肌苷调节视网膜节细胞轴突再生
作者：景筠 Nina Irwin Larry I.Benowitz
单位：景筠(北京同仁医院)；Nina Irwin Larry I.Benowitz(美国麻省波士顿02115，哈佛医学院儿童医院神经科学中心神经外科实验室)
关键词：嘌呤；神经营养因子；轴突再生；视网膜
眼科研究000311 摘要 目的 探讨肌苷对中枢神经再生的影响。方法 分离并制作均匀的视网膜神经节细胞(RGC)悬液，采用24孔培养皿培养，观察嘌呤类物质对RGC轴突生长及细胞存活的影响。结果 (1)肌苷促使RGC轴突生长；腺苷只有水解脱氨生成肌苷才能促使轴突生长。(2)肌苷与6-硫鸟嘌呤(6-TG)可能竞争性作用于蛋白激酶N(PKN)调节轴突生长。(3)肌苷刺激RGC致GAP-43表达增强。(4)肌苷的细胞内信息传递通路可能通过有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)两条途径起作用。结论 肌苷在RGC神经再生中起积极的调节作用。
, 百拇医药
分类号 R774
Inosine regulates axon regeneration in retinal ganglion cells
Jing Yun，Nina Irwin，Larry I.Benowitz
(Ender’s Research Lab.312 Laboratory for Neurosicence Research in Neurosurg，Children’s hospital，Harvard Medical school，Boston，MAO 2115，USA C Jing Yun，Presently in Beijing Tong Ren Hospital，Beijing 100730)
Abstract Objective To investigate the involvement of purine in the development and regeneration of neurons.Methods Goldfish were dark-adapted，and their retinas were dissected.Retinas were dissociated by gentle trituration.Repeated cycles of trituration and sedimentation yielded cultures nearly homogeneous in ganglion cells.Low-density cells in 24-well culture dishes were maintained in a serum free.Axonal outgrowth and survival of retinal ganglion cells (RGC) in response to purine were evaluated.Results (1) Inosine stimulated axon outgrowth from RGC.Adenosine must be hydrolyzed to inosine via adenosine deaminase to stimulate RGC outgrowth.In the presence of aenosine deaminase inhibitor (deoxycoformycin)，adenosine not only failed to stimulate growth，but also cause (RGC) to die.(2) 6-Thioguanine 10μmol/L completely arrested axon outgrowth stimulated by AF-1 though not affecting cell survival.Inosine 100μmol/L reversed the inhibitory effects of 6-thioguanine on AF-1 cometitively and may stimulate growth by direct activation of protein kinase-N.(3) Inosine increased expression of GAP-43 in RGC.(4)In signaling transduction studying，PD 98059 and LY 294002，specific inhibitors to MAPKK and PI3K respectively，either alone blocked 50% of growth by inosine，blocked 100% growth by inosine if combined together.Inosine may therefore stimulate growth via MEK-1/2 and PI3K pathways.Conclusion Inosine plays an important role in the development and regeneration of RGC.It suggests the possibility of a clinically therapeutic opportunity to be explored further in central nervous system neuron diseases.
