糖尿病大鼠低密度脂蛋白糖化率与动脉壁胶原含量变化的关系
作者：祝继华 邱大为 肖勤 余路 邱鸿鑫
单位：祝继华 邱大为 肖勤(重庆医科大学附一医院检验科 400016)；(重庆医科大学附一医院内科)
关键词：糖化低密度脂蛋白；胶原；动脉粥样硬化
重庆医学000310 摘 要 为探讨糖尿病大鼠低密度脂蛋白糖化率与动脉壁胶原含量变化的关系，将糖尿病大鼠并分为糖尿病组(DM)，糖尿病氨基胍治疗组(AG)和对照组(C)。测定血糖(BG)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LCL)、糖化低密度脂蛋白(G-LDL)及其糖化率(K)、糖化血红蛋白(HbAlc)、动脉壁Ⅳ型胶原(CIV)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)。DM组和AG组的BG水平高于C组(P<0.01)，但各组间的TG、TC和LDL水平无差异。DM组和AG组的HbAlc、和K值显著高于C组(P<0.01)。DM组的动脉壁CIV和PCⅢ含量高于AG组和C组(P<0.01)；K值与CIV和PCⅢ含量呈正相关，(r分别为0.806和0.851，P<0.01)。实验结果提示G-LDL参与动脉壁的早期脂质沉积和胶原增加，是糖尿病动脉粥样硬化病变的重要促进因素之一。
, 百拇医药
The Relationship between LDL Glycation Rate and Collagencontent Changes of Arterial Wall in Diabetic Rats
Department of Clinical Laboratories, College of Clinical Medicine
Abstract Objective:To investingate the relationship between LDL glycation rate and collagen content changes of arterial wall in diabetic rats. Methods: Diabetic rats were divided into 2 groups: diabetic rats (DM) and diabetic rats treated with amino-guanidine (AG) and a group of normal rats served as control (c). Blood glucose (BG), triglyceride (TG), cholesterol (TC), low density lipoprotein (LDL), glycated LDL (G-LDL) and its glycation rate (K), glycated hemoglobin (HbAlc), arterial wall collagen IV (CIV) and precollagen Ⅲ(PCⅢ) were determined. Results: Bolld glucose in DM group and AG group was much higher than in C group (P<0.01), but there was no significant differences of TG, TC, and LDL levels in each group. HbAlc and K values were much higher in DM group and AG group than in C group (P<0.01). CIV and PCⅢ content was much higher in DM group than in AG group and group (P<0.01). There was positive correlation between K value and Contents of CIV and PCⅢ in arterial wall (r=0.806 and 0.851) respectively, (P<0.01). Conclution: G-LDL may contribute to the early lipid deposition and collagen in the arterial wall, and may be one of the important factors in promoting the atherogenic changes in diabetic rats.
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Key word:Glycated LDL Collagen Atherosclerosis
糖尿病持续高血糖可引起体内多种蛋白质的非酶促糖化反应，导致蛋白质结构和功能异常，在糖尿病血管并发症的发生发展中起重要作用。近年研究表明低密度脂蛋白(LDL)的糖化与糖尿病动脉粥样硬化的形成及其血管并发症的发生密切相关。本文以链脲酶素(STZ)诱发糖尿病大鼠为模型，观察糖化LDL(G-LDL)及其糖化率和动脉壁细胞外基质胶原的变化，并探讨其相互关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wiistar大鼠45只，体重220～250g，雄性，由重庆医科大学实验动物中心提供。随机分为3组。糖尿病(GM)、糖尿病氨基胍治疗组(AG)和对照组(C)。DM和AG组腹腔注射STZ65mg/kg。诱发糖尿病模型：C组给予等体积的生理盐水。DM组和C组正常饲养，AG组每日于饮水中加入氨基胍1g/L。实验过程中死亡6只，均DM组和AG组。死亡原因为感染，严重代谢紊乱等。饲养4个月后处死，取血浆作血糖，血脂和糖化血红蛋白(HbAlc)测定。取主动脉作胶原含量检测。
