大黄素与雷公藤内酯醇联合治疗大鼠抗肾小球基底膜肾炎的实验研究
作者：戴春笋 刘志红 陈惠萍 周虹 王建平 黎磊石
单位：戴春笋(南京大学医学院博士研究生)；刘志红(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；陈惠萍(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；周虹(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；王建平(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；黎磊石(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)
关键词：大黄素；雷公藤内酯醇；抗肾小球基底膜肾炎
肾脏病与透折肾移植杂志000204 摘 要 目的：观察联合应用大黄素及雷公藤内酯醇治疗大鼠抗肾小球基底膜(GBM)肾炎的疗效 方法：建立大鼠自相期抗GBM肾炎模型。实验分五组：大黄素组(200 mg/kg"d-1)，雷公藤内酯醇(200 μg/kg.d-1)加大黄素组(200 mg/kg.d-1)，雷公藤内酯醇组(200 μg/kg.d-1)，肾炎未治疗组及正常对照组。大鼠注射肾毒血清后6h内开始灌胃给药，对照组仅给等量的水。定期观察一般情况，并测定尿蛋白水平，4周后宰杀大鼠，观察肾组织病理改变。 结果：(1)大鼠肾炎模型：大鼠注射抗血清后24h内即出现大量的尿蛋白，其后持续维持在较高水平。4周后肾炎组大鼠肾组织病理改变表现为肾小球中细胞浸润增多，新月体数明显增加，间质中可见较多的蛋白管型，无明显小管萎缩及间质纤维化。免疫荧光检查见兔抗鼠IgG沿肾小球基底膜线性分布。观察期间大鼠血肌酐水平有轻度升高。(2)药物疗效：药物治疗后大鼠尿蛋白水平，肾小球细胞总数及新月体数较肾炎对照明显减少。两药联用组尿蛋白水平及新月体数降低最为明显。各治疗组间体重及血肌酐水平无明显差别。 结论：大黄素和雷公藤内酯醇能够改善抗GBM肾炎大鼠的肾脏病变，两药联用后疗效明显增强。
, http://www.100md.com
COMBINED TRETMENT OF TRIPTOLIDE AND EMODIN INHIBITS THE PROGRESSION OF ANTI-GBM NEPHRITIS IN RATS
DAI Chunsun，LIU Zhihong，CHEN Huiping，ZHOU Hong，WANG Jianping，LI Leishi
(Research Institute of Nephrology，Jingling Hospital，Nanjing University Clinical School of Medicine，Nanjing，210002)
OBJECTIVE To investigate the therapeutic effects of combined treatment of triptolide and emodin in preventing the progression of anti-GBM nephritis in rats. METHODOLOGY Autologous anti-GBM nephritis model was elaborated with rabbit anti-rat GBM antibody(Ab) injection in Wistar rat in this study.The rats were divided into five groups：Triptolide treated group(200 μg/kg.d-1，po)，Emodin treated group(200 mg/kg.d-1，po)，Combined treatment group，Untreated nephritic group and Normal control.Triptolide and/or emodin were administered daily six hours after injection of anti-GBM IgG.All the rats were sacrificed and kidney specimen were collected at the fourth week.Urinary protein excretion rate was examined weekly. RESULTS (1)Rats injected with rabbit anti-rat GBM Ab excreted heavy proteinuria(202.4±77.3 vs 2.0±0.8 mg/24h，P<0.01) in the first 24 hours，that mantained at this high level during the observation period.At the end of the observation，glomerular hypercellulity，crescents，protein casts and mild increase of serum creatinine were observed in nephritic rats.Immunofluoresence staining revealed that rabbit IgG deposited in a “linear”pattern at glomerular GBM one day after injection.(2)In three treatment groups，urinary protein excretion，glomerular hypercellularity and crescents decreased significantly at the end of the experiment.Among the three treatment groups，the reduction of urinary protein excretion and glomerular crescent formation was most prominent in the combined treatment group.No difference was found in body weight change and serum creatinine concentration among the three treatment groups. CONCLUSION Emodin and triptolide inhibited the progression of rat anti-GBM nephritis alone，combined usage of these two agents was more efficient.