, http://www.100md.com
Key words purine neurotrophic factor axogenesis retina
神经系统退行性疾病、脊髓损伤是困扰人类的神经系统常见病，均导致永久性神经功能缺失。对此，医学界一直缺乏有效的治疗手段。Benowitz实验室以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)再生作为研究中枢神经系统(central nervous system，CNS)神经元再生的模型，在发现视神经胶质细胞分泌的轴突生长因子(axogenesis factor，AF-1，AF-2/3)促进RGC轴突再生[1，2]的同时，也对嘌呤、嘧啶类物质在调节CNS神经元轴突生长过程中的作用进行了系统的研究，本文就肌苷(inosine)在调节RGC轴突生长方面的突出作用及其细胞内调节机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1 视网膜神经节细胞培养 金鱼(Comet Variety，Mt.Parnell Fisheries，Mt.Parnell，PA)6～10cm长，避光30min，冰冻麻醉，分离视网膜。视网膜在含木瓜蛋白酶、半胱氨酸的消化液中消化45min，在L-15培养液中研磨3遍，上层2/5悬液为纯化RGC匀浆。用经聚赖氨酸涂层的24孔培养皿，细胞密度为每孔5×1000，培养液含胰岛素、牛血清白蛋白、庆大霉素、过氧化氢酶、转铁蛋白、超氧岐化酶、氢化可的松等，在21℃培养箱中培养5天。
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1.2 GAP-43免疫染色 用新鲜4%福尔马林液固定细胞，100%甲醇去脂，第一抗体系兔IgG结合金鱼GAP-43，第二抗体系选用羊抗兔IgG抗体，在荧光显微镜下计数染色细胞。
1.3 试剂 AF-1由本实验室制备，终浓度20%～35%。肌苷、腺苷(adenosine)、次黄嘌呤(hypoxanthine)、5’-一磷酸肌苷(5’-inosine monophosphate，5’-IMP)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine，6-TG)、LY294002由Sigma公司提供。L-15培养液由Gibco BRL公司提供。2-Deoxycoformycin(DCF)，PD98059来自Calbiochem公司。
1.4 设计与检验 每组试验均以AF-1为阳性对照，以L-15培养液为阴性对照，每个样本均分4份，样本与对照按随机化原则分布在24孔培养皿中，密码封存。5天后在400倍显微镜下，每孔计数不少于150个细胞，计数其中轴突长于5个细胞体直径的RGC数，以此计算平均生长率；计数所用视野数，以此计算平均存活率。应用Cricket Graph软件(CA Associates，Islandia，NY)计算生长率、标准误，然后对数据进行标准化处理。标准化平均生长率＝(样本平均生长率-阴性对照平均生长率)/(阳性对照平均生长率-阴性对照平均生长率)；标准化标准误＝样本标准误/(阳性对照平均生长率-阴性对照平均生长率)；平均存活率＝细胞总数/视野数。以Cricket Graph软件作条图。采用配对计量资料t检验法。大多数实验均多次重复。
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2 结果
2.1 肌苷调节RGC轴突生长 AF-1是视神经胶质细胞分泌的一种小分子量轴突生长因子，能诱导RGC轴突显著生长，L-15培养液则无此作用[1，2]。以这两种因素分别作为阳性与阴性对照，我们发现肌苷有刺激RGC轴突生长的作用，经多次试验，发现其有效半量浓度(E-50)是10～15μmol/L，25～50μmol/L达最大活性，相当于AF-1活性60%。肌苷代谢产物Hypoxanthine，5’-IMP，除5’-IMP在100μmol/L有较低活性(较肌苷10μmol/L活性还低)外，其余均无刺激轴突生长的作用(图1)。
**P<0.01 ***P<0.001
图1 嘌呤对RGC轴突生长的影响
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Fig.1 RGC regenerate axons in response to purines
Aden (adenosine)，Ino (inosine)，Hypo (hypoxanthine)，5’-IMP
(5’-inosine monophosphate)
***P<0.001
图2 腺苷脱氨后刺激轴突生长
Fig.2 Adenosine，hydrolyzed via ADA，stimulates outgrowth
ADA(adenosine deaminase)0.4U/ml and DCF(deoxycoformycin)10μmol/L 腺苷也有刺激轴突生长的作用(E50＝10～15μmol/L)，50～100μmol/L达最大活性，相当于AF-1活性60%(图1)。腺苷在ADA作用下，水解脱氨生成肌苷。应用ADA抑制剂DCF(10μmol/L)抑制ADA活性，使腺苷不能脱氨，可看到腺苷(100μmol/L)不仅显著抑制轴突生长，还降低细胞存活率(P<0.001)。外源性ADA(0.4U/ml)对腺苷引起的轴突生长及细胞存活率均无影响(图2)。提示腺苷刺激轴突生长的作用有赖于腺苷水解脱氨。
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2.2 肌苷刺激GAP-43表达增强 已知GAP-43是与神经生长相关的一种膜磷脂蛋白。应用GAP-43多克隆抗体技术，依肌苷，AF-1，L-15培养液各组对GAP-43荧光染色的强度分3组(无反应、中度染色、高度染色)，结果显示AF-1，肌苷两组高度染色细胞数较阴性对照L-15组分别增加高达8倍、5.5倍，而3组均显示轴突长度与染色强度一致。提示肌苷促进GAP-43表达增强。
2.3 肌苷与6-TG竞争性调节轴突生长 6-TG是嘌呤同类物，在PC-12细胞，已经发现6-TG阻断神经生长因子(nerve growth factor，NGF)引起的轴突生长，但不影响存活率。我们发现10μmol/L6-TG可完全阻断AF-1引起的RGC轴突生长，不影响细胞存活；阻断25μmol/L肌苷作用的50%，对100μmol/L肌苷无抑制作用。令人惊奇的是，100μmol/L肌苷可完全扭转10μmol/L6-TG对AF-1的抑制作用，恢复AF-1活性至其原有高度，且扭转后达到的活性高度显著高于100μmol/L肌苷本身的活性高度。提示肌苷与6-TG之间可能竞争性通过某个同样的途径而影响轴突生长。