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1.2 血糖和血脂测定 血浆葡萄糖(BG)测定采用氧化酶法，试剂盒为东欧公司产品。血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)测定采用酶法，试剂盒由北京中生公司提供。
1.3 HbAlc测定 采用亲和层析法。
1.4 糖化LDL及其糖化率测定：按文献[2]方法。糖化率(K)计算式为K=G-LDL/LDL-ch
1.5 动脉壁Ⅳ型胶原(CIV)Ⅲ型前胶原(PCⅢ)含量的检测 实验大鼠处死后分离出主动脉，除去外层脂肪。加入0.05mol/L Tris-HCL制备匀浆。离心弃上清液，加入0.5mol/L醋酸溶液含1mg/ml胃蛋白酶，4℃提取18小时。加入0.05mol/L Tris-HCL pH7.4终止反应。离心取上清液待测。CIV和PCⅢ测定采用放射免疫法，试剂盒由海军医学研究所提供。蛋白质含量测定采用Lowry法。
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2 结果
2.1 各组血糖和血脂水平：结果见表1。DM组和AG组的血糖水平均高于C组(P)。DM组、AG组和C组间的TG、TC和LDL水平差异无显著性意义(P>0.05)。
表1 各组血糖和血脂水平比较 (
±S) 分组
n
BG
mmol/L
TG
mmol/L
TC
mmol/L
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LDL
mmol/L
DM
11
21.71±2.48*
0.92±0.30
1.47±0.33
438.9±121.7
AG
13
18.77±1.94*
0.79±0.57
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1.33±0.13
466.6±130.2
C
15
4.11±0.78
0.69±0.25
1.35±0.25
461.4±155.9
注：P<0.05
2.2 各组HbAlc、G-LDL及K值测定 结果见表2。DM组和AG组的HbAlc、G-LDL和K值均显著高于AG组(P<0.01)。DM组HbAlc、G-LDL和K值虽高于AG组，但其差异未达到统计学意义。
, 百拇医药
表2 60例双侧睾丸容积表 分组
n
HbAlc
%
G-LDL
μmol/L
K
DM
11
13.53±1.84*
810.24±110.5*
1.96±0.21*
, 百拇医药
AG
13
11.07±1.70*
710.29±98.60*
1.78±0.18*
C
15
4.68±0.62
314.52±68.42
0.66±0.13
注：与C组比较，P<0.01
, 百拇医药
2.3 各组CIV和PCⅢ含量测定 结果见表3。DM组的CIV和PCⅢ含量高于AG组和C组；AG组和C组的CIV和PCⅢ含量差异无显著性意义。
表3 各组动态壁CIV和PCⅢ含量的比较 (±S) 分组
n
CIV
μg/g
PCⅢ
μg/g
DM
11
45.46±5.77*※
, 百拇医药
33.99±4.96*※
AG
13
22.38±2.00
18.82±2.08
C
15
22.82±1.93
16.61±2.52
注：*与C组比较 *P<0.01 ※与AG组比较 ※P<0.01
2.4 糖化率K与动脉壁CIV与PCⅢ含量变化的关系 糖化率K值与动脉壁CIV和PCⅢ含量呈正相关，相关系统分别为0.806与0.851，P<0.01。
, 百拇医药
3 讨论
大鼠是成功制作糖尿病的动物模型，但不是动脉粥样硬化的理想模型，饲以致动脉粥样硬化的膳食常不易引起血脂的明显改变，但这有利于观察除去高血脂外其他因素对动脉粥样硬化发生的机制和作用。在本实验中糖尿病大鼠的血浆葡萄糖水平显著增高，血浆TG、TC和LDL水平变化不明显，而HbAlc、G-LDL和糖化率K值显著升高。表明脂蛋白糖化作用比血脂蛋白量的变化更为重要，是在血脂不增高的情况下引起动脉壁脂质沉积的重要因素之一。表2中DM组和AG组结果相差不显著，其原因是由于HbAlc、G-LDL是非糖化的早期产物，AG对它们无作用。本文结果与Yegin等的结果相一致[3]。LDL在体内主要由细胞膜上的LDL受体识别并清除。在高血糖作用下，LDL发生糖化，反映LDL中的ApoB赖氨酸残基的N端与葡萄糖共价结合生成G-LDL。G-LDL不能被LDL受体识别和清除，而由巨噬细胞摄取后导致胆固醇积聚，形成泡沫细胞，并分泌一系列细胞因子，促进血管内皮损伤和细胞外基质增生[5]。此外，在LDL等蛋白质糖化过程中产生自由基，导致LDL的氧化修饰生成OX-LDL。OX-LDL具有较强的细胞毒性和致动脉粥样硬化作用。G-LDL和OX-LDL有协同效应，共同促进血管壁的硬化病变[6]。
, 百拇医药
动脉粥样硬化的重要病理特征是细胞外基质的增加。在动脉壁，主要的细胞外基质成分为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原。在本研究中，DM组的动脉壁CIV和PCⅢ含量高于AG组和C组，表明在DM时，高脂血症前已有细胞外基质胶原增生和硬化的早期病变。而AG组与C组则相差不显著。其原因可能是糖化终末产物(AGE)是能与CIV和PCⅢ作用形成交联的稳定结构，但AG能阻止AGE的生成从而使这种交联不能形成，细胞基质不增加，而致CIV和PC结果不增加。LDL糖化率与动脉壁CIV和PCⅢ呈正相关提示G-LDL参与血管壁的脂质早期沉积和促进胶原的增生。细胞外基质胶原的增生一方面引起血管壁增厚、硬化，另一方面促进脂质沉积和血栓形成趋势增强，从而促进糖尿病动脉粥样硬化的形成[7]。
参考文献
1，Brownlee M.Glycation products and the pathogenesis of diabetic complications. Diabetes Care，1992,15(12):1835～1842
, http://www.100md.com
