基质金属蛋白酶及其组织抑制物预测葡萄胎恶变的研究
作者：李志英 向阳
单位：李志英(三峡大学医学院附属医院妇产科 宜昌 443001)向阳(中国医学科学院北京协和医院妇产科)
关键词：MMP基因；TIMP基因；RT-PCR；葡萄胎
实用医学进修杂志000305
摘 要 目的：探讨基质金属蛋白酶(MMP-9、MMP-2)及其组织抑制物(TIMP-1、TIMP-2)表达量与葡萄胎恶变的相关性。方法：提取组织总RNA，应用RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) 技术检测22例正常早期妊娠绒毛及34例葡萄胎组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2基因表达量。结果：MMP-9、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2在葡萄胎组织及正常绒毛组织中的表达量无明显差异(P>0.05)。但MMP-9/TIMP-1 比值在发生恶变的葡萄胎组织明显高于未发生恶变的葡萄胎组织及正常绒毛组织(P<0.01)；而MMP-2/TIMP-2在各组织中则无明显差异。结论：MMP-9/TIMP-1与葡萄胎恶变有关；MMP-9与TIMP-1表达量之比值可作为葡萄胎恶变的一项预测指标。
, 百拇医药
Prediction of Malignant Transformation of Hydatidiform
Mole by mRNA Determination of Matrix Metalloproteinases
and Tissue Inhibitor of Metalloproteinases
Li Zhiying Xiang Yang
(Affiliated Hospital of Sanxia University Medical College,Yichang 443001)
Abstract Objective:To investigate the relationship between the messenger RNA(mRNA) levels of matrix metalloproteinases(MMP-9,MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP-1,TIMP-2) and malignant transformation of hydatidiform mole. Methods:Total RNA were isolated from tissues of 22 normal chorionic villi samples and 34 cases of hydatidiform mole. The mRNA expression of MMP-9,MMP-2,TIMP-1,TIMP-2 genes were determined by RT-PCR.Results:The differences of the mRNA expression of MMP-9,MMP-2,TIMP-1,TIMP-2 genes in the tissues of hydatidiform mole and normal preganacy villus were not significant(P>0.05). The ratio of MMP-9/TIMP-1 in molar tissues with malignant transformation was higher than those in molar tissues without malignant transformation and in normal villus. Conclusion:It is a correlative relation between MMP-9/TIMP-1 and malignancy of hydatidiform mole. The ratio of MMP-9/TIMP-1 might be a useful index for prediction of malignant transformation of hydatidiform mole.
, 百拇医药
Key Words MMP genes；TIMP genes；RT-PCR；Hydatidiform mole
葡萄胎是胚胎外层的滋养细胞发生变性，绒毛水肿而形成的水泡状物，具有生长活跃及潜在恶性的特点，其中约20%将发展为侵蚀性葡萄胎或绒癌，这一恶变过程的前提是滋养细胞必须多次溶解血管内皮基底膜[1]。近年的研究发现，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs) 能降解基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原,促进肿瘤转移，而金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproeinase, TIMPs)与相应的MMP酶原及其活化形式结合，从而抑制MMP的活性及产生,为肿瘤发生恶变与转移的阻抑基因,TIMP-1与MMP-9 结合,TIMP-2与MMP-2结合。大量研究表明MMP-TIMP调节失衡在肿瘤恶变与转移过程中起决定性作用，而在滋养细胞肿瘤中的研究尚未见报道。
