西比灵逆转抗癫痫药诱导的多药耐受基因表达
作者：吕洋 王学峰 晏勇 肖争
单位：(重庆医科大学附一院神经内科 400016)
关键词：抗癫痫药；星形胶质细胞；西比灵；多药耐受基因
重庆医学000301 摘 要 目的 研究西比灵逆转抗癫痫药(AEDs)诱导的星形胶质细胞多药耐受基因(MDR1)表达的规律。方法 将苯巴比妥钠(PB)和丙戊酸钠(VPA)分别加入培养的星形胶质细胞内，30天后用免疫细胞化学法检测MDR1的表达产物P-糖蛋白(Pgp)，继之将终浓度为5μg/ml的西比灵分别加入培养的正常细胞(亲本细胞)及MDR1表达增强的细胞(耐药细胞)内，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法计算逆转倍数和相对逆转效率，了解西比灵逆转MDR1表达的作用。结果 发现西比灵对耐PB或VPA的星形胶质细胞的逆转数分别为2.09、2.51，相对逆转效率分别为76.25%、67.80%。结论 西比灵对AEDs诱导的MDR1的表达有部分逆转作用。
, 百拇医药
AEDs-induced Overexpression of Multidrug Resistance Gene Was Reversed by Sibelium
Lu Yang Wang Xue feng Yan Yong
(Department of Neurology, the Fuist Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Science. Chongqing, 400016)
Abstract Objective:To study the Sibelium(Flunarizine) reverses antiepileptic drugs (AEDs)-induced overexpression of multidrug resistance gene (MDR1). Methods:Phenobarbital and Valproic acid were added into astrocytes and cultured permanently for 30 days. P-glycoprotein(Pgp), a product of MDR1, was detected with immunocyto chemistry. Then, 5μg/ml Sibelium was added to resistance cells(Pgp positive cells) and nonresistance cells(unstimulated by AEDs), MTT assay was used to measure reverse multiple and relative reverse efficiency rate.Results:Our study showed reverse multiples were 2～2.5,and relative reverse efficiency rates were 68%～76% by Sibelium. Conclusion:Sibelium may reverse the overexpression of MDR1.
, http://www.100md.com
Key words:Astrocytes Cell culture Sibelium Antiepilepticdrug Mmultidrug resistance gene
难治性癫痫约占癫痫病人的20%，主要表现为对临床上常用AEDs的多药耐受现象，是临床上尚未攻克、但又急需解决的问题，并成为影响癫痫病人群体预后的关键因素。Tishler[1]及我们先前的实验发现难治性癫痫病人及耐药癫痫鼠的大脑内有MDR1表达增强，证实MDR1表达增强可能是难治性癫痫耐药的重要机制[2]。MDR1是可调控基因，寻找适当的逆转剂可改善难治性癫痫的治疗前景。为此，我们选用临床上有辅助抗癫痫作用，但其机制不明的西比灵进行了逆转MDR1表达的实验，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 星形胶质细胞的培养
, 百拇医药
1.1.1 取出生24小时以内的Wistar大鼠(重庆医科大学实验动物中心提供)，每批为同窝出生的8～10只，共培养12批。
1.1.2 消毒，断头取脑，分离出大脑皮质，剥除脑膜，剪成碎片，以0.25%胰蛋白酶(Sigma,USA,活力1：250)和20μg/ml DNaseI(Boehriger mannheim GmbH, Germany)在37℃水浴中消化30分钟。
1.1.3 加入少量含10%胎牛血清(Hyclone)的DMEM/F12(Gibco BRL,DMEM与F12比例为1：1)完全培养液，内含青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，反复吹打混匀。
1.1.4 离心，沉淀物加入完全培养基制成细胞悬液，并调整细胞密度为1×105个/cm2，接种于培养瓶(Nunclon)，37℃，5%CO2培养1～3小时后补加完全培养液。