2，吴丽娟，魏明竟，杨静等.糖尿病患者血清糖化LDL和LDL糖化率的测定及其初步临床应用.中华内分泌代谢杂志，1995，12(2)：84～86
3，Yegin A, Ozben T, Yegin H. Glycation of lipoproteins and accelerated atherosclerosis in non-insulin-dependent diabtes meilitus. Int J Clin Lab Res, 1995,25(3):157～161
4，Brownlee M. Glycation and diabetic complications. Diabetes, 1994,43:836～841
5，Sobernin IA, Tertov VY, Orekhov AN. Atherogenic modified LDL in diabetes. Diabetes, 1996,45(suppl.3):S35～S39
6，Colaco CA, Roser BJ. Atherosclerosis and glycation. Bioassays ，1994,16(2):154～157
7，Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature，1993, 362:801～809, http://www.100md.com
单位：祝继华 邱大为 肖勤(重庆医科大学附一医院检验科 400016)；(重庆医科大学附一医院内科)
关键词：糖化低密度脂蛋白；胶原；动脉粥样硬化
重庆医学000310 摘 要 为探讨糖尿病大鼠低密度脂蛋白糖化率与动脉壁胶原含量变化的关系，将糖尿病大鼠并分为糖尿病组(DM)，糖尿病氨基胍治疗组(AG)和对照组(C)。测定血糖(BG)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LCL)、糖化低密度脂蛋白(G-LDL)及其糖化率(K)、糖化血红蛋白(HbAlc)、动脉壁Ⅳ型胶原(CIV)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)。DM组和AG组的BG水平高于C组(P<0.01)，但各组间的TG、TC和LDL水平无差异。DM组和AG组的HbAlc、和K值显著高于C组(P<0.01)。DM组的动脉壁CIV和PCⅢ含量高于AG组和C组(P<0.01)；K值与CIV和PCⅢ含量呈正相关，(r分别为0.806和0.851，P<0.01)。实验结果提示G-LDL参与动脉壁的早期脂质沉积和胶原增加，是糖尿病动脉粥样硬化病变的重要促进因素之一。
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The Relationship between LDL Glycation Rate and Collagencontent Changes of Arterial Wall in Diabetic Rats
Department of Clinical Laboratories, College of Clinical Medicine
Abstract Objective:To investingate the relationship between LDL glycation rate and collagen content changes of arterial wall in diabetic rats. Methods: Diabetic rats were divided into 2 groups: diabetic rats (DM) and diabetic rats treated with amino-guanidine (AG) and a group of normal rats served as control (c). Blood glucose (BG), triglyceride (TG), cholesterol (TC), low density lipoprotein (LDL), glycated LDL (G-LDL) and its glycation rate (K), glycated hemoglobin (HbAlc), arterial wall collagen IV (CIV) and precollagen Ⅲ(PCⅢ) were determined. Results: Bolld glucose in DM group and AG group was much higher than in C group (P<0.01), but there was no significant differences of TG, TC, and LDL levels in each group. HbAlc and K values were much higher in DM group and AG group than in C group (P<0.01). CIV and PCⅢ content was much higher in DM group than in AG group and group (P<0.01). There was positive correlation between K value and Contents of CIV and PCⅢ in arterial wall (r=0.806 and 0.851) respectively, (P<0.01). Conclution: G-LDL may contribute to the early lipid deposition and collagen in the arterial wall, and may be one of the important factors in promoting the atherogenic changes in diabetic rats.