, 百拇医药
Key words emodin triptolide anti-GBM nephritis
肾小球肾炎是临床上最常见的一类肾脏疾病，是导致患者进入终末期肾衰的重要原因[1]。其发病机制较为复杂，早先人们认为，免疫因素(包括体液免疫及细胞免疫)的介入，机体通过补体途径的激活，血凝机制的起动，促炎介质、细胞因子的合成，蛋白酶以及促炎脂质的释放等造成了肾小球肾炎的发生与发展[2]。现在发现，除了免疫性因素外，肾固有细胞(如肾小球系膜细胞等)的活化及大量细胞因子与促炎介质的产生，可以进一步加重肾组织的损伤[3，4]。
雷公藤内酯醇是雷公藤二萜化合物中免疫抑制作用最强的单体，体外可以抑制有丝分裂原刺激的淋巴细胞增生反应，诱导活化的淋巴细胞发生凋亡[5]，并通过抑制淋巴细胞NF-κB的活力而减少多种促炎因子(如IL-1，TNF-α等)及细胞因子的产生[6]。在肾移植大鼠模型中应用雷公藤内酯醇可以抑制移植肾急性排斥反应的发生，减少肾间质淋巴细胞的浸润[7]。大黄素是从大黄蒽醌衍生物分离出的一种单体，体外有很强的抑制肾固有细胞(如系膜细胞)增生的能力，也可以减少系膜细胞细胞外基质的表达与产生[8]。由于大黄素与雷公藤内酯醇在治疗肾小球肾炎中的不同药理作用方式，因此设想如果应用这两种药物同时阻断导致肾小球肾炎发生与发展的两个主要环节，应有助于提高肾小球肾炎的治疗水平。
, 百拇医药
本研究建立大鼠抗肾小球基底膜(GBM)肾炎模型，联合应用雷公藤内酯醇与大黄素对肾炎模型进行治疗，并设单用雷公藤内酯醇及大黄素治疗组，结合大鼠24h尿蛋白排泄量，以及肾组织病理的变化，观察两药联用在治疗该肾炎模型中的疗效。
1 材料与方法
1.1 药品 大黄素经正品掌叶大黄(甘肃省西宁市药材公司)提取。由本院中心仪器科提供，经HPLC检测纯度均在90%以上。雷公藤内酯醇由中国医学科学院皮肤病研究所提供，检验纯度在99%以上。大黄素用前以10%乙醇溶解，并用生理盐水稀释至所需浓度，雷公藤内酯醇用前由吐温80溶解，并用生理盐水稀释。
1.2 动物 实验动物采用清洁级Wistar大鼠，购自上海动物实验中心。实验期间，动物室温度25～28℃，湿度70%，12h交替照明，大鼠自由饮水、进食，保持垫料干糙。饲料中蛋白含量为20%。
, 百拇医药 1.3 大鼠抗GBM肾炎模型制备 参照Shreiner方法建立大鼠抗GBM肾炎模型[9]，具体方法包括以下步骤：
1.3.1 大鼠GBM抗原制备 取成年Wistar大鼠80只，雌雄不限。麻醉后暴露腹腔，经腹主动脉插管，用冷PBS液对双肾进行充分灌洗后取肾脏，将皮质剪碎后分别过50，100及200目网筛，最后留在200目网筛上的即为肾小球。收集肾小球，用超声粉碎机将肾小球充分粉碎后以14 000 r/min，离心10min，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，测蛋白质含量为3 g/L，-20℃冰箱保存备用。
1.3.2 兔抗鼠GBM抗血清制备及IgG的提纯 健康成年新西兰兔，雄性，体重1.5～2kg，取1ml GBM溶液与等量弗氏佐剂充分混匀后于兔背部皮下多点注射，每两周一次，首次用弗氏完全佐剂，第二次用弗氏不完全佐剂，以后单用抗原，并且每次注射抗原前测血清抗GBM抗体的滴度，滴度合适后一周，经颈动脉放血。分离血清，用等量的新鲜大鼠红细胞吸附，4℃过夜，采用饱和硫酸铵沉淀法分离提纯IgG。测IgG浓度为25 g/L。总量为120ml。同时取正常新西兰兔，制备正常兔IgG，浓度为23 g/L，-20℃冰箱保存。
, 百拇医药
1.3.3 大鼠抗GBM肾炎模型的制备 取Wistar雄性大鼠，体重130～150g，将正常兔IgG与弗式不完全佐剂充分混匀，制成油包水，以1 mg/100g注入大鼠腹腔，第5天时经尾静脉注入适量肾毒血清(12.5 mg/100g)。
1.4 实验分组及给药 注射肾毒血清后6h内开始灌胃给药，对照组给予等量的水。根据用药种类分为五组：A组(大黄素200 mg/kg。d-1，n＝6)；B组(雷公藤内酯醇200 μg/kg。d-1加大黄素200 mg/kg。d-1，n＝6)；C组(雷公藤内酯醇200 μg/kg。d-1，n＝6)；D组(肾炎对照，n＝8)；E组(正常对照，n＝6)。
, 百拇医药
1.5 标本采集及检测
1.5.1 普通标本 实验开始后每周用金属代谢笼(上海动物实验仪器厂)收集24h尿液；每周用玻璃毛细管经大鼠内眦静脉采集血标本；24h尿蛋白定量采用考马斯亮兰G-250法检测；血肌酐及尿肌酐采用碱性苦味酸法检测。
1.5.2 肾组织病理标本 实验4周时宰杀大鼠取左肾，经肾门冠状面取组织厚约2mm，10%中性福尔马林固定，行石蜡包埋，组织切片行HE，PAS及PAM染色。光镜下观察肾小球及小管间质病变情况。同时取右肾，去除肾包膜及肾门区结缔组织后，用电子天平称取右肾重量。
1.5.3 脾脏重量测定 实验4周宰杀大鼠后，取脾脏，去除脾脏表面包膜及脾门周围结缔组织，用电子天平称取脾脏重量。
1.5.4 免疫组化染色 取肾组织方法同上，将组织块置于生理盐水浸湿的干净纱布中，于-20℃冰箱保存待检。免疫组化染色采用改良PAP四层法，具体方法如下：取冰冻切片，充分吹干，冷丙酮固定10min。去除多余液体，加稀释的单克降抗体室温1.5h，用pH7.4，0.01 mol/L的PBS缓冲液冲洗，再用0.15 mol/L的PBS洗三次，加HRP-RAM 1/100的抗体，室温40 min，洗片同前，加DAB-H2O2显色液显色约7～10 min，镜下控制，然后用流水洗去显色液，苏木素复染细胞核，水洗，吹干，树胶封片。
, http://www.100md.com
1.6 统计学处理 计量资料以均数±标准差表示；多组间比较采用方差分析，F检验；两组间比较采用t检验；P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2 结 果