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2.4 肌苷可能通过的细胞内信息传递通路 进一步对引起CNS神经元轴突生长的细胞内信息传递通路进行研究，发现在离体RGC，有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)抑制剂—PD，磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3’ kinase，PI3K)抑制剂—LY，若分别使用，两者均可抑制肌苷刺激轴突生长活性50%，两者结合，则抑制肌苷活性100%。PD或LY单独使用均不对AF-1有影响，两者结合，也只有部分抑制作用。PD，LY均不影响存活率。
3 讨论
自从20世纪40年代发现了NGF以来，又发现了一系列作用于中枢及外周神经系统的神经营养因子，如NGF家族成员BDNF，NT3，NT-4/5，与NGF无同源性的神经营养因子如CNTF等，确认神经营养因子可用于CNS退行性疾病等的治疗。
我们在对AF-1，AF-2/3分离提纯及信息传递通路研究的同时，发现嘌呤，特别是肌苷对RGC轴突生长起积极调节作用，腺苷只有通过水解脱氨生成肌苷才能刺激轴突生长，否则若抑制腺苷脱氨酶活性，腺苷不仅抑制轴突生长，还加速细胞死亡。据Huan等报道，腺苷通过水解脱氨成肌苷对星形细胞起保护作用[3]。Wakada等报道，腺苷抑制鸡胚胎交感神经元生长，并致使NGF支持的80%交感神经元死亡，腺苷脱氨酶抑制剂强化腺苷的上述神经毒性作用，肌苷则无此毒性作用[4]，从另一个侧面印证我们的发现，腺苷若不能水解脱氨，不仅抑制神经元轴突生长，还加速细胞死亡。
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6-TG属嘌呤类物质，Greene及其同事们发现6-TG通过选择性抑制蛋白激酶N(protein kinase N，PKN)，阻断NGF通过激活PKN进而诱导神经元生长，但不影响细胞存活率[5，6]。我们的结果显示，肌苷与6-TG之间有浓度依赖关系，10μmol/L6-TG能完全阻断AF-1的生物学活性，阻断25μmol/L肌苷刺激轴突生长作用的50%，对100μmol/L肌苷无作用，而100μmol/L肌苷能完全扭转6-TG对AF-1的抑制，使其活性恢复至原有高度，且超过100μmol/L肌苷本身的活性，提示肌苷可能与6-TG竞争PKN而对神经元起调节作用。
虽然至今对神经营养因子的研究已趋深入，但对其细胞内信息传递机制还不十分清楚。已知MAPK，PI3K是信息传递通路中的两个关键酶，PD，LY分别是它们的抑制剂[7，8]。它们分别使用，各抑制100μmol/L肌苷活性50%，结合使用，则阻断作用达100%，对细胞存活无影响。提示肌苷在通过PKN后，还有可能通过MAPK，PI13K两途径。
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GAP-43是与神经生长与可塑性有关的重要膜磷脂蛋白[9]，在低等脊椎动物及哺乳动物，神经生长期间伴随GAP-43表达增强[10]，肌苷可刺激GAP-43表达增强，提示肌苷有刺激轴突再生的作用。肌苷是否具有促进CNS神经再生的临床使用价值，有待进一步探索。
1，Schwalb JM，Boulis NM，Gu MF，et al.Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture.J Neurosci，1995，15∶5514
2，Schwalb JM，Gu MF，Stuermer CAO，et al.Optic nerve glia secrete a low molecular weight factor that stimulates retinal ganglion cells to regenerate axon in goldfish.Neuroscience，1996，72∶901
, http://www.100md.com
3，Huan SE，Segeleon JE，Trapp VL，et al.Inosine mediates the protective effect of adenosine in rat astrocyte cultures subjected to combined glucose-oxygen deprivation.J Neurochem，1996，67∶2051
4，Wakade TD，Palmer KC，McCauley R，et al.Adenosine-induced apoptosis in chick embryonic sympathetic neurons：a new physiological role for adenosine.J Physiol，1995，488∶123
5，Volonte C，Rukenstein A，Loeb DM，et al.Differential inhibition of nerve growth factor responses by purine analogues：correlation with inhibition of a nerve growth factor-activated protein kinase.J Cell Biol，1989，109∶2395
, 百拇医药
6，Volonte C，Loeb DM，Greene LA.A purine analog-sensitive protein kinase activity associates with trk nerve growth factor receptors.J Neurochem，1993，61∶664
7，Alessi DR，Cuenda A，Cohen P，et al.PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo.J Bio Chem，1995，270∶27489
8，Parrizas M，Saltiel AR，le Roith D.Insulin-like growth factor 1 inhibit apoptosis using the phosphatidylionositol 3’-kinase and mitogen-activated protein kinase pathways.J Bio Chem，1997，272∶154