, 百拇医药
1.1.5 每2～3天换液一次，每次换液一半。
1.1.6 原代培养至第10天左右将长满瓶底的单层细胞用胰酶消化法行传代处理，接种密度为0.5×105个/cm2，并将部分传代细胞接种于预先涂有多聚赖氨酸(PLL,Sigma)的盖玻片上培养1～2天。用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP，重庆医科大学肿瘤病理生理研究室)抗体行免疫细胞化学染色，GFAP阳性细胞数占细胞总数的比例经统计分析为96.32%，±3.05%。
1.2 药物诱发MDR1试验
PB(吉林公主岭南红光制药厂)，以50%乙醇溶解为10mg/ml，pH调至7.2；VPA(Sanofi,France)，以三蒸水溶解为100mg/ml，pH为7.4。以上试剂用0.22μm的滤器(Cloning)过滤除菌。使用时用DMEM/F12分别将PB和VPA稀释成80μg/ml和200μg/ml，加入生长状态良好的培养细胞后再培养30天，用SP免疫组化试剂盒(福建迈新生物技术开发公司)，按改良即用型SP免疫组化法进行抗JSB-1的Pgp测定，在BH-2型光学显微镜(Olympus,日本)400倍下观察胞浆染成棕黄色的细胞为Pgp阳性细胞。每张盖玻片随机选择五个部位，每个部位计数200个细胞，计Pgp阳性，细胞数占细胞总数的比例。
, 百拇医药
1.3 西比灵逆转MDR1试验
1.3.1 分别将培养成功的正常胶质细胞(亲本细胞)和已有Pgp表达的胶质细胞(耐药细胞)用胰蛋白酶消化成细胞悬液，按密度为1×105个/孔接种于96孔板。
1.3.2 将PB和VPA分别稀释制成不同终浓度(PB组为0、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml，VPA组为0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10000μg/ml)，加入以上细胞组，每种浓度8孔，其中4孔再加入终浓度为5μg/ml的西比灵(70%乙醇溶解，用时稀释)，调整AEDs的量以保持PB、VPA与未加西比灵组浓度相同。在37℃、5%CO2内培养3天。(预实验表明5～10μg/ml西比灵对星形胶质细胞没有杀伤作用)。
, 百拇医药
1.3.3 吸弃含AED的培养液。
1.3.4 加入含终浓度为5mg/ml的MTT无血清培养液，37℃保温4小时。
1.3.5 离心，弃培养液。
1.3.6 每孔加入200μl二甲亚砜，振荡混匀。
1.3.7 用波长600nm的自动酶标仪测光密度值。
1.3.8 以上方法每次作三个平行实验，取均值。
1.3.9 以测得的光密度值对药物浓度的对数作图，按图用加权面归法求出杀死半数细胞的药物浓度即IC50，结果以X±S表示，用成组设计的t检验行统计学处理。
1.3.10 计算：逆转倍数=加用西比灵前后耐药细胞IC50之比；相对逆转效率=[加用西比灵前后耐药细胞IC50之差/无西比灵时耐药细胞IC50与亲本细胞IC50之差]×100%，以评价西比灵的逆转程度。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PB或VPA诱导的MDR1表达(见图1、图2)
图1 Pgp阴性表达的星形胶质细胞
(抗JSB-1免疫细胞化学染色×400)
图2 Pgp阳性表达的星形胶质细胞
(抗JSB-1免疫细胞化学染色×400)
加入80μg/ml PB和200μg/ml VPA培养30天的星形胶质细胞Pgp表达率分别为49.42%±2.40%、37.15%±2.67%。与正常星形胶质细胞(其Pgp表达率为3.81%±2.04%)相比有显著性差异(P<0.01)。
, 百拇医药
2.2 西比灵对MDR1的逆转作用
加用西比灵后耐药星形胶质细胞对PB、VPA抵抗能力明显降低，其IC50显著低于无西比灵的耐药细胞，显示西比灵可逆转此耐药性。同时，西比灵对耐PB或VPA的细胞逆转倍数分别为2.09和2.51，相对逆转效率分别为76.25%和67.8%，显示西比灵有部分逆转效果。(见表1)。
表1 西比灵的逆转效果 药物
IC50(μg/ml，
±S)
逆转
倍数
相对逆
, 百拇医药
转效率
亲本
耐药
PB
316.2±18.2
1000±53.7
PB+西比灵
281.2±14.9
478.6±22.4*
2.09
76.25%
VPA
, http://www.100md.com
794.3±36.3
7079.46±151.36
VPA+西比灵
730.9±30.5
2818.38±91.20*
2.51
67.80%
*表示加入西比灵的耐药细胞IC50与无西比灵者相比
P<0.05
3 讨论
MDR1是人体一种正常的、可调控基因，其表达有高度时空性，受外来药物或毒物刺激及体内基因的调节而表达，其基因产物是Pgp，这种糖蛋白具有能量依赖性外排泵作用，可将进入细胞内的药物或毒物重新排到细胞外，构成了人体抵抗外来药物和毒物的一道重要生理防道。但在疾病状态下，Pgp在保护细胞内环境稳定的同时也向胞外排出治疗性药物，故降低了药物对人体的作用而诱导耐药性的产生。在此情况下如果改变其表达将改善疾病治疗前景。
