曲格列酮对链脲霉素诱发的糖尿病鼠神经病变的抑制效应
作者：欧阳金芝(译)
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000313X.Qiang, J.Satoh, M.Sagara, M.Fukuzawa, T.Masuda, Y.Sakata, G.Muto, Y.Muto,K.Takahashi, T.Toyota
Inhibitory effect of troglitazone on diabetic neuropathy in streptozotocin-induced diabetic rats
长期高血糖导致多元醇通路活性增强和糖化终产物增多，进而引起神经和血管功能失调最终导致糖尿病神经病变。这些产物刺激自由基和细胞因子的产生，可能在糖尿病神经病变的发生中起一定的作用。我们以前曾报道过糖尿病动物模型和糖尿病人持续高血糖时，TNF-α肿瘤坏死因子产生增加。N乙酰半胱氨酸和乙酮可可碱是自由基清除剂和TNF-α抑制剂，它们可减轻STZ诱导的糖尿病鼠的糖尿病神经病变。这些结果提示自由基清除剂或/和TNF-α抑制剂可以抑制糖尿病神经病变的发展。
, 百拇医药
曲格列酮是一种新的口服抗糖尿病药物，它是噻唑烷类衍生物，通过与核过氧化物增殖活化受体(PPAR-γ)结合而改善胰岛素信号通路，减少胰岛素抵抗动物和病人的胰岛素抵抗。最近的研究显示曲格列酮也是自由基清除剂和TNF-α抑制剂，提示曲格列酮可能与N乙酰半胱氨酸和乙酮可可碱一样，能够抑制糖尿病神经病变。我们试图通过本研究来了解曲格列酮是否对糖尿病神经病变有抑制作用。
材料和方法
动物和模型制备 雄性Wistar/slc鼠，周龄12周，平均体重270g，尾静脉注入STZ，用量为体重30mg/kg，24h后血糖浓度超过16.67mol/l者为糖尿病鼠。
曲格列酮的使用 将低浓度(0.125%)和高浓度(0.5%)的曲格列酮混入粉末饲料中，在24周的实验期中用来喂养老鼠。药物剂量根据以前报道的动物实验而定。老鼠所用剂量为人类剂量的10～50倍。老鼠分为5组，每组10只。包括非糖尿病组、非糖尿病大剂量组、糖尿病组、糖尿病大剂量组、糖尿病小剂量组。实际摄入剂量根据每天的食量计算。
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血糖、体重和MNCV的测定 实验期为24周，分别于0、4、12、16、20周测定血糖、体重和MNCV。血糖浓度用血糖仪通过葡萄糖氧化酶法测定。使用以前报道过的标准方法测定左胫神经的MNCV。
血清和神经过氧化脂质的测定 在24周末取血清测定过氧化脂质，使用试剂盒，通过硫巴比妥盐反应进行检测。
至于神经过氧化脂质的检测，将10～20mg冷冻的左胫神经，在1ml磷酸盐缓冲液中用匀浆器搅匀。用上述测定血清过氧化脂质的方法，分别测定匀浆和经离心分离出的上清液中过氧化脂质的含量。用蛋白测定试剂盒测定匀浆和上清液中蛋白质的浓度。神经过氧化脂质的含量以nmol/mg蛋白质表示。由于匀浆和上清液的过氧化脂质的测定结果相似，故以上清液的测定结果作为神经过氧化脂质的含量。
血清胰岛素的测定 24周末取血清用试剂盒测定胰岛素。
TNF-α活性的检测 在实验的第22周，从每只鼠的尾静脉注入脂多糖(0.4mg/kg)，90分钟后采血，分离血清，按照以前报道的方法，用LM细胞测定TNF-α的活性。LM细胞是对TNF敏感的小鼠成纤维细胞的1个亚系。