本研究通过检测正常早期妊娠绒毛及葡萄胎组织MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达，以揭示MMP/TIMP在葡萄胎恶变中的预测价值，为临床选择预防性化疗与否提供依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 对象
1.1.1 正常绒毛组 取自北京协和医院计划生育门诊1998年12月人工流产病人(<12孕周)，共22例，年龄22 ～ 42岁，平均(27±11)岁。均无异常妊娠疾病史。
1.1.2 葡萄胎患者组 所有病例均为北京协和医院1995年10月至1999年3月部分住院的葡萄胎患者，均经病理学检查确诊为葡萄胎，并有完整的临床病理资料，共34例。患者年龄20～53岁，平均(31±10)岁。该组34例患者中，有16例发生了恶性变，其诊断标准参照宋鸿钊教授所提出的侵蚀性葡萄胎诊断标准[2]。
1.2 方法
1.2.1 组织标本收集及处理 全部标本均在手术时收集，自宫腔吸出后，取所需组织约0.2g 左右,0.9%生理盐水洗净血液，立即置入液氮备用。
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1.2.2 组织总RNA的提取 用1 ml TRIZOL溶液(上海生物工程公司产品)将约0.1 g组织标本充分匀浆，加0.2 ml 氯仿抽提蛋白，转移上清液，加0.5 ml异戊醇沉淀RNA, 75%乙醇洗两次，溶于100μl DEPC水中。用分光光度计鉴定RNA样品。
1.2.3 逆转录(reverse transcription, RT) 模板RNA约为1 μg, 加入0.5 μg/μl寡聚胸腺嘧啶核苷酸[Oligo(dT)15]0.5μl；40U/μl RNA酶抑制剂(RNAsin)0.5μl(上海华美生物制品公司产品)；5× RT缓冲液4μl；0.1M DTT 1μl；200U/μl AMV逆转录酶1μl(美国GIBCO公司产品)；3.2μl dNTP( 2.5mmol/L) ；加DEPC水至终体积为20μl。反应条件：68℃ 5分钟、置于冰水混合物5分钟、42℃ 60分钟、95℃ 2分钟。逆转录产物置于4℃保存。
1.2.4 定量PCR(quantitative polymerase chain reaction) 所有引物均为北京赛百盛生物工程公司合成(序列见表1)，以β-actin为内参照，用PCR扩增各目的基因。反应体系为25μl：模板cDNA(RT产物)1μl；10×PCR缓冲液2.5μl(500 mM Tris.HCl pH 8.2, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl)；dNTP 0.4μl(终浓度400μM)；各引物均为1μl(终浓度0.6μM)；Taq DNA聚合酶1U (美国GIBCO公司产品)；加去离子水至总体积为25μl。起始变性95℃ 5分钟，然后执行如下反应条件：94℃变性30秒，按表1所示温度退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。
, 百拇医药
1.2.5 PCR产物电泳及定量分析 取PCR产物5μl，加6×上样缓冲液1μl，2%琼脂糖凝胶(美国Promega公司产品)电泳50V 60分钟(其中TIMP-2引物扩增产物需3%琼脂糖凝胶电泳50V 180分钟)。置于紫外透射成像系统(美国Bio-Rad公司)观察，电脑摄像储存，Molecular Analyst软件扫描分析，计算目的基因RT-PCR产物吸光度容积与β-actin基因RT-PCR产物吸光度容积之比值，作为目的基因mRNA的相对含量。
1.2.6 统计学分析 结果以
±s，两组间均数采用t检验，两组间率采用χ2检验(精确概率法)。
表1 PCR各引物序列、片段大小及最适退火温度 引物
序 列
, 百拇医药
扩增片段(bp)
退火温度(℃)
MMP-9
MMP-2
TIMP-1
TIMP-2
β-actin
正义
反义
正义
反义
正义
反义
, 百拇医药
正义
反义
正义
反义
5’GAGGTTCGACGTGAAGGCGCAGAGG3’
5’CATAGGGCACGAAGCCCACTTGGTC3’
5’ACCTGGATGCCGTCGTGGAC3’
5’TGTGGCAGCACCAGGGCAGC3’
5’ATCCTGTTGTTGCTGTGGCTG3’
5’GACTGGAAGCCCTTTTCAGA3’
, 百拇医药
5’TGCAGCTGCTCCCCGGTGCAC3’
5’TTATGGGTCCTCGATGTCGAG3’
5’ACACTGTGCCCATCTACGAGG3’
5’AGGGGCCGGACTCGTCATACT3’
200
447
520
590
621
68
69
, http://www.100md.com
59
63
-
2 结果
2.1 RNA样品鉴定
所提RNA浓度为0.5～2.0μg/μl，OD260 /OD280值在1.8～2.0之间。1%琼脂糖凝胶电泳可见28s、18s 和5s RNA条带清晰，表明RNA分子量完整，无降解。
2.2 RT-PCR产物定性表达
利用设定的引物经RT-PCR, 并与PCR标准分子量进行比较，所出现的条带与内参照及目的基因片段大小一致。以目的基因与β-actin基因均表达者为阳性，仅β-actin基因表达而目的基因无表达者为阴性。可见MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2在所有葡萄胎组织中均有表达，在早孕绒毛组织中MMP-9有4例表达阴性，阳性率为82%(18/22)，TIMP-1阳性表达率为 91%(20/22)，而MMP-2和TIMP-2在早孕绒毛组织中均有表达。