, 百拇医药
MDR1表达增强成为难治性癫痫重要机制的发现无疑为癫痫的治疗提供了新的理论依据，采用适当的方法逆转MDR1表达以克服这种耐药性将改善难治性癫痫的治疗[1、2]。
目前已证实有逆转MDR1表达作用的药物有钙通道阻滞剂、激素、类固醇、抗雌激素药、抗生素、抗疟药(奎宁和氯喹)、钙调蛋白抑制剂、环孢霉素、抗心律失常药、蛋白激酶抑制剂、环孢霉素、抗心律失常药、蛋白激酶抑制剂、表面活化剂等，但均因其必须大剂量才有效，而随之带来的严重副作用使其不能常规用于临床[3、4]。
西比灵是一种公认的选择性钙通道阻滞剂，将其与其它抗癫痫药同用于临床可使30%左右病人发作减少50%以上，且副作用小，适合多种不同的发作类型，但将其单用于临床则难以达到常用抗癫痫药所具有的抗癫痫效应[5、6]。虽其机理不清楚，但其作用方式和产生的效果与某些逆转剂相似。西比灵分子式为：C26H26F2N2*2HCI，分子量477.42，亲脂性，易通过血脑屏障，化学结构式内有含氮杂环，具备国际公认理想逆转剂的基本条件，因而我们有理由推测它可能是通过逆转MDR1而发挥作用的。在本组实验中我们用MTT法发现耐药细胞中加用西比灵后酶标吸收值有一定程度的降低，表明在相同药物作用下细胞的存活数量减少，耐受药物作用的能力降低，提示西比灵确有逆转MDR1的作用，因而难治性癫痫病人加用西比灵可减少对AEDs的耐药性，提高AEDs的治疗效果。
, 百拇医药
西比灵逆转MDR1的作用可能与其阻滞钙通道作用无关，而可能是其受体和Pgp底物的受体关系密切，可竞争性结合Pgp而增加胞内治疗性药物聚集量来实现其逆转作用[7]，增加药物剂量可能增加其作用强度；也可能是从转录水平上抑制Pgp的合成而逆转MDR1表达，降低细胞耐药物作用的能力[8]。因此，我们认为西比灵逆转MDR1可能是其重要抗癫痫机制的发现将为难治性癫痫病人的治疗开辟一条新的途径。
参考文献
1，Tishler DM, Weinberg Kl, Hinton DR,et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia, 1995,36(1):1～6
2，肖争，晏勇，王学峰.耐苯妥因钠和苯巴比妥钠杏仁核点燃模型及多耐药受基因表达.中华神经科杂志，1999，32(6)：365～368
, 百拇医药
3，付东，王玉芝.肿瘤耐药逆转剂的研究进展.国外医学肿瘤学分册，1997,24(1)：18～21
4，Lum BL,Fisher GA, Brophy, et al. Clinical trial of modulation of multidrug resistance. Cancer,1993，72:3502～3512
5，Hoppu K, Nergardh AR, Eriksson AS, et al. Flunarizine of limited value in children with intractable epilepsy. Pediatr Neurol, 1995,13(2):143～147
6，Treiman DM, Pledger GW, DeGiorgio C, et al. Increasing plasma concentration tolerability study of flunarizine in comedicated epileptic patients. Epilepsia, 1993,34(5):994～953
, 百拇医药
7，Shudo N, Mizoguchi T, Kiyosue T. Two pyridine analogues with more effective ability to reverse multidrug resistance and with lower alcium channel blooking activity than their dihydropyridine counterparts. Cancer Res 1990,50(10):3055～3061
8，Muller C, Goubin F, Ferrandis E, et al. Evidence for transcriptional control of human mdrl gene expression by verapamil in multidrug resistant leukemic cells. Mol Pharmacol, 1995,47(1):51～56, http://www.100md.com
单位：(重庆医科大学附一院神经内科 400016)
关键词：抗癫痫药；星形胶质细胞；西比灵；多药耐受基因
