培养物中生物碱含量为0.68%干重，是原植物根中的2.6倍，生物碱中莨菪胺(scopolamine)与天仙子胺(hyoscyamine)的含量比为5∶1，表明该毛状根培养物可以考虑用作莨菪胺的生产来源[22]。
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1993年Inomata等[23]报道人参的毛状根培养没有一点延迟期，在培养的前两周生长很快，因此通过每7 d更换1次培养基来保持毛状根的快速生长，培养32 d增长倍数达到31倍，是所有报道的人参培养物中增长倍数最高的，在此过程中，总人参皂甙(Rg组，Rb组，Ro)含量达到1.7%～2.2%，相当于田间栽培5年生人参根中的皂甙含量水平。进一步在叶轮片式生物反应器(turbine-blade type bioreactor)中采用每7 d更换1次培养基的方法获得了与摇瓶中类似的结果，培养36 d，收获毛状根干重15.8 g*L-1，人参皂甙的含量1.7 %，这一结果表明该毛状根株系具有良好的开发应用前景。缬草Valeriana officinalis L.var.sambucifolia Mikan的毛状根培养物中缬草三酯(Valepotriate)的含量显著高于未转化的根培养物，最高含量达10.3%干重，毛状根生长和缬草三酯的生产与不同的培养基有关[12]。Yonemitsu等[24]比较了不同培养基对半边莲Lobelia inflata 毛状根培养物生长及山梗烷醇酮(lobeline)生产的影响，发现MS，1/2MS，B5培养基有利于毛状根生长，而NN培养基则有利于山梗烷醇酮的生产。
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此外，童氏老鹳草Geranium thunbergii[6]、万寿菊Tagetes erecta[8]、茜草Rubia tinctorum[10]、短叶红豆杉Taxus brevifolia[15]、甘草Glycyrrhizauralensis[16]等药用植物的毛状根培养系统也被建立。
对于有效成分在叶中的药用植物有人也试图建立毛状根培养系统来生产活性成分。毛花洋地黄Digitalis lanata的毛状根在光下培养变成绿色毛状根，其合成卡烯内酯(cardenolides)的能力极显著增加，是黑暗中的600倍[4]。而甜叶菊Stevia rebaudiana的毛状根培养物却无法产生卡哈苡甙(stevioside)，这一成分在该植物的茎尖培养中光下即可产生[9]。补骨脂属植物的根中含有呋喃酮香豆素(furanocoumarins)类化合物如补骨脂类(psoralen)和当归根素(angelicin)，但这类化合物是在地上部分合成之后运送到根部的，对于补骨脂属数个种进行的毛状根培养表明，无论是在光下培养，还是改变营养成分的浓度以及添加某些前体，毛状根均不能合成呋喃酮香豆素类化合物[14]。这些研究引起了人们对冠瘿组织(crown gall tissue)培养系统的重视。
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3.2 冠瘿组织培养与次生物质的产生
利用冠瘿组织培养不仅能产生原植物根中合成的有效成分，而且还能产生原植物地上部分特别是叶中合成的成分，因此冠瘿组织作为一种新型的培养系统将具有更为广阔的应用前景。
首先利用冠瘿组织培养生产次生代谢物的是Payne等人[13]，他们用根癌农杆菌菌种A6感染金鸡纳Cinchona ledgeriana无菌苗的茎节，获得了两个无菌的冠瘿组织株系CL2A6和CL3A6，这两个株系在无激素的B5培养基上生产良好，并且均能合成一系列喹啉生物碱，其中辛可宁(cinchonine)和辛可尼定(cinchonidine)是主要成分，株系CL2A6生产的生物碱比株系CL3A6多5倍。同时他们还研究了外加植物激素、光质、光强、光暗交替、培养基成分等因素对株系CL2A6生产生物碱的影响。