, 百拇医药
9，Benowitz LI，Routtenberg A.Gap-43：an intrinsic determinant of neural development and synaptic plasticity.Trends Neurosci，1997，20∶84
10，Berry M，Carlile J，Hunter A.Peripheral nerve explants grafted into the vitreous body of the eye promote the regeneration of retinal ganglion cell axons severed in the optic nerve.J Neurocytol，1996，25∶147
(收稿：1999-06-23 修回：2000-01-15), 百拇医药
单位：景筠(北京同仁医院)；Nina Irwin Larry I.Benowitz(美国麻省波士顿02115，哈佛医学院儿童医院神经科学中心神经外科实验室)
关键词：嘌呤；神经营养因子；轴突再生；视网膜
眼科研究000311 摘要 目的 探讨肌苷对中枢神经再生的影响。方法 分离并制作均匀的视网膜神经节细胞(RGC)悬液，采用24孔培养皿培养，观察嘌呤类物质对RGC轴突生长及细胞存活的影响。结果 (1)肌苷促使RGC轴突生长；腺苷只有水解脱氨生成肌苷才能促使轴突生长。(2)肌苷与6-硫鸟嘌呤(6-TG)可能竞争性作用于蛋白激酶N(PKN)调节轴突生长。(3)肌苷刺激RGC致GAP-43表达增强。(4)肌苷的细胞内信息传递通路可能通过有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)两条途径起作用。结论 肌苷在RGC神经再生中起积极的调节作用。
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分类号 R774
Inosine regulates axon regeneration in retinal ganglion cells
Jing Yun，Nina Irwin，Larry I.Benowitz
(Ender’s Research Lab.312 Laboratory for Neurosicence Research in Neurosurg，Children’s hospital，Harvard Medical school，Boston，MAO 2115，USA C Jing Yun，Presently in Beijing Tong Ren Hospital，Beijing 100730)
Abstract Objective To investigate the involvement of purine in the development and regeneration of neurons.Methods Goldfish were dark-adapted，and their retinas were dissected.Retinas were dissociated by gentle trituration.Repeated cycles of trituration and sedimentation yielded cultures nearly homogeneous in ganglion cells.Low-density cells in 24-well culture dishes were maintained in a serum free.Axonal outgrowth and survival of retinal ganglion cells (RGC) in response to purine were evaluated.Results (1) Inosine stimulated axon outgrowth from RGC.Adenosine must be hydrolyzed to inosine via adenosine deaminase to stimulate RGC outgrowth.In the presence of aenosine deaminase inhibitor (deoxycoformycin)，adenosine not only failed to stimulate growth，but also cause (RGC) to die.(2) 6-Thioguanine 10μmol/L completely arrested axon outgrowth stimulated by AF-1 though not affecting cell survival.Inosine 100μmol/L reversed the inhibitory effects of 6-thioguanine on AF-1 cometitively and may stimulate growth by direct activation of protein kinase-N.(3) Inosine increased expression of GAP-43 in RGC.(4)In signaling transduction studying，PD 98059 and LY 294002，specific inhibitors to MAPKK and PI3K respectively，either alone blocked 50% of growth by inosine，blocked 100% growth by inosine if combined together.Inosine may therefore stimulate growth via MEK-1/2 and PI3K pathways.Conclusion Inosine plays an important role in the development and regeneration of RGC.It suggests the possibility of a clinically therapeutic opportunity to be explored further in central nervous system neuron diseases.