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Key word:Glycated LDL Collagen Atherosclerosis
糖尿病持续高血糖可引起体内多种蛋白质的非酶促糖化反应，导致蛋白质结构和功能异常，在糖尿病血管并发症的发生发展中起重要作用。近年研究表明低密度脂蛋白(LDL)的糖化与糖尿病动脉粥样硬化的形成及其血管并发症的发生密切相关。本文以链脲酶素(STZ)诱发糖尿病大鼠为模型，观察糖化LDL(G-LDL)及其糖化率和动脉壁细胞外基质胶原的变化，并探讨其相互关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wiistar大鼠45只，体重220～250g，雄性，由重庆医科大学实验动物中心提供。随机分为3组。糖尿病(GM)、糖尿病氨基胍治疗组(AG)和对照组(C)。DM和AG组腹腔注射STZ65mg/kg。诱发糖尿病模型：C组给予等体积的生理盐水。DM组和C组正常饲养，AG组每日于饮水中加入氨基胍1g/L。实验过程中死亡6只，均DM组和AG组。死亡原因为感染，严重代谢紊乱等。饲养4个月后处死，取血浆作血糖，血脂和糖化血红蛋白(HbAlc)测定。取主动脉作胶原含量检测。
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1.2 血糖和血脂测定 血浆葡萄糖(BG)测定采用氧化酶法，试剂盒为东欧公司产品。血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)测定采用酶法，试剂盒由北京中生公司提供。
1.3 HbAlc测定 采用亲和层析法。
1.4 糖化LDL及其糖化率测定：按文献[2]方法。糖化率(K)计算式为K=G-LDL/LDL-ch
1.5 动脉壁Ⅳ型胶原(CIV)Ⅲ型前胶原(PCⅢ)含量的检测 实验大鼠处死后分离出主动脉，除去外层脂肪。加入0.05mol/L Tris-HCL制备匀浆。离心弃上清液，加入0.5mol/L醋酸溶液含1mg/ml胃蛋白酶，4℃提取18小时。加入0.05mol/L Tris-HCL pH7.4终止反应。离心取上清液待测。CIV和PCⅢ测定采用放射免疫法，试剂盒由海军医学研究所提供。蛋白质含量测定采用Lowry法。
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2 结果
2.1 各组血糖和血脂水平：结果见表1。DM组和AG组的血糖水平均高于C组(P)。DM组、AG组和C组间的TG、TC和LDL水平差异无显著性意义(P>0.05)。
表1 各组血糖和血脂水平比较 (
±S) 分组n
BG
mmol/L
TG
mmol/L
TC
mmol/L
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LDL
mmol/L
DM
11
21.71±2.48*
0.92±0.30
1.47±0.33
438.9±121.7
AG
13
18.77±1.94*
0.79±0.57
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1.33±0.13
466.6±130.2
C
15
4.11±0.78
0.69±0.25
1.35±0.25
461.4±155.9
注：P<0.05
2.2 各组HbAlc、G-LDL及K值测定 结果见表2。DM组和AG组的HbAlc、G-LDL和K值均显著高于AG组(P<0.01)。DM组HbAlc、G-LDL和K值虽高于AG组，但其差异未达到统计学意义。
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表2 60例双侧睾丸容积表 分组
n
HbAlc
%
G-LDL
μmol/L
K
DM
11
13.53±1.84*
810.24±110.5*
1.96±0.21*
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AG
13
11.07±1.70*
710.29±98.60*
1.78±0.18*
C
15
4.68±0.62
314.52±68.42
0.66±0.13
注：与C组比较，P<0.01
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2.3 各组CIV和PCⅢ含量测定 结果见表3。DM组的CIV和PCⅢ含量高于AG组和C组；AG组和C组的CIV和PCⅢ含量差异无显著性意义。
表3 各组动态壁CIV和PCⅢ含量的比较 (
±S) 分组n
CIV
μg/g
PCⅢ
μg/g
DM