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2.3 RT-PCR产物定量分析
MMP-9、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2在正常早孕绒毛组、未发生恶变的葡萄胎组、发生恶变的葡萄胎组之间的表达量无明显差异(P>0.05)。MMP-9/TIMP-1比值在发生恶变的葡萄胎组明显高于未发生恶变的葡萄胎组及正常绒毛组(t=3.8179 P=0.0006，t=3.1897 P=0.0029)；而MMP-2/TIMP-2 的值在各组之间无明显差异(P>0.05)。在发生恶变的16例葡萄胎组织中有15例MMP-9/TIMP-1比值>1,而在未发生恶变的18例葡萄胎组织仅有7例MMP-9/TIMP-1比值>1。比值大于1的机率分别占93.8%(15/16)和38.8%(7/18)。具有显著性差异( P=0.0011 ) (表2)。
表2 正常妊娠绒毛及葡萄胎组织MMPs和TIMPs表达量比较 组 别
例数
, 百拇医药
mRNA相对含量(±s)
MMP-9
TIMP-1
MMP-2
TIMP-2
MMP-9/TIMP-1
MMP-2/TIMP-2
正常早孕绒毛
葡萄胎组织未恶变组
葡萄胎组织恶变组
22
, http://www.100md.com
18
16
0.40±0.38
0.49±0.46
0.54±0.53
0.49±0.32
0.59±0.41
0.41±0.39
2.56±2.2
2.44±0.74
2.52±0.42
1.07±0.35
, 百拇医药
1.13±0.49
1.19±0.50
0.92±0.57
0.91±0.39
1.48±0.48
2.41±1.92
2.56±1.35
2.43±0.98
3 讨论
正常妊娠的维持是胚胎与母体之间协同作用极其复杂的过程，正常早孕绒毛滋养细胞亦具有类似于恶性肿瘤细胞的特点，能大量分泌MMP-2和MMP-9,从而选择性水解子宫内膜基质成分及一系列基底膜 ；而蜕膜细胞可同时产生转移生长因子β(TGFβ),从而诱导滋养层及蜕膜细胞产生TIMPs，抑制MMPs的产生，使得MMP-TIMP维持一定范围的动态平衡，使绒毛滋养细胞入侵母体受到一定限制[3]。
, 百拇医药
葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌是发生在生育期妇女常见的滋养细胞肿瘤。几乎所有的侵蚀性葡萄胎和50%的绒癌都是由葡萄胎恶变而来。目前对葡萄胎恶变的预测主要是根据临床特点，如年龄、hCG值、子宫大小和病理检查等。但由于准确性不高，因而影响到对预防性化疗的评价。研究表明，滋养细胞肿瘤具有很强的亲血管性生物学特点，易于经血运转移。葡萄胎转变为侵蚀性葡萄胎，进而转变为绒癌的过程中，必须多次溶解血管内皮基底膜。故MMPs、TIMPs可能从分子水平客观地评价葡萄胎恶变的可能性。
本研究结果显示在葡萄胎组织与早孕正常绒毛组织中MMPs，TIMPs mRNA表达的单项检测在定性与定量方面无明显差异。其可能原因为葡萄胎变性滋养细胞在很大程度上与早孕绒毛滋养细胞具有相似的特点，对子宫内膜基质成分和基底膜的侵蚀程度具有相似性。从而其分泌的MMPs，TIMPs可能无明显差异。但由于葡萄胎滋养细胞变性增生，具有潜在恶性的特点，通过本研究发现，MMPs 、TIMPs mRNA表达量在不同组织的微小差别可导致MMP-TIMP比值失衡,特别是MMP-9/TIMP-1在葡萄胎组织的增高将预示具有恶变之倾向。
, 百拇医药
实验结果表明，MMP-9 mRNA表达量在发生恶变的葡萄胎组织略高于未发生恶变的葡萄胎组织及正常绒毛组织，但无显著性差异。而TIMP-1在发生恶变的葡萄胎组织则有所降低，这样使得MMP-9相对增加，导致MMP-9与TIMP-1失去平衡，MMP-9相对于TIMP-1表达过量。而MMP-2 、TIMP-2在各组织中则无明显变化。MMP-9是分子量为95kD的蛋白明胶酶，主要由滋养细胞、癌细胞、巨噬细胞等分泌，其作用底物主要为Ⅳ型胶原[4]。而子宫内膜基质及血管基底膜的主要成分为Ⅳ型胶原，推测MMP-9在滋养细胞的侵蚀过程中起重要作用。TIMP-1是分子量为28.5kD的糖蛋白,可与MMP-9的酶原及活化形式形成1∶1复合体而作为肿瘤恶变与转移的阻抑基因[4]。因此，TIMP-1相对不足、MMP-9相对增加导致MMP-TIMP失衡(MMP-9/TIMP-1>1)可被认为是葡萄胎滋养细胞发生恶变、出现转移的重要因素。MMP-2、TIMP-2基因mRNA表达量及二者之比值在本实验研究中无明显变化，可以推测MMP-2、TIMP-2基因可能与滋养细胞浸润的关系不大。有报道MMP-2主要与妊娠中晚期的胎盘血管网形成有关，而TIMP-2在整个妊娠过程中无明显变化[5]。
, 百拇医药
从本研究的结果我们可以认为，MMP-9/TIMP-1比值在葡萄胎组织的增高与葡萄胎恶变存在相关关系，在葡萄胎恶变中具有预测价值，可作为判断葡萄胎预后的一项可靠参考指标。
致谢：感谢中国医学科学院基础医学研究所遗传室刘国仰教授、高春生和刘歌老师对本课题的技术协助。
参考文献
1，向阳，杨秀玉. 妊娠滋养细胞疾病的诊治进展[J]. 中华妇产科杂志,1998；33：441
2，宋鸿钊. 滋养细胞肿瘤的诊断和治疗[M]. 北京：人民卫生出版社，1981：124～129