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神经的形态学分析 24周末将所有动物麻醉后处死，分离左胫神经，立即用2.5%的戊二醛固定，环氧树脂包埋，切片后用甲苯胺蓝染色，以便在光镜下观察并进行形态学分析。染色后的神经切片用装备有电视照相机的数字照相机拍照。用神经束膜作为束状区的外界，通过计算机图像分析系统对有髓纤维的密度和有髓纤维区进行测定和分析。
结 果
曲格列酮对血糖和体重的作用 注射STZ?24小时后糖尿病鼠的血糖浓度高于16.67mmol/l，在整个实验过程中一直保持高血糖。无论糖尿病鼠还是非糖尿病鼠，治疗组和非治疗组血糖无明显差别，即本实验中曲格列酮治疗不影响血糖浓度。
最初，5组鼠体重相近，非糖尿病组及非糖尿病大剂量组，体重随年龄增加而增加。而糖尿病组、糖尿病大剂量组、糖尿病小剂量组中鼠的体重减轻，体重低于非糖尿病组(P<0.01)。曲格列酮治疗对糖尿病组和非糖尿病组鼠的体重没有影响。
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曲格列酮使糖尿病鼠过高的血清过氧化脂质浓度和血清过氧化脂质含量下降 糖尿病组血清过氧化脂质浓度和胫神经过氧化脂质含量高于非糖尿病组(P<0.01)。糖尿病大剂量组鼠的血清和神经过氧化脂质增多被抑制(P<0.05)。
曲格列酮可以抑制脂多糖(LPS)诱导的血清TNF-α活性增加 糖尿病组鼠LPS诱导的血清TNF-α活性明显高于非糖尿病组。糖尿病鼠TNF-α活性增加可以被大、小剂量的曲格列酮抑制(P<0.01)。在非糖尿病大剂量组，曲格列酮对TNF-α活性无明显抑制作用。
曲格列酮对MNCV的作用 非糖尿病鼠的MNCV随年龄增加略有增加，但糖尿病鼠4周后MNCV反而下降。经大、小剂量的曲格列酮治疗后糖尿病鼠在12、16W后MNCV减慢的速度受到抑制(P<0.05～0.01)。曲格列酮对非糖尿病大剂量组的MNCV没有影响。
曲格列酮对神经形态学的影响 在第24周末将鼠左胫神经进行形态学分析，糖尿病鼠的有髓纤维区、轴/髓比例和束状区明显低于非糖尿病鼠，这种降低可被剂量的曲格列酮抑制。相反，糖尿病鼠的纤维密度是增加的，大剂量的曲格列酮可以抑制纤维密度的增加。
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曲格列酮对实验末血清胰岛素和血糖浓度的影响 经实验证实糖尿病鼠的血清胰岛素水平低于非糖尿病鼠，前者的血糖水平高于后者。曲格列酮对胰岛素和血糖浓度没有影响。
讨 论
本研究显示曲格列酮与N乙酰半胱氨酸和己酮可可碱一样可抑制血清过氧化脂质浓度和神经过氧化脂质的含量，并可抑制TNF-α的过度产生，减缓糖尿病神经病变的发展。
本实验中用含曲格列酮的饲料喂养鼠的时间较长，曲格列酮的剂量高于人类临床剂量，但与以前报道的动物实验剂量相同。以前的实验中曲格列酮有效地降低胰岛素抵抗鼠和小鼠的血糖浓度。本实验中曲格列酮对非糖尿病鼠和糖尿病鼠的非空腹血糖和胰岛素没有作用，原因可能是STZ诱导的糖尿病鼠缺乏胰岛素而不是胰岛素抵抗。同样，曲格列酮不影响体重，非糖尿病鼠的体重增加，糖尿病鼠体重下降。糖尿病大剂量组消耗曲格列酮的量是非糖尿病大剂量组的2倍，可能由于糖尿病鼠多食所致。
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虽然曲格列酮对血胰岛素和血糖浓度没有影响，但它对糖尿病鼠的MNCV减慢有抑制作用。实验末的形态学分析也证实了曲格列酮可以改善糖尿病神经病变。与以前的报道一样，糖尿病鼠与非糖尿病鼠相比，神经纤维区、轴/髓比例和束状区下降，而神经纤维密度增加，经曲格列酮治疗后糖尿病鼠的这些异常得到控制。