11
45.46±5.77*※
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33.99±4.96*※
AG
13
22.38±2.00
18.82±2.08
C
15
22.82±1.93
16.61±2.52
注：*与C组比较 *P<0.01 ※与AG组比较 ※P<0.01
2.4 糖化率K与动脉壁CIV与PCⅢ含量变化的关系 糖化率K值与动脉壁CIV和PCⅢ含量呈正相关，相关系统分别为0.806与0.851，P<0.01。
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3 讨论
大鼠是成功制作糖尿病的动物模型，但不是动脉粥样硬化的理想模型，饲以致动脉粥样硬化的膳食常不易引起血脂的明显改变，但这有利于观察除去高血脂外其他因素对动脉粥样硬化发生的机制和作用。在本实验中糖尿病大鼠的血浆葡萄糖水平显著增高，血浆TG、TC和LDL水平变化不明显，而HbAlc、G-LDL和糖化率K值显著升高。表明脂蛋白糖化作用比血脂蛋白量的变化更为重要，是在血脂不增高的情况下引起动脉壁脂质沉积的重要因素之一。表2中DM组和AG组结果相差不显著，其原因是由于HbAlc、G-LDL是非糖化的早期产物，AG对它们无作用。本文结果与Yegin等的结果相一致[3]。LDL在体内主要由细胞膜上的LDL受体识别并清除。在高血糖作用下，LDL发生糖化，反映LDL中的ApoB赖氨酸残基的N端与葡萄糖共价结合生成G-LDL。G-LDL不能被LDL受体识别和清除，而由巨噬细胞摄取后导致胆固醇积聚，形成泡沫细胞，并分泌一系列细胞因子，促进血管内皮损伤和细胞外基质增生[5]。此外，在LDL等蛋白质糖化过程中产生自由基，导致LDL的氧化修饰生成OX-LDL。OX-LDL具有较强的细胞毒性和致动脉粥样硬化作用。G-LDL和OX-LDL有协同效应，共同促进血管壁的硬化病变[6]。
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动脉粥样硬化的重要病理特征是细胞外基质的增加。在动脉壁，主要的细胞外基质成分为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原。在本研究中，DM组的动脉壁CIV和PCⅢ含量高于AG组和C组，表明在DM时，高脂血症前已有细胞外基质胶原增生和硬化的早期病变。而AG组与C组则相差不显著。其原因可能是糖化终末产物(AGE)是能与CIV和PCⅢ作用形成交联的稳定结构，但AG能阻止AGE的生成从而使这种交联不能形成，细胞基质不增加，而致CIV和PC结果不增加。LDL糖化率与动脉壁CIV和PCⅢ呈正相关提示G-LDL参与血管壁的脂质早期沉积和促进胶原的增生。细胞外基质胶原的增生一方面引起血管壁增厚、硬化，另一方面促进脂质沉积和血栓形成趋势增强，从而促进糖尿病动脉粥样硬化的形成[7]。
参考文献
1，Brownlee M.Glycation products and the pathogenesis of diabetic complications. Diabetes Care，1992,15(12):1835～1842
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2，吴丽娟，魏明竟，杨静等.糖尿病患者血清糖化LDL和LDL糖化率的测定及其初步临床应用.中华内分泌代谢杂志，1995，12(2)：84～86
3，Yegin A, Ozben T, Yegin H. Glycation of lipoproteins and accelerated atherosclerosis in non-insulin-dependent diabtes meilitus. Int J Clin Lab Res, 1995,25(3):157～161
4，Brownlee M. Glycation and diabetic complications. Diabetes, 1994,43:836～841
5，Sobernin IA, Tertov VY, Orekhov AN. Atherogenic modified LDL in diabetes. Diabetes, 1996,45(suppl.3):S35～S39
6，Colaco CA, Roser BJ. Atherosclerosis and glycation. Bioassays ，1994,16(2):154～157
7，Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature，1993, 362:801～809, http://www.100md.com