2.1 大鼠抗GBM肾炎模型的建立 大鼠注射抗血清24h时即出现大量的蛋白尿，一周时每天尿蛋白排泄量即明显高于正常对照(202.4±77.3 vs 2.0±0.8 mg/24h，P<0.01)。其后4周内尿蛋白排泄量维持在较高水平。实验4周时大鼠血清肌酐水平较正常对照轻度升高(5711±168 vs 5304±79.6 μmol/L，P<0.05)。4周时，肾炎对照大鼠肾脏重量及脾脏重量较正常对照均明显增加。肾组织病理检查可见肾小球体积较正常对照增大，肾小球毛细血管内皮细胞明显增多，可见单个核细胞浸润。脏层上皮细胞肿胀明显，系膜区节段性增宽，系膜基质增多，可见少量节段细胞性或纤维素性新月体，小球中未见明显血栓袢坏死及囊壁断裂。小管中可见较多的蛋白管型，间质无明显炎细胞浸润及纤维化，无小管萎缩(图1)。免疫荧光检查示注射抗血清后一天时肾小球GBM上均可见线型兔抗鼠免疫球蛋白沉积(图2)。
, http://www.100md.com
2.2 药物疗效观察
2.2.1 大鼠一般情况 药物治疗期间各组大鼠饮食及饮水正常，大黄素治疗2天时有3只大鼠有轻度腹泻，未作特殊处理，2～4天缓解。实验期间无一例大鼠死亡。4周后各组大鼠体重均较实验前明显增加，但肾炎大鼠体重增加程度明显低于正常对照，治疗组与肾炎未治疗组间体重无明显差别(图3)。
2.2.2 大鼠尿蛋白及肾功能的变化 药物治疗4周时，大鼠尿蛋白排泄量较肾炎对照组明显降低，其中单用雷公藤内酯醇治疗组尿蛋白排出量低于单用大黄素治疗组，而两药联用后大鼠尿蛋白水平降低最为明显(图4)。4周时肾炎组大鼠血清肌酐水平较正常对照组有轻度增加，三组治疗组大鼠血清肌酐水平低于肾炎对照，但无统计学意义(图5)。
Fig.1. Pathological change at the fourth week after
, 百拇医药
induction of anti-GBM nephritis
Normal control rats(A)，Nephritic control rats(B)，Emodin-treated rats(C)，Triptolide-treated rats(D)
and rats of combined treatment(E)
Fig.2. Rabbit anti-rat GBM IgG was deposited in a “linear”pattern in glomeruli
one day after induction of
nephritis (Immunofluoresence，×200)
, http://www.100md.com
Fig.3. Body weight change druing the four weeks of experiment
Fig.4. Alteration of urinary protein excretion during the
four weeks after induction of anti-GBM nephritis in the five groups
Fig.5. Serum creatinine levels at fourth week after induction
of anti-GBM nephritis in the nephritic rats and control rats
, 百拇医药
2.2.3 肾组织病理改变 附表示4周时，雷公藤内酯醇或大黄素治疗组或两药联用组大鼠肾重较未治疗组降低，但无明显的统计学意义。药物治疗组大鼠肾小球细胞数较肾炎未治疗组明显减少，但仍明显高于正常对照，三组治疗组间无统计学差异。单用雷公藤内酯醇治疗组大鼠4周时肾小球上皮细胞肿胀明显减轻，新月体数较肾炎对照组明显减少，部分肾小球仍可见轻度节段的系膜增生。小管间质有少量蛋白管型，无小管萎缩及间质纤维化。单用大黄素治疗组大鼠4周时肾小球系膜基质增生不明显，上皮细胞仍可见肿胀及轻度增生，个别肾小球丝球体与球囊壁有粘连，小管间质可见少量蛋白管型，新月体较单用雷公藤内酯醇治疗组多，但仍明显低于肾炎未治疗组。两药联用组大鼠肾小球毛细血管内皮细胞增生仍较明显，系膜细胞增生及系膜区基质沉积改善明显，上皮细胞接近于正常对照组，肾小球新月体数降低最为明显(图1)。
Table 1. Histopathological changes of the four nephritic
, 百拇医药 groups and normal control Group
Kidney Weight
(g)
Crescent
(%)
Glomerular Cell
Number
Emodin
(n＝6)
1.1318±0.1125
6.58±2.36△
, 百拇医药
80±4△
Triptolide
(n＝6)
1.0455±0.1279
3.54±2.03△
81±9
Emodin+Triptolide
(n＝6)
0.9946±0.1438
1.06±1.16△＃
75±5△
, 百拇医药
Nephritic Control
(n＝6)
1.1486±0.1536
12.0±3.83
94±9
Normal Control
(n＝8)
0.8214±0.0831
0
55±2
P<0.01 vs Normal Control；△P<0.01 vs Nephritic Control；＃P<0.01 vs Emodin.3 讨 论
, 百拇医药
肾毒血清性肾炎模型是研究增生性肾小球肾炎常用的动物模型之一。该模型具有肾脏病变较重，重复性好，制作容易等特点[10]。本研究参照Shreiner及Cattell的方法，采用正常兔IgG预免疫，使大鼠体内产生适量的抗兔抗体，5天后再给予亚致肾炎剂量的抗血清，这样注射抗血清后很快肾小球就可出现自相期的一系列病理表现，并伴大量的尿蛋白排泄。本研究建立的肾炎模型大鼠在注射抗血清后24h内即出现大量的蛋白尿，其后一个月内维持在较高水平。肾组织病理改变较轻，肾小球中未见明显的血栓形成及袢坏死，但仍可见肾小球细胞数明显增多，有节段系膜增生，上皮细胞肿胀明显，并可见少量细胞性及纤维性新月体。免疫病理证实注射肾毒血清后大鼠肾小球基底膜上有线性兔IgG沉积，与文献报道相符，所建立的动物模型可以用于药物治疗肾小球肾炎疗效的观察及比较。
雷公藤目前已广泛用于各类免疫相关性疾病的治疗，如肾小球肾炎，系统性红斑狼疮，及类风湿性关节炎等[10～13]。雷公藤成份复杂，雷公藤内酯醇是雷公藤二萜化合物中免疫抑制作用最强的一种单体。本研究结果表明，雷公藤内酯醇可以明显改善抗GBM肾炎大鼠的肾脏病变，表现为尿蛋白排泄量降低，肾小球脏层上皮细胞病变明显改善，肾小球新月体明显减少。大黄蒽醌衍生物是大黄用于治疗慢性肾衰的主要有效成份。大黄蒽醌衍生物组成较复杂，现在研究多集中在大黄酸以及大黄素上。体外实验发现，大黄素对肾固有细胞增生的抑制程度高于大黄酸[14]。本研究中选用大黄素来观察其在治疗肾炎中的作用。结果表明，实验剂量的大黄素可以改善肾毒血清性肾炎大鼠的肾脏病变，但疗效弱于实验剂量的雷公藤内酯醇组。研究中联合应用雷公藤内酯醇与大黄素后，大鼠尿蛋白水平及肾小球新月体数明显低于肾炎对照，也低于单用大黄素或雷公藤内酯醇治疗组，肾小球上皮细胞接近正常对照，但肾小球细胞数与其他两组治疗组无明显差别。