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Moldenhauer等[5]报道了毛花洋地黄Digitalis lanata的冠瘿组织中卡烯内酯积累的情况。用根癌农杆菌B6S 3和tmr-338直接感染温室中生长的毛花洋地黄的叶片，均能形成冠瘿瘤，生长3周的冠瘿瘤被切下分析卡烯内酯的含量，不同的冠瘿瘤株系所含毛地黄毒苷衍生物(digitoxin derivatives)和异羟基毛地黄、毒苷原衍生物(digoxin derivatives)的量存在明显区别，个别株系毛地黄毒苷衍生物的含量要高于原植物叶片中的含量。而离体培养的冠瘿组织在无激素的Nm1培养基上生长良好，没有任何分化，在光下也不变绿，冠瘿组织中仅含有相当少量(与原植物叶片中的相比)的毛地黄毒苷配基衍生物(digitoxigenin derivatives)约0.026 μmol.g-1干重，而未转化的常规细胞培养物中含量更低仅0.001 μmol.g-1干重。冠瘿组织连续培养12个月期间卡烯内酯的含量没有减少，这表明冠瘿组织能够从头(de novo)合成卡烯内酯。
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在柠檬留兰香Mentha citrata的冠瘿组织培养中，冠瘿组织呈现典型的畸胎瘤(teratomas)表型，并分化大量的茎，经电镜观察发现分化的叶表面存在腺体(积累柠檬留兰香油的主要成分萜烯化合物的场所)，经气相色谱法分析证实冠瘿组织中主要含有萜烯化合物芳樟醇(linalool)和乙酸芳樟酸(linaly-l acetate)，这两个化合物也是原植物叶中的主要成分[11]。这一研究表明冠瘿组织培养是研究植物地上部分次生代谢物形成的有用系统，并具有大规模培养生产地上部分次生代谢物的潜力。我们研究发现丹参Salvia miltiorrhiza的冠瘿组织具有合成根中所含活性成分丹参酮类化合物的能力[25]，同时不同培养基和真菌诱导子对丹参冠瘿组织生产丹参酮的能力有显著影响。
3.3 毛状根与冠瘿组织的共培养
在植物体内许多次生物质的合成需要地上部分和地下部分的共同参与，根中产生的前体也许随后被转运到叶中转化为另一种化合物，反之亦然，叶中产生的前体也许要到根中参与进一步的反应而变为最终产物。在这种情况下，酶的表达具有器官特异性，因此离体培养无论是毛状根还是冠瘿组织均不能合成所需产物。为了解决这一问题，最近有的学者充分利用毛状根和冠瘿组织具有激素自养性的特点，在同一培养基中共同培养毛状根与冠瘿组织，获得了较好的结果。例如，澳大利亚学者[26]研究发现颠茄A.belladonna的毛状根与Duboisia hybrid的冠瘿组织共培养时，莨菪胺的含量显著增加，而分别单独培养时均不产生莨菪胺，仅在毛状根培养中产生一定量的天仙子胺，由于莨菪胺的副作用小，市场价值大，所以研究毛状根与冠瘿组织的共培养条件，有可能用于莨菪胺的大规模生产。这一实验为某些重要次生物质的生产提供了一条新思路。
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4 转基因药用植物的获得
农杆菌转化药用植物，一般通过不定芽发生途径再生植株[27～29]，也有经过愈伤组织途径[30]再生的。利用农杆菌将外源基因导入药用植物是对现有药用植物实施品质改良的一个重要方面，也可以用于研究外源基因在药用植物中的表达调控。
据刘伟华等[27]报道发根农杆菌15834感染条叶龙胆Gentiana manshurica,诱导产生了毛状根，并进一步分化得到再生的龙胆植株，再生的龙胆丛生苗可以在不含激素的简化培养基上快速繁殖，转化的植株具有发达的根系，根部龙胆苦甙的含量比对照高，为东北龙胆的育种提供了一条新途径。我们[28]研究发现农杆菌转化后的丹参植株在形态、根产量、丹参酮含量上和对照丹参有很大差别，发根农杆菌15834，LBA9402转化后的再生植株具有典型的毛状根再生植物的特征，如叶片皱缩，节间缩短，植株矮化，须根发达等，而根癌农杆菌C58转化后的植物株形高大，根系发达粗壮，产量高，丹参酮含量高于对照，我们认为合理推广此项生物技术有利于良种繁育，提高药材质量。为了增强颠茄对除草剂的抗性，Saito[29]等构建了一个嵌合载体pARK5，含有CaMV35S启动子控制的bar基因，具有pARK5和pRi15834两个载体的发根农杆菌感染颠茄叶盘，获得了毛状根并分化出小植株，转基因植株及其后代显示了对除草剂phosphinothricin和bialaphos的抗性，且在转化的再生植株中含有正常的托品(tropane)生物碱。这一结果表明可以将农业上某些有用的基因(如抗虫、抗病毒、抗寒、抗除草剂等的基因)通过Ri质粒二元载体系统成功地应用到药用植物上。
