芯片-技术
作者：郝连杰(译)
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000302 按人类基因组计划在2003年以前破译出全部人类遗传信息，为了如此大量序列信息在医学上有可能应用，以及整理出尚未明确功能的基因，要求迅速而且可靠的分析个体基因组序列和细胞以及组织特异性基因表达模式的方法。从这一点看来，DNA芯片(chip)技术与DNA序列分析和聚合酶链反应相比较是一个进展，这进展使生物医学研究发生了根本性改变。
原 理
DNA芯片 DNA芯片-技术的原理是互补碱基配对为基础将特异性单链DNA或RNA分子杂交成双链。这原理很久以来已应用于Southern和Northern印迹试验。与传统的方法不同，传统的方法只能同时检测少数基因，而DNA芯片-技术可以同时分析上千个基因。在DNA芯片上，也称为微矩阵(Microarry)，高度密集排列着成千上万个特异性探针，即已知序列的单链DNA分子。这技术上的进展是利用非-渗透性-固相(例如玻璃载物片)，它可以尽量使用极微量的标本和杂交探针荧光检测，在高度密集和高效荧光素标记DNA或RNA的基础上合成寡核苷酸。现今可以在手指甲大小面积上排列上千个互补DNA片段(cDNA)或上万个寡核苷酸，从而可以平行分析一般基因表达模式和确定复杂的基因组多态性。
, 百拇医药
基因分析 人类基因组由DNA构成，编码约10万个不同的基因信息，在转录过程从基因组DNA转录成RNA转录子，通过剪接(splicing)加工成为信使RNA(mRNA)并配备上一多聚A尾部(Poly A Schwanz)。mRNA在翻译过程是合成相应蛋白的模板。要研究表达的基因可将mRNA连同其多聚A尾部分离出，用逆转录酶转化成cDNA，cDNA可以借助重组DNA技术在质粒内克隆化，在大肠杆菌内扩增，接着再作序列分析。克隆化cDNA-片段序列的末端所谓表达序列标志(expressed sequence tags，EST)是确定新基因的重要辅助工具。
DNA-微矩阵-分析的流程
图1简要地表示DNA芯片分析的流程，原则上可分为cDNA-矩阵和寡核苷酸-矩阵。cDNA-矩阵是在计算机控制下将容积约数毫微升的cDNA或ESTs高度密集地点样于固相上。在固相上用照相平板印刷技术(Photolithographische Technik)原位合成寡核苷酸-矩阵。每载物片的密集度目前cDNA矩阵可以达到数万个，寡核苷酸-矩阵的密集度可达数十万个标本样品。
, 百拇医药
DNA芯片分析典型的应用是比较从两个细胞群体分离出的mRNA，例如比较恶变与未恶变或病毒感染与无病毒感染细胞群。分离出的mRNA两组样品分别用红色和绿色荧光素标记核苷酸，逆转录成为cDNA，再与微矩阵cDNA-探针杂交。接着用激光扫描聚焦显微镜扫描结合荧光，荧光通过激光激发和发射将获得的信号传送给计算机分析。图1示检测流程的安排，两组组织基因表现为黄色，实验组织与参考组织基因比较，显示受诱导基因为红色，而受抑制基因显示绿色。这些信号最后可以在微矩阵上列出不同的cDNA序列，并可作定量评估。
图1 DNA芯片-技术的原理。cDNAs在计算机的控制下高度密集地点样于载物片上，从实验和参照细胞或组织分离出mRNA，逆转录转为cDNA，并荧光标记。二不同标记的cDNA与矩阵置放的cDNA探针杂交。所获得的荧光信号随即在共聚焦激光-显微镜下经激光激发，产生不同的激发和散发波长。最后将二信号重叠在一起，其结果在计算机支持下作出评价。在此所举的例子实验细胞过度表达基因显示红色，而受抑制基因显示绿色。
, 百拇医药
目前的应用
比较表达研究 DNA芯片-技术现今典型应用的例子是从基因组遗传水平作比较表达，或研究DNA-多态性或作突变分析。例如可以当细胞恶性变时，生长因子或细胞因子刺激后比较研究基因表达模式的改变，以及研究病毒感染后基因表达模式的改变等。例如在巨细胞病毒感染纤维母细胞后，发现258个细胞基因出现改变，其中124个为病毒感染所诱导，而134个基因受到抑制。通过这些不同的基因的研究可以从根本上认识病毒感染的致病机理和病毒的持续存在，最后开发出新的抗病毒药物。
多态性和突变 DNA芯片的另一应用是研究p53-肿瘤基因的各种突变，细胞色素P450的异构型和HIV序列。从而可以获得关于癌肿病人预后的信息和最佳治疗策略；药物可能出现的特殊反应；或从个体分离出的HIV对于抗逆转录病毒药物的敏感性等对临床上有意义的知识。
展 望
, 百拇医药 DNA芯片-技术现今仍然很昂贵，迄今仅能在少数研究中心和大公司进行，期望能进一步地开发全自动化DNA芯片-技术，逐步推广应用，才有可能使其巨大潜能变为现实。
随着DNA芯片-技术的开发，也带来一些复杂的伦理、法规和社会问题。从理论上看，数年后很可能根据少数体细胞认识一系列疾病，例如某些肿瘤、心血管疾病和阿尔茨海买默病等的基因高危因素，这些疾病是医疗的特殊问题，因为现今尚无有效的预防和治疗措施。因此有目的地引入和进一步开发这具有潜力的新技术仍有赖于基础研究、临床、工业和社会舆论人士持续和坦率的探讨。
Dtsch Med Wschr,1999，124(46)∶1395-1396