, 百拇医药
对于增生性肾小球肾炎的发病机制目前已经有了一些新的认识。肾小球肾炎的发生与发展除了有细胞免疫与体液免疫的介入外，肾固有细胞的活化与增生在肾小球肾炎的维持与转归中起了非常重要的作用。在大鼠Thy1.1肾炎模型中，抑制系膜细胞增生可以减轻肾组织的损伤[16]。本研究重点观察药物在治疗肾炎中的疗效，对药物产生疗效的机制未作深入研究，但根据以往大量的体外及体内实验结果，我们已经初步认识了两药在治疗肾小球肾炎中可能的作用机制。体外实验已经证实，雷公藤内酯醇对T细胞及B细胞均有影响，可以明显抑制有丝分裂原刺激淋巴细胞的增生，对活化的淋巴细胞可以诱导凋亡，并通过抑制淋巴细胞NF-κB的活力而减少一些炎性因子及细胞因子的产生。大黄素治疗肾小球肾炎的主要机制在于其对肾固有细胞的影响。体外实验发现，大黄素可以抑制肾固有细胞(如系膜细胞)的增生，减少系膜细胞细胞外基质的产生。已往研究中也证实，大黄素也可以抑制T细胞及B细胞的增生及IL-2的产生[17]，并对鼠单核细胞IL-1及TNF-α的产生也有抑制作用[18，19]。本研究对大鼠脾脏重量的测定结果发现(结果未列出)，大鼠肾炎模型建立4周时，雷公藤内酯醇治疗组及双药联用组脾脏重量较肾炎未治疗组降低较明显，单用大黄素治疗组大鼠的脾脏重量较肾炎对照组也有减轻，但由于未对大鼠其它的免疫学指标进行深入观察，因此除了对肾固有细胞的影响外，大黄素对机体免疫系统是否有影响尚待进一步研究。
, 百拇医药
目前，在我国，肾小球肾炎仍然是影响人们身体健康的重要原因，每年因肾小球肾炎而进入终末期肾衰的患者居各病因之首[20]。对于肾小球肾炎的治疗以往较强调应用对免疫系统有干预作用的药物，而忽视针对肾固有细胞展开治疗。本研究证实大黄素与具有免疫抑制作用的雷公藤联用后可加强肾小球肾炎的治疗效果。因此联合应用雷公藤内酯醇与大黄素治疗肾小球肾炎应具有广阔的应用前景。
参考文献
1，Hrick DE，Chung-Park M，Sedor JR.Glomerulonephritis.N Eng J Med，1998，339(13)：888
2，Wardle EN.Glomerulopathies：Cell biology and immunology.Amsterdam：Harwood Academic Publishers GmbH，1996.51
, 百拇医药
3，Johnson RJ.The glomerular response of injury：progression or resolution？Kidney Int，1994，45：1769
4，Sedor JR，Konieczkowski M，Huang S et al.Cytokines，mesangial cell activation and glomerular injury.Kidney Int，1993，39：S65
5，戴春笋，杨俊伟，陈朝红等.雷公藤内酯醇诱导淋巴细胞发生细胞凋亡的作用与细胞活化程度的关系.中华微生物与免疫学杂志，1999，19：391
6，刘 浩，刘志红，章 精等.雷公藤内酯醇降低T淋巴细胞核因子-κB的活性.肾脏病与透析肾移植杂志，1998，7：312
7，杨俊伟，戴春笋，樊忠民等.雷公藤内酯醇延长大鼠同种异体移植肾存活时间的作用.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6(3)：214
, 百拇医药
8，Li Leishi.End stage renal disease in china.Kidney Int，1996，49：287
9，Schreiner GF.A monocyte cell component in experimental immunological glomerulonephritis.J Exp Med，1978，147：369
10，Sabato GD.Chemotaxis and inflammation.California：A cadamic Press INC.1988.P440
11，黎磊石，杨俊伟.雷公藤药理与临床研究.中国药理学年鉴，1993.p40
12，黎磊石，张 训，陈光永等.雷公藤治疗肾小球肾炎的临床研究.中华内科杂志，1982，20(4)：216
, http://www.100md.com
13，黎磊石，张 训，陈惠萍等.雷公藤治疗肾小球肾炎的临床及实验研究.中华医学杂志，1982，62(10)：581
14，戎 殳，胡伟新，刘志红等.系膜增殖性肾小球肾炎和新疗法：雷公藤多甙新治疗方案的疗效观察.肾脏病与透析肾移植杂志，1998，7(5)：409
15，Berline EC.A reappraisal of immune-mediated glomerulosclerosis.Kidney Int，1996，49：605
16，Tipping PG，Richard-Kitchng A，Cunningham MA et al. Immunopathogenesis of crescentic glomerulonephritis.Current Opinion in Nephrology and Hypertension，1999，8：281
, 百拇医药
17，Pippin JW，Qu Qy，Meijer L et al. Direct in vivo inhibition of the nuclear cell cycle cascade in experimental mesangial proliferative glomerulonephritis with roscovitine，a novel cyclin-dependent kinase antagonist.J Clin Invest，1997，100：2512
18，姚 健，黎磊石，赵 荣.大黄素对IL-1产生的抑制作用.中国实验临床免疫学杂志，1991，3(4)：42
19，胡伟新，姚 健，黎磊石.大黄影响MψIL-1及TNF产生的体外观察.金陵医院学报，1991，4(4)：404
20，黎磊石，关天俊，刘志红等.4298例成人肾小球疾病理类型及流行病学特点.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6(2)：103