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王慧中等[30]报道宁夏枸杞Lycium barbarum的幼茎能被含非致瘤性Ti质粒载体的根癌农杆菌感染，获得的抗性愈伤组织在选择分化培养基上分化出芽点，并长出完整小植株，对再生植株的NPT-Ⅱ酶活性检测及DNA分子杂交表明，外源基因已整合到枸杞细胞的核基因组上，并能在植株水平表达出相应性状，该研究为外源基因的导入建立了一个快速简便的枸杞转化再生系统。
目前已经获得的转基因药用植物的种类还不多见，但在理论研究和实际应用上已显示出巨大潜力。
参考文献：
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[30]王慧中，黄发灿，李安生，等.枸杞转基因植株的再生.生物工程学报，1991,7(3)：220.
收稿日期：1999-04-27, http://www.100md.com
单位：宋经元(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 100094)；张荫麟(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 100094)；任春玲(河北省科学院 微生物研究所，河北 保定 071051)
关键词：农杆菌；药用植物；毛状根；冠瘿组织；次生物质▲
摘 要摘 要：目的：介绍农杆菌转化药用植物的概况。方法：从外植体选择、转化的证实、转基因组织和器官培养生产次生物质、转基因植物的获得等方面棕述了农杆菌转化药用植物的概况，重点论述毛状根和冠瘿组织培养生产次生物质的研究进展。结果：利用转基因组织和器官培养能生产多种次生物质，通过农杆菌介导的转化可获得转基因药用植物。结论：农杆菌介导的转化在药用植物基因工程方面应用广泛，意义重大。
农杆菌介导的转化是外源DNA进入植物细胞的最成功和应用最广泛的方法，因为农杆菌可浸染大多数双子叶植物[1]和少数单子叶植物[2]，甚至是裸子植物[3]，并能以多种外植体作为浸染对象，转化频率较高，易于重复，方法简便。本文就农杆菌转化药用植物的概况作一综述，内容包括外植体选择、转化的证实、转基因组织和器官培养生产次生物质、转基因植物的获得等，重点论述转基因组织和器官培养生产次生物质。
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1 外植体选择
用农杆菌转化成功的报道中，外植体选择非常广泛，主要包括以下4大类，叶类：叶盘[4，5]、叶柄[6]、叶主脉[7]、子叶[8]；茎类：茎的节间薄片[9]、茎段共培养[10]、茎段末端接种[8，11]、无菌苗的茎穿刺接种[12，13]；下胚轴[14]和芽[15]。
以上表明茎与叶是使用最多的外植体，也是容易转化成功的外植体，转化组织的除菌大多在含抗生素的培养基上进行，也有用温度(37～40℃)除菌的[16]。为了提高转化频率，有报道在农杆菌培养液中加入少量酚类化合物(如乙酰丁香酮等)活化农杆菌，增强其致病力[15]。
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2 转化的证实
大多数转化组织和器官通过高压纸电泳检测相应冠瘿碱的存在和Southern blot杂交分析显示清晰条带证实转化成功。对于含有报告基因(如NPT-Ⅱ，GUS)的转化则检测报告基因的表达情况予以证实。
3 转基因组织和器官培养生产次生物质