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Key words purine neurotrophic factor axogenesis retina
神经系统退行性疾病、脊髓损伤是困扰人类的神经系统常见病，均导致永久性神经功能缺失。对此，医学界一直缺乏有效的治疗手段。Benowitz实验室以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)再生作为研究中枢神经系统(central nervous system，CNS)神经元再生的模型，在发现视神经胶质细胞分泌的轴突生长因子(axogenesis factor，AF-1，AF-2/3)促进RGC轴突再生[1，2]的同时，也对嘌呤、嘧啶类物质在调节CNS神经元轴突生长过程中的作用进行了系统的研究，本文就肌苷(inosine)在调节RGC轴突生长方面的突出作用及其细胞内调节机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1 视网膜神经节细胞培养 金鱼(Comet Variety，Mt.Parnell Fisheries，Mt.Parnell，PA)6～10cm长，避光30min，冰冻麻醉，分离视网膜。视网膜在含木瓜蛋白酶、半胱氨酸的消化液中消化45min，在L-15培养液中研磨3遍，上层2/5悬液为纯化RGC匀浆。用经聚赖氨酸涂层的24孔培养皿，细胞密度为每孔5×1000，培养液含胰岛素、牛血清白蛋白、庆大霉素、过氧化氢酶、转铁蛋白、超氧岐化酶、氢化可的松等，在21℃培养箱中培养5天。
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1.2 GAP-43免疫染色 用新鲜4%福尔马林液固定细胞，100%甲醇去脂，第一抗体系兔IgG结合金鱼GAP-43，第二抗体系选用羊抗兔IgG抗体，在荧光显微镜下计数染色细胞。
1.3 试剂 AF-1由本实验室制备，终浓度20%～35%。肌苷、腺苷(adenosine)、次黄嘌呤(hypoxanthine)、5’-一磷酸肌苷(5’-inosine monophosphate，5’-IMP)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine，6-TG)、LY294002由Sigma公司提供。L-15培养液由Gibco BRL公司提供。2-Deoxycoformycin(DCF)，PD98059来自Calbiochem公司。
1.4 设计与检验 每组试验均以AF-1为阳性对照，以L-15培养液为阴性对照，每个样本均分4份，样本与对照按随机化原则分布在24孔培养皿中，密码封存。5天后在400倍显微镜下，每孔计数不少于150个细胞，计数其中轴突长于5个细胞体直径的RGC数，以此计算平均生长率；计数所用视野数，以此计算平均存活率。应用Cricket Graph软件(CA Associates，Islandia，NY)计算生长率、标准误，然后对数据进行标准化处理。标准化平均生长率＝(样本平均生长率-阴性对照平均生长率)/(阳性对照平均生长率-阴性对照平均生长率)；标准化标准误＝样本标准误/(阳性对照平均生长率-阴性对照平均生长率)；平均存活率＝细胞总数/视野数。以Cricket Graph软件作条图。采用配对计量资料t检验法。大多数实验均多次重复。
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2 结果
2.1 肌苷调节RGC轴突生长 AF-1是视神经胶质细胞分泌的一种小分子量轴突生长因子，能诱导RGC轴突显著生长，L-15培养液则无此作用[1，2]。以这两种因素分别作为阳性与阴性对照，我们发现肌苷有刺激RGC轴突生长的作用，经多次试验，发现其有效半量浓度(E-50)是10～15μmol/L，25～50μmol/L达最大活性，相当于AF-1活性60%。肌苷代谢产物Hypoxanthine，5’-IMP，除5’-IMP在100μmol/L有较低活性(较肌苷10μmol/L活性还低)外，其余均无刺激轴突生长的作用(图1)。
**P<0.01 ***P<0.001
图1 嘌呤对RGC轴突生长的影响
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Fig.1 RGC regenerate axons in response to purines
Aden (adenosine)，Ino (inosine)，Hypo (hypoxanthine)，5’-IMP
(5’-inosine monophosphate)
***P<0.001
图2 腺苷脱氨后刺激轴突生长
Fig.2 Adenosine，hydrolyzed via ADA，stimulates outgrowth