(2000-02-16收稿), 百拇医药
单位：戴春笋(南京大学医学院博士研究生)；刘志红(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；陈惠萍(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；周虹(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；王建平(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)；黎磊石(南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所 南京，210002)
关键词：大黄素；雷公藤内酯醇；抗肾小球基底膜肾炎
肾脏病与透折肾移植杂志000204 摘 要 目的：观察联合应用大黄素及雷公藤内酯醇治疗大鼠抗肾小球基底膜(GBM)肾炎的疗效 方法：建立大鼠自相期抗GBM肾炎模型。实验分五组：大黄素组(200 mg/kg"d-1)，雷公藤内酯醇(200 μg/kg.d-1)加大黄素组(200 mg/kg.d-1)，雷公藤内酯醇组(200 μg/kg.d-1)，肾炎未治疗组及正常对照组。大鼠注射肾毒血清后6h内开始灌胃给药，对照组仅给等量的水。定期观察一般情况，并测定尿蛋白水平，4周后宰杀大鼠，观察肾组织病理改变。 结果：(1)大鼠肾炎模型：大鼠注射抗血清后24h内即出现大量的尿蛋白，其后持续维持在较高水平。4周后肾炎组大鼠肾组织病理改变表现为肾小球中细胞浸润增多，新月体数明显增加，间质中可见较多的蛋白管型，无明显小管萎缩及间质纤维化。免疫荧光检查见兔抗鼠IgG沿肾小球基底膜线性分布。观察期间大鼠血肌酐水平有轻度升高。(2)药物疗效：药物治疗后大鼠尿蛋白水平，肾小球细胞总数及新月体数较肾炎对照明显减少。两药联用组尿蛋白水平及新月体数降低最为明显。各治疗组间体重及血肌酐水平无明显差别。 结论：大黄素和雷公藤内酯醇能够改善抗GBM肾炎大鼠的肾脏病变，两药联用后疗效明显增强。
, http://www.100md.com
COMBINED TRETMENT OF TRIPTOLIDE AND EMODIN INHIBITS THE PROGRESSION OF ANTI-GBM NEPHRITIS IN RATS
DAI Chunsun，LIU Zhihong，CHEN Huiping，ZHOU Hong，WANG Jianping，LI Leishi
(Research Institute of Nephrology，Jingling Hospital，Nanjing University Clinical School of Medicine，Nanjing，210002)
OBJECTIVE To investigate the therapeutic effects of combined treatment of triptolide and emodin in preventing the progression of anti-GBM nephritis in rats. METHODOLOGY Autologous anti-GBM nephritis model was elaborated with rabbit anti-rat GBM antibody(Ab) injection in Wistar rat in this study.The rats were divided into five groups：Triptolide treated group(200 μg/kg.d-1，po)，Emodin treated group(200 mg/kg.d-1，po)，Combined treatment group，Untreated nephritic group and Normal control.Triptolide and/or emodin were administered daily six hours after injection of anti-GBM IgG.All the rats were sacrificed and kidney specimen were collected at the fourth week.Urinary protein excretion rate was examined weekly. RESULTS (1)Rats injected with rabbit anti-rat GBM Ab excreted heavy proteinuria(202.4±77.3 vs 2.0±0.8 mg/24h，P<0.01) in the first 24 hours，that mantained at this high level during the observation period.At the end of the observation，glomerular hypercellulity，crescents，protein casts and mild increase of serum creatinine were observed in nephritic rats.Immunofluoresence staining revealed that rabbit IgG deposited in a “linear”pattern at glomerular GBM one day after injection.(2)In three treatment groups，urinary protein excretion，glomerular hypercellularity and crescents decreased significantly at the end of the experiment.Among the three treatment groups，the reduction of urinary protein excretion and glomerular crescent formation was most prominent in the combined treatment group.No difference was found in body weight change and serum creatinine concentration among the three treatment groups. CONCLUSION Emodin and triptolide inhibited the progression of rat anti-GBM nephritis alone，combined usage of these two agents was more efficient.