由于常规细胞培养需要添加植物激素、生长慢、产物不稳定等缺点，而转基因组织和器官培养则具有生长迅速、不需外源添加植物激素、能较稳定地生产有效成分等优点，因此越来越受到人们的关注，成为近10年来植物细胞培养领域的研究热点，转基因组织和器官培养主要是指毛状根和冠瘿组织培养。冠瘿组是根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens侵染植物而形成的，这是由根癌农杆菌的Ti质粒(tumor-inducing plasmid)含有一段特殊的DNA即T-DNA(transferred DNA),T-DNA上具有编码生长素合成酶的基因iaaM(tms1)、iaaH(tms 2)及编码细胞分裂素合成酶的基因ipt(tmr)，当农杆菌侵染植物时可以将T-DNA整合到植物细胞的基因组，在植物细胞内iaaM和iaaH基因分别表达编码色氨酸单加氧酶及吲哚乙酸酰胺水解酶，这两个酶共同作用合成吲哚乙酸(IAA)，而ipt基因表达编码异戍烯基转移酶，该酶催化合成细胞分裂素——异戍烯腺嘌呤(iPA)。T-DNA指导的生长素及细胞分裂素的合成导致了转化植物组织出现冠瘿瘤(crown gall)的形态[17]。而毛状根的形成则与发根农杆菌A.rhizogenes的Ri质粒(root-inducing plasmid)有关，Ri质粒也含有一段将T-DNA(有的中间插入大约15 kb的不转移的DNA片段 T-DNA分成左右两段分别为TR-DNA，TL-DNA)，T-DNA上有与tms1及tms 2基因同源的片段，还有4个与根的形态发生有关的位点rolABCD，这些位点及tms基因的同源片段在植物细胞中表达导致了毛状根形态的发生[18]。
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3.1 毛状根培养与次生物质的产生
早在1987年，Hamill等[19]就评述了毛状根培养的优越性，认为毛状根培养是一种非常有前途的培养方法，近年来毛状根培养在许多药用植物上获得成功。
Parr等[20]用发根农杆菌LBA9402感染长春花Catharanthus roseus的叶片获得毛状根，无菌毛状根在修改的B5培养基中生长良好，毛状根除能产生阿吗碱、蛇根碱、文朵宁(vindolinine)、长春质碱以外，还可产生长春碱(0.05μg.g-1干重)，尽管含量非常低，但表明毛状根可以合成某些悬浮细胞培养不能合成的重要的次生物质。金鸡纳Cinchona ledgeriana的毛状根培养物可以合成一系列喹啉生物碱：奎宁、奎尼定、辛可尼定以及奎胺(quinamine)等，总生物碱中1%被分泌到培养基中[7]。Aoki等[21]的研究表明，颠茄Atropa belladonna的不同毛状根株系在生长与莨菪烷生物碱的产生上均不相同，并且与基本培养基有关，因此在毛状根的培养中株系选择也是非常重要的。在Datura candida杂种植物的毛状根培养物中生物碱含量为0.68%干重，是原植物根中的2.6倍，生物碱中莨菪胺(scopolamine)与天仙子胺(hyoscyamine)的含量比为5∶1，表明该毛状根培养物可以考虑用作莨菪胺的生产来源[22]。
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1993年Inomata等[23]报道人参的毛状根培养没有一点延迟期，在培养的前两周生长很快，因此通过每7 d更换1次培养基来保持毛状根的快速生长，培养32 d增长倍数达到31倍，是所有报道的人参培养物中增长倍数最高的，在此过程中，总人参皂甙(Rg组，Rb组，Ro)含量达到1.7%～2.2%，相当于田间栽培5年生人参根中的皂甙含量水平。进一步在叶轮片式生物反应器(turbine-blade type bioreactor)中采用每7 d更换1次培养基的方法获得了与摇瓶中类似的结果，培养36 d，收获毛状根干重15.8 g*L-1，人参皂甙的含量1.7 %，这一结果表明该毛状根株系具有良好的开发应用前景。缬草Valeriana officinalis L.var.sambucifolia Mikan的毛状根培养物中缬草三酯(Valepotriate)的含量显著高于未转化的根培养物，最高含量达10.3%干重，毛状根生长和缬草三酯的生产与不同的培养基有关[12]。Yonemitsu等[24]比较了不同培养基对半边莲Lobelia inflata 毛状根培养物生长及山梗烷醇酮(lobeline)生产的影响，发现MS，1/2MS，B5培养基有利于毛状根生长，而NN培养基则有利于山梗烷醇酮的生产。