ADA(adenosine deaminase)0.4U/ml and DCF(deoxycoformycin)10μmol/L 腺苷也有刺激轴突生长的作用(E50＝10～15μmol/L)，50～100μmol/L达最大活性，相当于AF-1活性60%(图1)。腺苷在ADA作用下，水解脱氨生成肌苷。应用ADA抑制剂DCF(10μmol/L)抑制ADA活性，使腺苷不能脱氨，可看到腺苷(100μmol/L)不仅显著抑制轴突生长，还降低细胞存活率(P<0.001)。外源性ADA(0.4U/ml)对腺苷引起的轴突生长及细胞存活率均无影响(图2)。提示腺苷刺激轴突生长的作用有赖于腺苷水解脱氨。
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2.2 肌苷刺激GAP-43表达增强 已知GAP-43是与神经生长相关的一种膜磷脂蛋白。应用GAP-43多克隆抗体技术，依肌苷，AF-1，L-15培养液各组对GAP-43荧光染色的强度分3组(无反应、中度染色、高度染色)，结果显示AF-1，肌苷两组高度染色细胞数较阴性对照L-15组分别增加高达8倍、5.5倍，而3组均显示轴突长度与染色强度一致。提示肌苷促进GAP-43表达增强。
2.3 肌苷与6-TG竞争性调节轴突生长 6-TG是嘌呤同类物，在PC-12细胞，已经发现6-TG阻断神经生长因子(nerve growth factor，NGF)引起的轴突生长，但不影响存活率。我们发现10μmol/L6-TG可完全阻断AF-1引起的RGC轴突生长，不影响细胞存活；阻断25μmol/L肌苷作用的50%，对100μmol/L肌苷无抑制作用。令人惊奇的是，100μmol/L肌苷可完全扭转10μmol/L6-TG对AF-1的抑制作用，恢复AF-1活性至其原有高度，且扭转后达到的活性高度显著高于100μmol/L肌苷本身的活性高度。提示肌苷与6-TG之间可能竞争性通过某个同样的途径而影响轴突生长。
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2.4 肌苷可能通过的细胞内信息传递通路 进一步对引起CNS神经元轴突生长的细胞内信息传递通路进行研究，发现在离体RGC，有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)抑制剂—PD，磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3’ kinase，PI3K)抑制剂—LY，若分别使用，两者均可抑制肌苷刺激轴突生长活性50%，两者结合，则抑制肌苷活性100%。PD或LY单独使用均不对AF-1有影响，两者结合，也只有部分抑制作用。PD，LY均不影响存活率。
3 讨论
自从20世纪40年代发现了NGF以来，又发现了一系列作用于中枢及外周神经系统的神经营养因子，如NGF家族成员BDNF，NT3，NT-4/5，与NGF无同源性的神经营养因子如CNTF等，确认神经营养因子可用于CNS退行性疾病等的治疗。
我们在对AF-1，AF-2/3分离提纯及信息传递通路研究的同时，发现嘌呤，特别是肌苷对RGC轴突生长起积极调节作用，腺苷只有通过水解脱氨生成肌苷才能刺激轴突生长，否则若抑制腺苷脱氨酶活性，腺苷不仅抑制轴突生长，还加速细胞死亡。据Huan等报道，腺苷通过水解脱氨成肌苷对星形细胞起保护作用[3]。Wakada等报道，腺苷抑制鸡胚胎交感神经元生长，并致使NGF支持的80%交感神经元死亡，腺苷脱氨酶抑制剂强化腺苷的上述神经毒性作用，肌苷则无此毒性作用[4]，从另一个侧面印证我们的发现，腺苷若不能水解脱氨，不仅抑制神经元轴突生长，还加速细胞死亡。
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6-TG属嘌呤类物质，Greene及其同事们发现6-TG通过选择性抑制蛋白激酶N(protein kinase N，PKN)，阻断NGF通过激活PKN进而诱导神经元生长，但不影响细胞存活率[5，6]。我们的结果显示，肌苷与6-TG之间有浓度依赖关系，10μmol/L6-TG能完全阻断AF-1的生物学活性，阻断25μmol/L肌苷刺激轴突生长作用的50%，对100μmol/L肌苷无作用，而100μmol/L肌苷能完全扭转6-TG对AF-1的抑制，使其活性恢复至原有高度，且超过100μmol/L肌苷本身的活性，提示肌苷可能与6-TG竞争PKN而对神经元起调节作用。
虽然至今对神经营养因子的研究已趋深入，但对其细胞内信息传递机制还不十分清楚。已知MAPK，PI3K是信息传递通路中的两个关键酶，PD，LY分别是它们的抑制剂[7，8]。它们分别使用，各抑制100μmol/L肌苷活性50%，结合使用，则阻断作用达100%，对细胞存活无影响。提示肌苷在通过PKN后，还有可能通过MAPK，PI13K两途径。