, 百拇医药
Key words emodin triptolide anti-GBM nephritis
肾小球肾炎是临床上最常见的一类肾脏疾病，是导致患者进入终末期肾衰的重要原因[1]。其发病机制较为复杂，早先人们认为，免疫因素(包括体液免疫及细胞免疫)的介入，机体通过补体途径的激活，血凝机制的起动，促炎介质、细胞因子的合成，蛋白酶以及促炎脂质的释放等造成了肾小球肾炎的发生与发展[2]。现在发现，除了免疫性因素外，肾固有细胞(如肾小球系膜细胞等)的活化及大量细胞因子与促炎介质的产生，可以进一步加重肾组织的损伤[3，4]。
雷公藤内酯醇是雷公藤二萜化合物中免疫抑制作用最强的单体，体外可以抑制有丝分裂原刺激的淋巴细胞增生反应，诱导活化的淋巴细胞发生凋亡[5]，并通过抑制淋巴细胞NF-κB的活力而减少多种促炎因子(如IL-1，TNF-α等)及细胞因子的产生[6]。在肾移植大鼠模型中应用雷公藤内酯醇可以抑制移植肾急性排斥反应的发生，减少肾间质淋巴细胞的浸润[7]。大黄素是从大黄蒽醌衍生物分离出的一种单体，体外有很强的抑制肾固有细胞(如系膜细胞)增生的能力，也可以减少系膜细胞细胞外基质的表达与产生[8]。由于大黄素与雷公藤内酯醇在治疗肾小球肾炎中的不同药理作用方式，因此设想如果应用这两种药物同时阻断导致肾小球肾炎发生与发展的两个主要环节，应有助于提高肾小球肾炎的治疗水平。
, 百拇医药
本研究建立大鼠抗肾小球基底膜(GBM)肾炎模型，联合应用雷公藤内酯醇与大黄素对肾炎模型进行治疗，并设单用雷公藤内酯醇及大黄素治疗组，结合大鼠24h尿蛋白排泄量，以及肾组织病理的变化，观察两药联用在治疗该肾炎模型中的疗效。
1 材料与方法
1.1 药品 大黄素经正品掌叶大黄(甘肃省西宁市药材公司)提取。由本院中心仪器科提供，经HPLC检测纯度均在90%以上。雷公藤内酯醇由中国医学科学院皮肤病研究所提供，检验纯度在99%以上。大黄素用前以10%乙醇溶解，并用生理盐水稀释至所需浓度，雷公藤内酯醇用前由吐温80溶解，并用生理盐水稀释。
1.2 动物 实验动物采用清洁级Wistar大鼠，购自上海动物实验中心。实验期间，动物室温度25～28℃，湿度70%，12h交替照明，大鼠自由饮水、进食，保持垫料干糙。饲料中蛋白含量为20%。
, 百拇医药 1.3 大鼠抗GBM肾炎模型制备 参照Shreiner方法建立大鼠抗GBM肾炎模型[9]，具体方法包括以下步骤：
1.3.1 大鼠GBM抗原制备 取成年Wistar大鼠80只，雌雄不限。麻醉后暴露腹腔，经腹主动脉插管，用冷PBS液对双肾进行充分灌洗后取肾脏，将皮质剪碎后分别过50，100及200目网筛，最后留在200目网筛上的即为肾小球。收集肾小球，用超声粉碎机将肾小球充分粉碎后以14 000 r/min，离心10min，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，测蛋白质含量为3 g/L，-20℃冰箱保存备用。
1.3.2 兔抗鼠GBM抗血清制备及IgG的提纯 健康成年新西兰兔，雄性，体重1.5～2kg，取1ml GBM溶液与等量弗氏佐剂充分混匀后于兔背部皮下多点注射，每两周一次，首次用弗氏完全佐剂，第二次用弗氏不完全佐剂，以后单用抗原，并且每次注射抗原前测血清抗GBM抗体的滴度，滴度合适后一周，经颈动脉放血。分离血清，用等量的新鲜大鼠红细胞吸附，4℃过夜，采用饱和硫酸铵沉淀法分离提纯IgG。测IgG浓度为25 g/L。总量为120ml。同时取正常新西兰兔，制备正常兔IgG，浓度为23 g/L，-20℃冰箱保存。
, 百拇医药
1.3.3 大鼠抗GBM肾炎模型的制备 取Wistar雄性大鼠，体重130～150g，将正常兔IgG与弗式不完全佐剂充分混匀，制成油包水，以1 mg/100g注入大鼠腹腔，第5天时经尾静脉注入适量肾毒血清(12.5 mg/100g)。
1.4 实验分组及给药 注射肾毒血清后6h内开始灌胃给药，对照组给予等量的水。根据用药种类分为五组：A组(大黄素200 mg/kg。d-1，n＝6)；B组(雷公藤内酯醇200 μg/kg。d-1加大黄素200 mg/kg。d-1，n＝6)；C组(雷公藤内酯醇200 μg/kg。d-1，n＝6)；D组(肾炎对照，n＝8)；E组(正常对照，n＝6)。
, 百拇医药
1.5 标本采集及检测
1.5.1 普通标本 实验开始后每周用金属代谢笼(上海动物实验仪器厂)收集24h尿液；每周用玻璃毛细管经大鼠内眦静脉采集血标本；24h尿蛋白定量采用考马斯亮兰G-250法检测；血肌酐及尿肌酐采用碱性苦味酸法检测。
1.5.2 肾组织病理标本 实验4周时宰杀大鼠取左肾，经肾门冠状面取组织厚约2mm，10%中性福尔马林固定，行石蜡包埋，组织切片行HE，PAS及PAM染色。光镜下观察肾小球及小管间质病变情况。同时取右肾，去除肾包膜及肾门区结缔组织后，用电子天平称取右肾重量。
1.5.3 脾脏重量测定 实验4周宰杀大鼠后，取脾脏，去除脾脏表面包膜及脾门周围结缔组织，用电子天平称取脾脏重量。
1.5.4 免疫组化染色 取肾组织方法同上，将组织块置于生理盐水浸湿的干净纱布中，于-20℃冰箱保存待检。免疫组化染色采用改良PAP四层法，具体方法如下：取冰冻切片，充分吹干，冷丙酮固定10min。去除多余液体，加稀释的单克降抗体室温1.5h，用pH7.4，0.01 mol/L的PBS缓冲液冲洗，再用0.15 mol/L的PBS洗三次，加HRP-RAM 1/100的抗体，室温40 min，洗片同前，加DAB-H2O2显色液显色约7～10 min，镜下控制，然后用流水洗去显色液，苏木素复染细胞核，水洗，吹干，树胶封片。
, http://www.100md.com
1.6 统计学处理 计量资料以均数±标准差表示；多组间比较采用方差分析，F检验；两组间比较采用t检验；P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2 结 果