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此外，童氏老鹳草Geranium thunbergii[6]、万寿菊Tagetes erecta[8]、茜草Rubia tinctorum[10]、短叶红豆杉Taxus brevifolia[15]、甘草Glycyrrhizauralensis[16]等药用植物的毛状根培养系统也被建立。
对于有效成分在叶中的药用植物有人也试图建立毛状根培养系统来生产活性成分。毛花洋地黄Digitalis lanata的毛状根在光下培养变成绿色毛状根，其合成卡烯内酯(cardenolides)的能力极显著增加，是黑暗中的600倍[4]。而甜叶菊Stevia rebaudiana的毛状根培养物却无法产生卡哈苡甙(stevioside)，这一成分在该植物的茎尖培养中光下即可产生[9]。补骨脂属植物的根中含有呋喃酮香豆素(furanocoumarins)类化合物如补骨脂类(psoralen)和当归根素(angelicin)，但这类化合物是在地上部分合成之后运送到根部的，对于补骨脂属数个种进行的毛状根培养表明，无论是在光下培养，还是改变营养成分的浓度以及添加某些前体，毛状根均不能合成呋喃酮香豆素类化合物[14]。这些研究引起了人们对冠瘿组织(crown gall tissue)培养系统的重视。
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3.2 冠瘿组织培养与次生物质的产生
利用冠瘿组织培养不仅能产生原植物根中合成的有效成分，而且还能产生原植物地上部分特别是叶中合成的成分，因此冠瘿组织作为一种新型的培养系统将具有更为广阔的应用前景。
首先利用冠瘿组织培养生产次生代谢物的是Payne等人[13]，他们用根癌农杆菌菌种A6感染金鸡纳Cinchona ledgeriana无菌苗的茎节，获得了两个无菌的冠瘿组织株系CL2A6和CL3A6，这两个株系在无激素的B5培养基上生产良好，并且均能合成一系列喹啉生物碱，其中辛可宁(cinchonine)和辛可尼定(cinchonidine)是主要成分，株系CL2A6生产的生物碱比株系CL3A6多5倍。同时他们还研究了外加植物激素、光质、光强、光暗交替、培养基成分等因素对株系CL2A6生产生物碱的影响。
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Moldenhauer等[5]报道了毛花洋地黄Digitalis lanata的冠瘿组织中卡烯内酯积累的情况。用根癌农杆菌B6S 3和tmr-338直接感染温室中生长的毛花洋地黄的叶片，均能形成冠瘿瘤，生长3周的冠瘿瘤被切下分析卡烯内酯的含量，不同的冠瘿瘤株系所含毛地黄毒苷衍生物(digitoxin derivatives)和异羟基毛地黄、毒苷原衍生物(digoxin derivatives)的量存在明显区别，个别株系毛地黄毒苷衍生物的含量要高于原植物叶片中的含量。而离体培养的冠瘿组织在无激素的Nm1培养基上生长良好，没有任何分化，在光下也不变绿，冠瘿组织中仅含有相当少量(与原植物叶片中的相比)的毛地黄毒苷配基衍生物(digitoxigenin derivatives)约0.026 μmol.g-1干重，而未转化的常规细胞培养物中含量更低仅0.001 μmol.g-1干重。冠瘿组织连续培养12个月期间卡烯内酯的含量没有减少，这表明冠瘿组织能够从头(de novo)合成卡烯内酯。