曲格列酮抑制糖尿病神经病变的确切机制尚不清楚，最近的研究显示曲格列酮是很强的自由基清除剂，而自由基清除剂可以防止糖尿病鼠的周围神经病变。我们的结果也提示曲格列酮有清除自由基的作用，即曲格列酮可以减少糖尿病鼠血、神经中增多的过氧化脂质。此外，大、小剂量的曲格列酮亦能抑制TNF-α的过度生成。最近有文章报道PPAR-γ配体，包括曲格列酮，可以在体外抑制沸波醇酯等激活巨噬细胞生成TNF-α，但不能抑制LPS诱导巨噬细胞生成TNF-α。这些资料与我们的结果不一致，我们观察到曲格列酮可以抑制慢性高血糖状态下LPS诱导的TNF-α的过度生成。由于在鼠类尚不能使用敏感的测定方法如ELASA来测定TNF-α，我们在实验中用LPS刺激后测量血清TNF-α。在体内不论用不用LPS以外的其它刺激物，曲格列酮可能会更明显地抑制TNF-α的产生。
, 百拇医药
曲格列酮清除自由基及抑制TNF-α可减轻糖尿病神经病变，它可能是通过减轻自由基和/或TNF-α所致的微循环障碍而起作用。我们的结果显示尽管从实验初即给予曲格列酮，但MNCV的改善在实验的第12、16周才有明显的统计学意义可能与上述机制有关。这一点提示曲格列酮治疗可以影响神经病变的后期，即抑制神经病变的恶化而不是阻止其发生。
总之，曲格列酮可以抑制STZ诱导的糖尿病鼠的MNCV的减慢及周围神经的形态学变化，这一作用与血糖浓度无关。
Diabetologia,1998,41∶1321-1326
X.Qiang, J.Satoh, M.Sagara, M.Fukuzawa, T.Masuda, Y.Sakata, G.Muto, Y.Muto,K.Takahashi, T.Toyota(Third Department of Internal Medicine,Tohoku University School of Medicine,Aoba-ku,Sendai,Japan)
, 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000313X.Qiang, J.Satoh, M.Sagara, M.Fukuzawa, T.Masuda, Y.Sakata, G.Muto, Y.Muto,K.Takahashi, T.Toyota
Inhibitory effect of troglitazone on diabetic neuropathy in streptozotocin-induced diabetic rats
长期高血糖导致多元醇通路活性增强和糖化终产物增多，进而引起神经和血管功能失调最终导致糖尿病神经病变。这些产物刺激自由基和细胞因子的产生，可能在糖尿病神经病变的发生中起一定的作用。我们以前曾报道过糖尿病动物模型和糖尿病人持续高血糖时，TNF-α肿瘤坏死因子产生增加。N乙酰半胱氨酸和乙酮可可碱是自由基清除剂和TNF-α抑制剂，它们可减轻STZ诱导的糖尿病鼠的糖尿病神经病变。这些结果提示自由基清除剂或/和TNF-α抑制剂可以抑制糖尿病神经病变的发展。
, 百拇医药
曲格列酮是一种新的口服抗糖尿病药物，它是噻唑烷类衍生物，通过与核过氧化物增殖活化受体(PPAR-γ)结合而改善胰岛素信号通路，减少胰岛素抵抗动物和病人的胰岛素抵抗。最近的研究显示曲格列酮也是自由基清除剂和TNF-α抑制剂，提示曲格列酮可能与N乙酰半胱氨酸和乙酮可可碱一样，能够抑制糖尿病神经病变。我们试图通过本研究来了解曲格列酮是否对糖尿病神经病变有抑制作用。
材料和方法
动物和模型制备 雄性Wistar/slc鼠，周龄12周，平均体重270g，尾静脉注入STZ，用量为体重30mg/kg，24h后血糖浓度超过16.67mol/l者为糖尿病鼠。