2.1 大鼠抗GBM肾炎模型的建立 大鼠注射抗血清24h时即出现大量的蛋白尿，一周时每天尿蛋白排泄量即明显高于正常对照(202.4±77.3 vs 2.0±0.8 mg/24h，P<0.01)。其后4周内尿蛋白排泄量维持在较高水平。实验4周时大鼠血清肌酐水平较正常对照轻度升高(5711±168 vs 5304±79.6 μmol/L，P<0.05)。4周时，肾炎对照大鼠肾脏重量及脾脏重量较正常对照均明显增加。肾组织病理检查可见肾小球体积较正常对照增大，肾小球毛细血管内皮细胞明显增多，可见单个核细胞浸润。脏层上皮细胞肿胀明显，系膜区节段性增宽，系膜基质增多，可见少量节段细胞性或纤维素性新月体，小球中未见明显血栓袢坏死及囊壁断裂。小管中可见较多的蛋白管型，间质无明显炎细胞浸润及纤维化，无小管萎缩(图1)。免疫荧光检查示注射抗血清后一天时肾小球GBM上均可见线型兔抗鼠免疫球蛋白沉积(图2)。
, http://www.100md.com
2.2 药物疗效观察
2.2.1 大鼠一般情况 药物治疗期间各组大鼠饮食及饮水正常，大黄素治疗2天时有3只大鼠有轻度腹泻，未作特殊处理，2～4天缓解。实验期间无一例大鼠死亡。4周后各组大鼠体重均较实验前明显增加，但肾炎大鼠体重增加程度明显低于正常对照，治疗组与肾炎未治疗组间体重无明显差别(图3)。
2.2.2 大鼠尿蛋白及肾功能的变化 药物治疗4周时，大鼠尿蛋白排泄量较肾炎对照组明显降低，其中单用雷公藤内酯醇治疗组尿蛋白排出量低于单用大黄素治疗组，而两药联用后大鼠尿蛋白水平降低最为明显(图4)。4周时肾炎组大鼠血清肌酐水平较正常对照组有轻度增加，三组治疗组大鼠血清肌酐水平低于肾炎对照，但无统计学意义(图5)。
Fig.1. Pathological change at the fourth week after
, 百拇医药
induction of anti-GBM nephritis
Normal control rats(A)，Nephritic control rats(B)，Emodin-treated rats(C)，Triptolide-treated rats(D)
and rats of combined treatment(E)
Fig.2. Rabbit anti-rat GBM IgG was deposited in a “linear”pattern in glomeruli
one day after induction of
nephritis (Immunofluoresence，×200)
, http://www.100md.com
Fig.3. Body weight change druing the four weeks of experiment
Fig.4. Alteration of urinary protein excretion during the
four weeks after induction of anti-GBM nephritis in the five groups
Fig.5. Serum creatinine levels at fourth week after induction
of anti-GBM nephritis in the nephritic rats and control rats
, 百拇医药
2.2.3 肾组织病理改变 附表示4周时，雷公藤内酯醇或大黄素治疗组或两药联用组大鼠肾重较未治疗组降低，但无明显的统计学意义。药物治疗组大鼠肾小球细胞数较肾炎未治疗组明显减少，但仍明显高于正常对照，三组治疗组间无统计学差异。单用雷公藤内酯醇治疗组大鼠4周时肾小球上皮细胞肿胀明显减轻，新月体数较肾炎对照组明显减少，部分肾小球仍可见轻度节段的系膜增生。小管间质有少量蛋白管型，无小管萎缩及间质纤维化。单用大黄素治疗组大鼠4周时肾小球系膜基质增生不明显，上皮细胞仍可见肿胀及轻度增生，个别肾小球丝球体与球囊壁有粘连，小管间质可见少量蛋白管型，新月体较单用雷公藤内酯醇治疗组多，但仍明显低于肾炎未治疗组。两药联用组大鼠肾小球毛细血管内皮细胞增生仍较明显，系膜细胞增生及系膜区基质沉积改善明显，上皮细胞接近于正常对照组，肾小球新月体数降低最为明显(图1)。
Table 1. Histopathological changes of the four nephritic
, 百拇医药 groups and normal control Group
Kidney Weight
(g)
Crescent
(%)
Glomerular Cell
Number
Emodin
(n＝6)
1.1318±0.1125
6.58±2.36△
, 百拇医药
80±4△
Triptolide
(n＝6)
1.0455±0.1279
3.54±2.03△
81±9
Emodin+Triptolide
(n＝6)
0.9946±0.1438
1.06±1.16△＃
75±5△
, 百拇医药
Nephritic Control
(n＝6)
1.1486±0.1536
12.0±3.83
94±9
Normal Control
(n＝8)
0.8214±0.0831
0
55±2
P<0.01 vs Normal Control；△P<0.01 vs Nephritic Control；＃P<0.01 vs Emodin.3 讨 论
, 百拇医药
肾毒血清性肾炎模型是研究增生性肾小球肾炎常用的动物模型之一。该模型具有肾脏病变较重，重复性好，制作容易等特点[10]。本研究参照Shreiner及Cattell的方法，采用正常兔IgG预免疫，使大鼠体内产生适量的抗兔抗体，5天后再给予亚致肾炎剂量的抗血清，这样注射抗血清后很快肾小球就可出现自相期的一系列病理表现，并伴大量的尿蛋白排泄。本研究建立的肾炎模型大鼠在注射抗血清后24h内即出现大量的蛋白尿，其后一个月内维持在较高水平。肾组织病理改变较轻，肾小球中未见明显的血栓形成及袢坏死，但仍可见肾小球细胞数明显增多，有节段系膜增生，上皮细胞肿胀明显，并可见少量细胞性及纤维性新月体。免疫病理证实注射肾毒血清后大鼠肾小球基底膜上有线性兔IgG沉积，与文献报道相符，所建立的动物模型可以用于药物治疗肾小球肾炎疗效的观察及比较。
雷公藤目前已广泛用于各类免疫相关性疾病的治疗，如肾小球肾炎，系统性红斑狼疮，及类风湿性关节炎等[10～13]。雷公藤成份复杂，雷公藤内酯醇是雷公藤二萜化合物中免疫抑制作用最强的一种单体。本研究结果表明，雷公藤内酯醇可以明显改善抗GBM肾炎大鼠的肾脏病变，表现为尿蛋白排泄量降低，肾小球脏层上皮细胞病变明显改善，肾小球新月体明显减少。大黄蒽醌衍生物是大黄用于治疗慢性肾衰的主要有效成份。大黄蒽醌衍生物组成较复杂，现在研究多集中在大黄酸以及大黄素上。体外实验发现，大黄素对肾固有细胞增生的抑制程度高于大黄酸[14]。本研究中选用大黄素来观察其在治疗肾炎中的作用。结果表明，实验剂量的大黄素可以改善肾毒血清性肾炎大鼠的肾脏病变，但疗效弱于实验剂量的雷公藤内酯醇组。研究中联合应用雷公藤内酯醇与大黄素后，大鼠尿蛋白水平及肾小球新月体数明显低于肾炎对照，也低于单用大黄素或雷公藤内酯醇治疗组，肾小球上皮细胞接近正常对照，但肾小球细胞数与其他两组治疗组无明显差别。