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在柠檬留兰香Mentha citrata的冠瘿组织培养中，冠瘿组织呈现典型的畸胎瘤(teratomas)表型，并分化大量的茎，经电镜观察发现分化的叶表面存在腺体(积累柠檬留兰香油的主要成分萜烯化合物的场所)，经气相色谱法分析证实冠瘿组织中主要含有萜烯化合物芳樟醇(linalool)和乙酸芳樟酸(linaly-l acetate)，这两个化合物也是原植物叶中的主要成分[11]。这一研究表明冠瘿组织培养是研究植物地上部分次生代谢物形成的有用系统，并具有大规模培养生产地上部分次生代谢物的潜力。我们研究发现丹参Salvia miltiorrhiza的冠瘿组织具有合成根中所含活性成分丹参酮类化合物的能力[25]，同时不同培养基和真菌诱导子对丹参冠瘿组织生产丹参酮的能力有显著影响。
3.3 毛状根与冠瘿组织的共培养
在植物体内许多次生物质的合成需要地上部分和地下部分的共同参与，根中产生的前体也许随后被转运到叶中转化为另一种化合物，反之亦然，叶中产生的前体也许要到根中参与进一步的反应而变为最终产物。在这种情况下，酶的表达具有器官特异性，因此离体培养无论是毛状根还是冠瘿组织均不能合成所需产物。为了解决这一问题，最近有的学者充分利用毛状根和冠瘿组织具有激素自养性的特点，在同一培养基中共同培养毛状根与冠瘿组织，获得了较好的结果。例如，澳大利亚学者[26]研究发现颠茄A.belladonna的毛状根与Duboisia hybrid的冠瘿组织共培养时，莨菪胺的含量显著增加，而分别单独培养时均不产生莨菪胺，仅在毛状根培养中产生一定量的天仙子胺，由于莨菪胺的副作用小，市场价值大，所以研究毛状根与冠瘿组织的共培养条件，有可能用于莨菪胺的大规模生产。这一实验为某些重要次生物质的生产提供了一条新思路。
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4 转基因药用植物的获得
农杆菌转化药用植物，一般通过不定芽发生途径再生植株[27～29]，也有经过愈伤组织途径[30]再生的。利用农杆菌将外源基因导入药用植物是对现有药用植物实施品质改良的一个重要方面，也可以用于研究外源基因在药用植物中的表达调控。
据刘伟华等[27]报道发根农杆菌15834感染条叶龙胆Gentiana manshurica,诱导产生了毛状根，并进一步分化得到再生的龙胆植株，再生的龙胆丛生苗可以在不含激素的简化培养基上快速繁殖，转化的植株具有发达的根系，根部龙胆苦甙的含量比对照高，为东北龙胆的育种提供了一条新途径。我们[28]研究发现农杆菌转化后的丹参植株在形态、根产量、丹参酮含量上和对照丹参有很大差别，发根农杆菌15834，LBA9402转化后的再生植株具有典型的毛状根再生植物的特征，如叶片皱缩，节间缩短，植株矮化，须根发达等，而根癌农杆菌C58转化后的植物株形高大，根系发达粗壮，产量高，丹参酮含量高于对照，我们认为合理推广此项生物技术有利于良种繁育，提高药材质量。为了增强颠茄对除草剂的抗性，Saito[29]等构建了一个嵌合载体pARK5，含有CaMV35S启动子控制的bar基因，具有pARK5和pRi15834两个载体的发根农杆菌感染颠茄叶盘，获得了毛状根并分化出小植株，转基因植株及其后代显示了对除草剂phosphinothricin和bialaphos的抗性，且在转化的再生植株中含有正常的托品(tropane)生物碱。这一结果表明可以将农业上某些有用的基因(如抗虫、抗病毒、抗寒、抗除草剂等的基因)通过Ri质粒二元载体系统成功地应用到药用植物上。
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王慧中等[30]报道宁夏枸杞Lycium barbarum的幼茎能被含非致瘤性Ti质粒载体的根癌农杆菌感染，获得的抗性愈伤组织在选择分化培养基上分化出芽点，并长出完整小植株，对再生植株的NPT-Ⅱ酶活性检测及DNA分子杂交表明，外源基因已整合到枸杞细胞的核基因组上，并能在植株水平表达出相应性状，该研究为外源基因的导入建立了一个快速简便的枸杞转化再生系统。
目前已经获得的转基因药用植物的种类还不多见，但在理论研究和实际应用上已显示出巨大潜力。
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收稿日期：1999-04-27, http://www.100md.com