曲格列酮的使用 将低浓度(0.125%)和高浓度(0.5%)的曲格列酮混入粉末饲料中，在24周的实验期中用来喂养老鼠。药物剂量根据以前报道的动物实验而定。老鼠所用剂量为人类剂量的10～50倍。老鼠分为5组，每组10只。包括非糖尿病组、非糖尿病大剂量组、糖尿病组、糖尿病大剂量组、糖尿病小剂量组。实际摄入剂量根据每天的食量计算。
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血糖、体重和MNCV的测定 实验期为24周，分别于0、4、12、16、20周测定血糖、体重和MNCV。血糖浓度用血糖仪通过葡萄糖氧化酶法测定。使用以前报道过的标准方法测定左胫神经的MNCV。
血清和神经过氧化脂质的测定 在24周末取血清测定过氧化脂质，使用试剂盒，通过硫巴比妥盐反应进行检测。
至于神经过氧化脂质的检测，将10～20mg冷冻的左胫神经，在1ml磷酸盐缓冲液中用匀浆器搅匀。用上述测定血清过氧化脂质的方法，分别测定匀浆和经离心分离出的上清液中过氧化脂质的含量。用蛋白测定试剂盒测定匀浆和上清液中蛋白质的浓度。神经过氧化脂质的含量以nmol/mg蛋白质表示。由于匀浆和上清液的过氧化脂质的测定结果相似，故以上清液的测定结果作为神经过氧化脂质的含量。
血清胰岛素的测定 24周末取血清用试剂盒测定胰岛素。
TNF-α活性的检测 在实验的第22周，从每只鼠的尾静脉注入脂多糖(0.4mg/kg)，90分钟后采血，分离血清，按照以前报道的方法，用LM细胞测定TNF-α的活性。LM细胞是对TNF敏感的小鼠成纤维细胞的1个亚系。
, http://www.100md.com
神经的形态学分析 24周末将所有动物麻醉后处死，分离左胫神经，立即用2.5%的戊二醛固定，环氧树脂包埋，切片后用甲苯胺蓝染色，以便在光镜下观察并进行形态学分析。染色后的神经切片用装备有电视照相机的数字照相机拍照。用神经束膜作为束状区的外界，通过计算机图像分析系统对有髓纤维的密度和有髓纤维区进行测定和分析。
结 果
曲格列酮对血糖和体重的作用 注射STZ?24小时后糖尿病鼠的血糖浓度高于16.67mmol/l，在整个实验过程中一直保持高血糖。无论糖尿病鼠还是非糖尿病鼠，治疗组和非治疗组血糖无明显差别，即本实验中曲格列酮治疗不影响血糖浓度。
最初，5组鼠体重相近，非糖尿病组及非糖尿病大剂量组，体重随年龄增加而增加。而糖尿病组、糖尿病大剂量组、糖尿病小剂量组中鼠的体重减轻，体重低于非糖尿病组(P<0.01)。曲格列酮治疗对糖尿病组和非糖尿病组鼠的体重没有影响。
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曲格列酮使糖尿病鼠过高的血清过氧化脂质浓度和血清过氧化脂质含量下降 糖尿病组血清过氧化脂质浓度和胫神经过氧化脂质含量高于非糖尿病组(P<0.01)。糖尿病大剂量组鼠的血清和神经过氧化脂质增多被抑制(P<0.05)。
曲格列酮可以抑制脂多糖(LPS)诱导的血清TNF-α活性增加 糖尿病组鼠LPS诱导的血清TNF-α活性明显高于非糖尿病组。糖尿病鼠TNF-α活性增加可以被大、小剂量的曲格列酮抑制(P<0.01)。在非糖尿病大剂量组，曲格列酮对TNF-α活性无明显抑制作用。
曲格列酮对MNCV的作用 非糖尿病鼠的MNCV随年龄增加略有增加，但糖尿病鼠4周后MNCV反而下降。经大、小剂量的曲格列酮治疗后糖尿病鼠在12、16W后MNCV减慢的速度受到抑制(P<0.05～0.01)。曲格列酮对非糖尿病大剂量组的MNCV没有影响。
曲格列酮对神经形态学的影响 在第24周末将鼠左胫神经进行形态学分析，糖尿病鼠的有髓纤维区、轴/髓比例和束状区明显低于非糖尿病鼠，这种降低可被剂量的曲格列酮抑制。相反，糖尿病鼠的纤维密度是增加的，大剂量的曲格列酮可以抑制纤维密度的增加。