, 百拇医药
对于增生性肾小球肾炎的发病机制目前已经有了一些新的认识。肾小球肾炎的发生与发展除了有细胞免疫与体液免疫的介入外，肾固有细胞的活化与增生在肾小球肾炎的维持与转归中起了非常重要的作用。在大鼠Thy1.1肾炎模型中，抑制系膜细胞增生可以减轻肾组织的损伤[16]。本研究重点观察药物在治疗肾炎中的疗效，对药物产生疗效的机制未作深入研究，但根据以往大量的体外及体内实验结果，我们已经初步认识了两药在治疗肾小球肾炎中可能的作用机制。体外实验已经证实，雷公藤内酯醇对T细胞及B细胞均有影响，可以明显抑制有丝分裂原刺激淋巴细胞的增生，对活化的淋巴细胞可以诱导凋亡，并通过抑制淋巴细胞NF-κB的活力而减少一些炎性因子及细胞因子的产生。大黄素治疗肾小球肾炎的主要机制在于其对肾固有细胞的影响。体外实验发现，大黄素可以抑制肾固有细胞(如系膜细胞)的增生，减少系膜细胞细胞外基质的产生。已往研究中也证实，大黄素也可以抑制T细胞及B细胞的增生及IL-2的产生[17]，并对鼠单核细胞IL-1及TNF-α的产生也有抑制作用[18，19]。本研究对大鼠脾脏重量的测定结果发现(结果未列出)，大鼠肾炎模型建立4周时，雷公藤内酯醇治疗组及双药联用组脾脏重量较肾炎未治疗组降低较明显，单用大黄素治疗组大鼠的脾脏重量较肾炎对照组也有减轻，但由于未对大鼠其它的免疫学指标进行深入观察，因此除了对肾固有细胞的影响外，大黄素对机体免疫系统是否有影响尚待进一步研究。
, 百拇医药
目前，在我国，肾小球肾炎仍然是影响人们身体健康的重要原因，每年因肾小球肾炎而进入终末期肾衰的患者居各病因之首[20]。对于肾小球肾炎的治疗以往较强调应用对免疫系统有干预作用的药物，而忽视针对肾固有细胞展开治疗。本研究证实大黄素与具有免疫抑制作用的雷公藤联用后可加强肾小球肾炎的治疗效果。因此联合应用雷公藤内酯醇与大黄素治疗肾小球肾炎应具有广阔的应用前景。
参考文献
1，Hrick DE，Chung-Park M，Sedor JR.Glomerulonephritis.N Eng J Med，1998，339(13)：888
2，Wardle EN.Glomerulopathies：Cell biology and immunology.Amsterdam：Harwood Academic Publishers GmbH，1996.51
, 百拇医药
3，Johnson RJ.The glomerular response of injury：progression or resolution？Kidney Int，1994，45：1769
4，Sedor JR，Konieczkowski M，Huang S et al.Cytokines，mesangial cell activation and glomerular injury.Kidney Int，1993，39：S65
5，戴春笋，杨俊伟，陈朝红等.雷公藤内酯醇诱导淋巴细胞发生细胞凋亡的作用与细胞活化程度的关系.中华微生物与免疫学杂志，1999，19：391
6，刘 浩，刘志红，章 精等.雷公藤内酯醇降低T淋巴细胞核因子-κB的活性.肾脏病与透析肾移植杂志，1998，7：312
7，杨俊伟，戴春笋，樊忠民等.雷公藤内酯醇延长大鼠同种异体移植肾存活时间的作用.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6(3)：214
, 百拇医药
8，Li Leishi.End stage renal disease in china.Kidney Int，1996，49：287
9，Schreiner GF.A monocyte cell component in experimental immunological glomerulonephritis.J Exp Med，1978，147：369
10，Sabato GD.Chemotaxis and inflammation.California：A cadamic Press INC.1988.P440
11，黎磊石，杨俊伟.雷公藤药理与临床研究.中国药理学年鉴，1993.p40
12，黎磊石，张 训，陈光永等.雷公藤治疗肾小球肾炎的临床研究.中华内科杂志，1982，20(4)：216
, http://www.100md.com
13，黎磊石，张 训，陈惠萍等.雷公藤治疗肾小球肾炎的临床及实验研究.中华医学杂志，1982，62(10)：581
14，戎 殳，胡伟新，刘志红等.系膜增殖性肾小球肾炎和新疗法：雷公藤多甙新治疗方案的疗效观察.肾脏病与透析肾移植杂志，1998，7(5)：409
15，Berline EC.A reappraisal of immune-mediated glomerulosclerosis.Kidney Int，1996，49：605
16，Tipping PG，Richard-Kitchng A，Cunningham MA et al. Immunopathogenesis of crescentic glomerulonephritis.Current Opinion in Nephrology and Hypertension，1999，8：281
, 百拇医药
17，Pippin JW，Qu Qy，Meijer L et al. Direct in vivo inhibition of the nuclear cell cycle cascade in experimental mesangial proliferative glomerulonephritis with roscovitine，a novel cyclin-dependent kinase antagonist.J Clin Invest，1997，100：2512
18，姚 健，黎磊石，赵 荣.大黄素对IL-1产生的抑制作用.中国实验临床免疫学杂志，1991，3(4)：42
19，胡伟新，姚 健，黎磊石.大黄影响MψIL-1及TNF产生的体外观察.金陵医院学报，1991，4(4)：404
20，黎磊石，关天俊，刘志红等.4298例成人肾小球疾病理类型及流行病学特点.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6(2)：103
(2000-02-16收稿), 百拇医药