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GAP-43是与神经生长与可塑性有关的重要膜磷脂蛋白[9]，在低等脊椎动物及哺乳动物，神经生长期间伴随GAP-43表达增强[10]，肌苷可刺激GAP-43表达增强，提示肌苷有刺激轴突再生的作用。肌苷是否具有促进CNS神经再生的临床使用价值，有待进一步探索。
1，Schwalb JM，Boulis NM，Gu MF，et al.Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture.J Neurosci，1995，15∶5514
2，Schwalb JM，Gu MF，Stuermer CAO，et al.Optic nerve glia secrete a low molecular weight factor that stimulates retinal ganglion cells to regenerate axon in goldfish.Neuroscience，1996，72∶901
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3，Huan SE，Segeleon JE，Trapp VL，et al.Inosine mediates the protective effect of adenosine in rat astrocyte cultures subjected to combined glucose-oxygen deprivation.J Neurochem，1996，67∶2051
4，Wakade TD，Palmer KC，McCauley R，et al.Adenosine-induced apoptosis in chick embryonic sympathetic neurons：a new physiological role for adenosine.J Physiol，1995，488∶123
5，Volonte C，Rukenstein A，Loeb DM，et al.Differential inhibition of nerve growth factor responses by purine analogues：correlation with inhibition of a nerve growth factor-activated protein kinase.J Cell Biol，1989，109∶2395
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6，Volonte C，Loeb DM，Greene LA.A purine analog-sensitive protein kinase activity associates with trk nerve growth factor receptors.J Neurochem，1993，61∶664
7，Alessi DR，Cuenda A，Cohen P，et al.PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo.J Bio Chem，1995，270∶27489
8，Parrizas M，Saltiel AR，le Roith D.Insulin-like growth factor 1 inhibit apoptosis using the phosphatidylionositol 3’-kinase and mitogen-activated protein kinase pathways.J Bio Chem，1997，272∶154
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9，Benowitz LI，Routtenberg A.Gap-43：an intrinsic determinant of neural development and synaptic plasticity.Trends Neurosci，1997，20∶84
10，Berry M，Carlile J，Hunter A.Peripheral nerve explants grafted into the vitreous body of the eye promote the regeneration of retinal ganglion cell axons severed in the optic nerve.J Neurocytol，1996，25∶147
(收稿：1999-06-23 修回：2000-01-15), 百拇医药