3，Lala PK, Graham CH. Mechanisms of trophblast invasiveness and their control : the role of proteases and protease inhibitors[J]. Cancer Metastasis Rev, 1990； 9:369
, 百拇医药
4，Ray JM, Stetler-stevenson WG. The role of matrix metalloproteases and their inhibitor in tumour invasion, metastasis and angiogenecsis[J]. Eur Respir, 1994；7:2062
5，Fernandez PL, Merino MJ, Nogales FF, et al. Immunohistochemical profile of basement membrane proteins and 72 kilodalton type Ⅳ collagenase in the implantation placental site[J]. Lab invest,1992；66: 572
(2000-05-19 收稿), http://www.100md.com
单位：李志英(三峡大学医学院附属医院妇产科 宜昌 443001)向阳(中国医学科学院北京协和医院妇产科)
关键词：MMP基因；TIMP基因；RT-PCR；葡萄胎
实用医学进修杂志000305
摘 要 目的：探讨基质金属蛋白酶(MMP-9、MMP-2)及其组织抑制物(TIMP-1、TIMP-2)表达量与葡萄胎恶变的相关性。方法：提取组织总RNA，应用RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) 技术检测22例正常早期妊娠绒毛及34例葡萄胎组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2基因表达量。结果：MMP-9、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2在葡萄胎组织及正常绒毛组织中的表达量无明显差异(P>0.05)。但MMP-9/TIMP-1 比值在发生恶变的葡萄胎组织明显高于未发生恶变的葡萄胎组织及正常绒毛组织(P<0.01)；而MMP-2/TIMP-2在各组织中则无明显差异。结论：MMP-9/TIMP-1与葡萄胎恶变有关；MMP-9与TIMP-1表达量之比值可作为葡萄胎恶变的一项预测指标。
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Prediction of Malignant Transformation of Hydatidiform
Mole by mRNA Determination of Matrix Metalloproteinases
and Tissue Inhibitor of Metalloproteinases
Li Zhiying Xiang Yang
(Affiliated Hospital of Sanxia University Medical College,Yichang 443001)
Abstract Objective:To investigate the relationship between the messenger RNA(mRNA) levels of matrix metalloproteinases(MMP-9,MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP-1,TIMP-2) and malignant transformation of hydatidiform mole. Methods:Total RNA were isolated from tissues of 22 normal chorionic villi samples and 34 cases of hydatidiform mole. The mRNA expression of MMP-9,MMP-2,TIMP-1,TIMP-2 genes were determined by RT-PCR.Results:The differences of the mRNA expression of MMP-9,MMP-2,TIMP-1,TIMP-2 genes in the tissues of hydatidiform mole and normal preganacy villus were not significant(P>0.05). The ratio of MMP-9/TIMP-1 in molar tissues with malignant transformation was higher than those in molar tissues without malignant transformation and in normal villus. Conclusion:It is a correlative relation between MMP-9/TIMP-1 and malignancy of hydatidiform mole. The ratio of MMP-9/TIMP-1 might be a useful index for prediction of malignant transformation of hydatidiform mole.