D.Moradpour， H.E.Blum(Medizinische Universitätsklinik Freiburg, GermanyDNA), 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000302 按人类基因组计划在2003年以前破译出全部人类遗传信息，为了如此大量序列信息在医学上有可能应用，以及整理出尚未明确功能的基因，要求迅速而且可靠的分析个体基因组序列和细胞以及组织特异性基因表达模式的方法。从这一点看来，DNA芯片(chip)技术与DNA序列分析和聚合酶链反应相比较是一个进展，这进展使生物医学研究发生了根本性改变。
原 理
DNA芯片 DNA芯片-技术的原理是互补碱基配对为基础将特异性单链DNA或RNA分子杂交成双链。这原理很久以来已应用于Southern和Northern印迹试验。与传统的方法不同，传统的方法只能同时检测少数基因，而DNA芯片-技术可以同时分析上千个基因。在DNA芯片上，也称为微矩阵(Microarry)，高度密集排列着成千上万个特异性探针，即已知序列的单链DNA分子。这技术上的进展是利用非-渗透性-固相(例如玻璃载物片)，它可以尽量使用极微量的标本和杂交探针荧光检测，在高度密集和高效荧光素标记DNA或RNA的基础上合成寡核苷酸。现今可以在手指甲大小面积上排列上千个互补DNA片段(cDNA)或上万个寡核苷酸，从而可以平行分析一般基因表达模式和确定复杂的基因组多态性。
, 百拇医药
基因分析 人类基因组由DNA构成，编码约10万个不同的基因信息，在转录过程从基因组DNA转录成RNA转录子，通过剪接(splicing)加工成为信使RNA(mRNA)并配备上一多聚A尾部(Poly A Schwanz)。mRNA在翻译过程是合成相应蛋白的模板。要研究表达的基因可将mRNA连同其多聚A尾部分离出，用逆转录酶转化成cDNA，cDNA可以借助重组DNA技术在质粒内克隆化，在大肠杆菌内扩增，接着再作序列分析。克隆化cDNA-片段序列的末端所谓表达序列标志(expressed sequence tags，EST)是确定新基因的重要辅助工具。
DNA-微矩阵-分析的流程
图1简要地表示DNA芯片分析的流程，原则上可分为cDNA-矩阵和寡核苷酸-矩阵。cDNA-矩阵是在计算机控制下将容积约数毫微升的cDNA或ESTs高度密集地点样于固相上。在固相上用照相平板印刷技术(Photolithographische Technik)原位合成寡核苷酸-矩阵。每载物片的密集度目前cDNA矩阵可以达到数万个，寡核苷酸-矩阵的密集度可达数十万个标本样品。
, 百拇医药
DNA芯片分析典型的应用是比较从两个细胞群体分离出的mRNA，例如比较恶变与未恶变或病毒感染与无病毒感染细胞群。分离出的mRNA两组样品分别用红色和绿色荧光素标记核苷酸，逆转录成为cDNA，再与微矩阵cDNA-探针杂交。接着用激光扫描聚焦显微镜扫描结合荧光，荧光通过激光激发和发射将获得的信号传送给计算机分析。图1示检测流程的安排，两组组织基因表现为黄色，实验组织与参考组织基因比较，显示受诱导基因为红色，而受抑制基因显示绿色。这些信号最后可以在微矩阵上列出不同的cDNA序列，并可作定量评估。
图1 DNA芯片-技术的原理。cDNAs在计算机的控制下高度密集地点样于载物片上，从实验和参照细胞或组织分离出mRNA，逆转录转为cDNA，并荧光标记。二不同标记的cDNA与矩阵置放的cDNA探针杂交。所获得的荧光信号随即在共聚焦激光-显微镜下经激光激发，产生不同的激发和散发波长。最后将二信号重叠在一起，其结果在计算机支持下作出评价。在此所举的例子实验细胞过度表达基因显示红色，而受抑制基因显示绿色。
, 百拇医药
目前的应用
比较表达研究 DNA芯片-技术现今典型应用的例子是从基因组遗传水平作比较表达，或研究DNA-多态性或作突变分析。例如可以当细胞恶性变时，生长因子或细胞因子刺激后比较研究基因表达模式的改变，以及研究病毒感染后基因表达模式的改变等。例如在巨细胞病毒感染纤维母细胞后，发现258个细胞基因出现改变，其中124个为病毒感染所诱导，而134个基因受到抑制。通过这些不同的基因的研究可以从根本上认识病毒感染的致病机理和病毒的持续存在，最后开发出新的抗病毒药物。
多态性和突变 DNA芯片的另一应用是研究p53-肿瘤基因的各种突变，细胞色素P450的异构型和HIV序列。从而可以获得关于癌肿病人预后的信息和最佳治疗策略；药物可能出现的特殊反应；或从个体分离出的HIV对于抗逆转录病毒药物的敏感性等对临床上有意义的知识。
展 望
, 百拇医药 DNA芯片-技术现今仍然很昂贵，迄今仅能在少数研究中心和大公司进行，期望能进一步地开发全自动化DNA芯片-技术，逐步推广应用，才有可能使其巨大潜能变为现实。
随着DNA芯片-技术的开发，也带来一些复杂的伦理、法规和社会问题。从理论上看，数年后很可能根据少数体细胞认识一系列疾病，例如某些肿瘤、心血管疾病和阿尔茨海买默病等的基因高危因素，这些疾病是医疗的特殊问题，因为现今尚无有效的预防和治疗措施。因此有目的地引入和进一步开发这具有潜力的新技术仍有赖于基础研究、临床、工业和社会舆论人士持续和坦率的探讨。
Dtsch Med Wschr,1999，124(46)∶1395-1396
D.Moradpour， H.E.Blum(Medizinische Universitätsklinik Freiburg, GermanyDNA), 百拇医药