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曲格列酮对实验末血清胰岛素和血糖浓度的影响 经实验证实糖尿病鼠的血清胰岛素水平低于非糖尿病鼠，前者的血糖水平高于后者。曲格列酮对胰岛素和血糖浓度没有影响。
讨 论
本研究显示曲格列酮与N乙酰半胱氨酸和己酮可可碱一样可抑制血清过氧化脂质浓度和神经过氧化脂质的含量，并可抑制TNF-α的过度产生，减缓糖尿病神经病变的发展。
本实验中用含曲格列酮的饲料喂养鼠的时间较长，曲格列酮的剂量高于人类临床剂量，但与以前报道的动物实验剂量相同。以前的实验中曲格列酮有效地降低胰岛素抵抗鼠和小鼠的血糖浓度。本实验中曲格列酮对非糖尿病鼠和糖尿病鼠的非空腹血糖和胰岛素没有作用，原因可能是STZ诱导的糖尿病鼠缺乏胰岛素而不是胰岛素抵抗。同样，曲格列酮不影响体重，非糖尿病鼠的体重增加，糖尿病鼠体重下降。糖尿病大剂量组消耗曲格列酮的量是非糖尿病大剂量组的2倍，可能由于糖尿病鼠多食所致。
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虽然曲格列酮对血胰岛素和血糖浓度没有影响，但它对糖尿病鼠的MNCV减慢有抑制作用。实验末的形态学分析也证实了曲格列酮可以改善糖尿病神经病变。与以前的报道一样，糖尿病鼠与非糖尿病鼠相比，神经纤维区、轴/髓比例和束状区下降，而神经纤维密度增加，经曲格列酮治疗后糖尿病鼠的这些异常得到控制。
曲格列酮抑制糖尿病神经病变的确切机制尚不清楚，最近的研究显示曲格列酮是很强的自由基清除剂，而自由基清除剂可以防止糖尿病鼠的周围神经病变。我们的结果也提示曲格列酮有清除自由基的作用，即曲格列酮可以减少糖尿病鼠血、神经中增多的过氧化脂质。此外，大、小剂量的曲格列酮亦能抑制TNF-α的过度生成。最近有文章报道PPAR-γ配体，包括曲格列酮，可以在体外抑制沸波醇酯等激活巨噬细胞生成TNF-α，但不能抑制LPS诱导巨噬细胞生成TNF-α。这些资料与我们的结果不一致，我们观察到曲格列酮可以抑制慢性高血糖状态下LPS诱导的TNF-α的过度生成。由于在鼠类尚不能使用敏感的测定方法如ELASA来测定TNF-α，我们在实验中用LPS刺激后测量血清TNF-α。在体内不论用不用LPS以外的其它刺激物，曲格列酮可能会更明显地抑制TNF-α的产生。
, 百拇医药
曲格列酮清除自由基及抑制TNF-α可减轻糖尿病神经病变，它可能是通过减轻自由基和/或TNF-α所致的微循环障碍而起作用。我们的结果显示尽管从实验初即给予曲格列酮，但MNCV的改善在实验的第12、16周才有明显的统计学意义可能与上述机制有关。这一点提示曲格列酮治疗可以影响神经病变的后期，即抑制神经病变的恶化而不是阻止其发生。
总之，曲格列酮可以抑制STZ诱导的糖尿病鼠的MNCV的减慢及周围神经的形态学变化，这一作用与血糖浓度无关。
Diabetologia,1998,41∶1321-1326
X.Qiang, J.Satoh, M.Sagara, M.Fukuzawa, T.Masuda, Y.Sakata, G.Muto, Y.Muto,K.Takahashi, T.Toyota(Third Department of Internal Medicine,Tohoku University School of Medicine,Aoba-ku,Sendai,Japan)
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