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Key Words MMP genes；TIMP genes；RT-PCR；Hydatidiform mole
葡萄胎是胚胎外层的滋养细胞发生变性，绒毛水肿而形成的水泡状物，具有生长活跃及潜在恶性的特点，其中约20%将发展为侵蚀性葡萄胎或绒癌，这一恶变过程的前提是滋养细胞必须多次溶解血管内皮基底膜[1]。近年的研究发现，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs) 能降解基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原,促进肿瘤转移，而金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproeinase, TIMPs)与相应的MMP酶原及其活化形式结合，从而抑制MMP的活性及产生,为肿瘤发生恶变与转移的阻抑基因,TIMP-1与MMP-9 结合,TIMP-2与MMP-2结合。大量研究表明MMP-TIMP调节失衡在肿瘤恶变与转移过程中起决定性作用，而在滋养细胞肿瘤中的研究尚未见报道。
本研究通过检测正常早期妊娠绒毛及葡萄胎组织MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达，以揭示MMP/TIMP在葡萄胎恶变中的预测价值，为临床选择预防性化疗与否提供依据。
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1 材料与方法
1.1 对象
1.1.1 正常绒毛组 取自北京协和医院计划生育门诊1998年12月人工流产病人(<12孕周)，共22例，年龄22 ～ 42岁，平均(27±11)岁。均无异常妊娠疾病史。
1.1.2 葡萄胎患者组 所有病例均为北京协和医院1995年10月至1999年3月部分住院的葡萄胎患者，均经病理学检查确诊为葡萄胎，并有完整的临床病理资料，共34例。患者年龄20～53岁，平均(31±10)岁。该组34例患者中，有16例发生了恶性变，其诊断标准参照宋鸿钊教授所提出的侵蚀性葡萄胎诊断标准[2]。
1.2 方法
1.2.1 组织标本收集及处理 全部标本均在手术时收集，自宫腔吸出后，取所需组织约0.2g 左右,0.9%生理盐水洗净血液，立即置入液氮备用。
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1.2.2 组织总RNA的提取 用1 ml TRIZOL溶液(上海生物工程公司产品)将约0.1 g组织标本充分匀浆，加0.2 ml 氯仿抽提蛋白，转移上清液，加0.5 ml异戊醇沉淀RNA, 75%乙醇洗两次，溶于100μl DEPC水中。用分光光度计鉴定RNA样品。
1.2.3 逆转录(reverse transcription, RT) 模板RNA约为1 μg, 加入0.5 μg/μl寡聚胸腺嘧啶核苷酸[Oligo(dT)15]0.5μl；40U/μl RNA酶抑制剂(RNAsin)0.5μl(上海华美生物制品公司产品)；5× RT缓冲液4μl；0.1M DTT 1μl；200U/μl AMV逆转录酶1μl(美国GIBCO公司产品)；3.2μl dNTP( 2.5mmol/L) ；加DEPC水至终体积为20μl。反应条件：68℃ 5分钟、置于冰水混合物5分钟、42℃ 60分钟、95℃ 2分钟。逆转录产物置于4℃保存。
1.2.4 定量PCR(quantitative polymerase chain reaction) 所有引物均为北京赛百盛生物工程公司合成(序列见表1)，以β-actin为内参照，用PCR扩增各目的基因。反应体系为25μl：模板cDNA(RT产物)1μl；10×PCR缓冲液2.5μl(500 mM Tris.HCl pH 8.2, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl)；dNTP 0.4μl(终浓度400μM)；各引物均为1μl(终浓度0.6μM)；Taq DNA聚合酶1U (美国GIBCO公司产品)；加去离子水至总体积为25μl。起始变性95℃ 5分钟，然后执行如下反应条件：94℃变性30秒，按表1所示温度退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。
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1.2.5 PCR产物电泳及定量分析 取PCR产物5μl，加6×上样缓冲液1μl，2%琼脂糖凝胶(美国Promega公司产品)电泳50V 60分钟(其中TIMP-2引物扩增产物需3%琼脂糖凝胶电泳50V 180分钟)。置于紫外透射成像系统(美国Bio-Rad公司)观察，电脑摄像储存，Molecular Analyst软件扫描分析，计算目的基因RT-PCR产物吸光度容积与β-actin基因RT-PCR产物吸光度容积之比值，作为目的基因mRNA的相对含量。
1.2.6 统计学分析 结果以
±s，两组间均数采用t检验，两组间率采用χ2检验(精确概率法)。表1 PCR各引物序列、片段大小及最适退火温度 引物
序 列
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扩增片段(bp)
退火温度(℃)
MMP-9
MMP-2
TIMP-1
TIMP-2
β-actin
正义
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正义
反义
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5’CATAGGGCACGAAGCCCACTTGGTC3’
5’ACCTGGATGCCGTCGTGGAC3’
5’TGTGGCAGCACCAGGGCAGC3’
5’ATCCTGTTGTTGCTGTGGCTG3’
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5’TTATGGGTCCTCGATGTCGAG3’
5’ACACTGTGCCCATCTACGAGG3’
5’AGGGGCCGGACTCGTCATACT3’
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2 结果
2.1 RNA样品鉴定
所提RNA浓度为0.5～2.0μg/μl，OD260 /OD280值在1.8～2.0之间。1%琼脂糖凝胶电泳可见28s、18s 和5s RNA条带清晰，表明RNA分子量完整，无降解。
2.2 RT-PCR产物定性表达
利用设定的引物经RT-PCR, 并与PCR标准分子量进行比较，所出现的条带与内参照及目的基因片段大小一致。以目的基因与β-actin基因均表达者为阳性，仅β-actin基因表达而目的基因无表达者为阴性。可见MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2在所有葡萄胎组织中均有表达，在早孕绒毛组织中MMP-9有4例表达阴性，阳性率为82%(18/22)，TIMP-1阳性表达率为 91%(20/22)，而MMP-2和TIMP-2在早孕绒毛组织中均有表达。
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2.3 RT-PCR产物定量分析
MMP-9、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2在正常早孕绒毛组、未发生恶变的葡萄胎组、发生恶变的葡萄胎组之间的表达量无明显差异(P>0.05)。MMP-9/TIMP-1比值在发生恶变的葡萄胎组明显高于未发生恶变的葡萄胎组及正常绒毛组(t=3.8179 P=0.0006，t=3.1897 P=0.0029)；而MMP-2/TIMP-2 的值在各组之间无明显差异(P>0.05)。在发生恶变的16例葡萄胎组织中有15例MMP-9/TIMP-1比值>1,而在未发生恶变的18例葡萄胎组织仅有7例MMP-9/TIMP-1比值>1。比值大于1的机率分别占93.8%(15/16)和38.8%(7/18)。具有显著性差异( P=0.0011 ) (表2)。
表2 正常妊娠绒毛及葡萄胎组织MMPs和TIMPs表达量比较 组 别
例数
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mRNA相对含量(
±s)MMP-9
TIMP-1
MMP-2
TIMP-2
MMP-9/TIMP-1
MMP-2/TIMP-2
正常早孕绒毛
葡萄胎组织未恶变组
葡萄胎组织恶变组
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0.49±0.46
0.54±0.53
0.49±0.32
0.59±0.41
0.41±0.39
2.56±2.2
2.44±0.74
2.52±0.42
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1.19±0.50
0.92±0.57
0.91±0.39
1.48±0.48
2.41±1.92
2.56±1.35
2.43±0.98
3 讨论
正常妊娠的维持是胚胎与母体之间协同作用极其复杂的过程，正常早孕绒毛滋养细胞亦具有类似于恶性肿瘤细胞的特点，能大量分泌MMP-2和MMP-9,从而选择性水解子宫内膜基质成分及一系列基底膜 ；而蜕膜细胞可同时产生转移生长因子β(TGFβ),从而诱导滋养层及蜕膜细胞产生TIMPs，抑制MMPs的产生，使得MMP-TIMP维持一定范围的动态平衡，使绒毛滋养细胞入侵母体受到一定限制[3]。
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葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌是发生在生育期妇女常见的滋养细胞肿瘤。几乎所有的侵蚀性葡萄胎和50%的绒癌都是由葡萄胎恶变而来。目前对葡萄胎恶变的预测主要是根据临床特点，如年龄、hCG值、子宫大小和病理检查等。但由于准确性不高，因而影响到对预防性化疗的评价。研究表明，滋养细胞肿瘤具有很强的亲血管性生物学特点，易于经血运转移。葡萄胎转变为侵蚀性葡萄胎，进而转变为绒癌的过程中，必须多次溶解血管内皮基底膜。故MMPs、TIMPs可能从分子水平客观地评价葡萄胎恶变的可能性。
本研究结果显示在葡萄胎组织与早孕正常绒毛组织中MMPs，TIMPs mRNA表达的单项检测在定性与定量方面无明显差异。其可能原因为葡萄胎变性滋养细胞在很大程度上与早孕绒毛滋养细胞具有相似的特点，对子宫内膜基质成分和基底膜的侵蚀程度具有相似性。从而其分泌的MMPs，TIMPs可能无明显差异。但由于葡萄胎滋养细胞变性增生，具有潜在恶性的特点，通过本研究发现，MMPs 、TIMPs mRNA表达量在不同组织的微小差别可导致MMP-TIMP比值失衡,特别是MMP-9/TIMP-1在葡萄胎组织的增高将预示具有恶变之倾向。
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实验结果表明，MMP-9 mRNA表达量在发生恶变的葡萄胎组织略高于未发生恶变的葡萄胎组织及正常绒毛组织，但无显著性差异。而TIMP-1在发生恶变的葡萄胎组织则有所降低，这样使得MMP-9相对增加，导致MMP-9与TIMP-1失去平衡，MMP-9相对于TIMP-1表达过量。而MMP-2 、TIMP-2在各组织中则无明显变化。MMP-9是分子量为95kD的蛋白明胶酶，主要由滋养细胞、癌细胞、巨噬细胞等分泌，其作用底物主要为Ⅳ型胶原[4]。而子宫内膜基质及血管基底膜的主要成分为Ⅳ型胶原，推测MMP-9在滋养细胞的侵蚀过程中起重要作用。TIMP-1是分子量为28.5kD的糖蛋白,可与MMP-9的酶原及活化形式形成1∶1复合体而作为肿瘤恶变与转移的阻抑基因[4]。因此，TIMP-1相对不足、MMP-9相对增加导致MMP-TIMP失衡(MMP-9/TIMP-1>1)可被认为是葡萄胎滋养细胞发生恶变、出现转移的重要因素。MMP-2、TIMP-2基因mRNA表达量及二者之比值在本实验研究中无明显变化，可以推测MMP-2、TIMP-2基因可能与滋养细胞浸润的关系不大。有报道MMP-2主要与妊娠中晚期的胎盘血管网形成有关，而TIMP-2在整个妊娠过程中无明显变化[5]。
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从本研究的结果我们可以认为，MMP-9/TIMP-1比值在葡萄胎组织的增高与葡萄胎恶变存在相关关系，在葡萄胎恶变中具有预测价值，可作为判断葡萄胎预后的一项可靠参考指标。
致谢：感谢中国医学科学院基础医学研究所遗传室刘国仰教授、高春生和刘歌老师对本课题的技术协助。
参考文献
1，向阳，杨秀玉. 妊娠滋养细胞疾病的诊治进展[J]. 中华妇产科杂志,1998；33：441
2，宋鸿钊. 滋养细胞肿瘤的诊断和治疗[M]. 北京：人民卫生出版社，1981：124～129
3，Lala PK, Graham CH. Mechanisms of trophblast invasiveness and their control : the role of proteases and protease inhibitors[J]. Cancer Metastasis Rev, 1990； 9:369
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4，Ray JM, Stetler-stevenson WG. The role of matrix metalloproteases and their inhibitor in tumour invasion, metastasis and angiogenecsis[J]. Eur Respir, 1994；7:2062
5，Fernandez PL, Merino MJ, Nogales FF, et al. Immunohistochemical profile of basement membrane proteins and 72 kilodalton type Ⅳ collagenase in the implantation placental site[J]. Lab invest,1992；66: 572
(2000-05-19 收稿), http://www.100md.com