重庆医学000301 摘 要 目的 研究西比灵逆转抗癫痫药(AEDs)诱导的星形胶质细胞多药耐受基因(MDR1)表达的规律。方法 将苯巴比妥钠(PB)和丙戊酸钠(VPA)分别加入培养的星形胶质细胞内，30天后用免疫细胞化学法检测MDR1的表达产物P-糖蛋白(Pgp)，继之将终浓度为5μg/ml的西比灵分别加入培养的正常细胞(亲本细胞)及MDR1表达增强的细胞(耐药细胞)内，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法计算逆转倍数和相对逆转效率，了解西比灵逆转MDR1表达的作用。结果 发现西比灵对耐PB或VPA的星形胶质细胞的逆转数分别为2.09、2.51，相对逆转效率分别为76.25%、67.80%。结论 西比灵对AEDs诱导的MDR1的表达有部分逆转作用。
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AEDs-induced Overexpression of Multidrug Resistance Gene Was Reversed by Sibelium
Lu Yang Wang Xue feng Yan Yong
(Department of Neurology, the Fuist Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Science. Chongqing, 400016)
Abstract Objective:To study the Sibelium(Flunarizine) reverses antiepileptic drugs (AEDs)-induced overexpression of multidrug resistance gene (MDR1). Methods:Phenobarbital and Valproic acid were added into astrocytes and cultured permanently for 30 days. P-glycoprotein(Pgp), a product of MDR1, was detected with immunocyto chemistry. Then, 5μg/ml Sibelium was added to resistance cells(Pgp positive cells) and nonresistance cells(unstimulated by AEDs), MTT assay was used to measure reverse multiple and relative reverse efficiency rate.Results:Our study showed reverse multiples were 2～2.5,and relative reverse efficiency rates were 68%～76% by Sibelium. Conclusion:Sibelium may reverse the overexpression of MDR1.
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Key words:Astrocytes Cell culture Sibelium Antiepilepticdrug Mmultidrug resistance gene
难治性癫痫约占癫痫病人的20%，主要表现为对临床上常用AEDs的多药耐受现象，是临床上尚未攻克、但又急需解决的问题，并成为影响癫痫病人群体预后的关键因素。Tishler[1]及我们先前的实验发现难治性癫痫病人及耐药癫痫鼠的大脑内有MDR1表达增强，证实MDR1表达增强可能是难治性癫痫耐药的重要机制[2]。MDR1是可调控基因，寻找适当的逆转剂可改善难治性癫痫的治疗前景。为此，我们选用临床上有辅助抗癫痫作用，但其机制不明的西比灵进行了逆转MDR1表达的实验，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 星形胶质细胞的培养
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1.1.1 取出生24小时以内的Wistar大鼠(重庆医科大学实验动物中心提供)，每批为同窝出生的8～10只，共培养12批。
1.1.2 消毒，断头取脑，分离出大脑皮质，剥除脑膜，剪成碎片，以0.25%胰蛋白酶(Sigma,USA,活力1：250)和20μg/ml DNaseI(Boehriger mannheim GmbH, Germany)在37℃水浴中消化30分钟。
1.1.3 加入少量含10%胎牛血清(Hyclone)的DMEM/F12(Gibco BRL,DMEM与F12比例为1：1)完全培养液，内含青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，反复吹打混匀。
1.1.4 离心，沉淀物加入完全培养基制成细胞悬液，并调整细胞密度为1×105个/cm2，接种于培养瓶(Nunclon)，37℃，5%CO2培养1～3小时后补加完全培养液。
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1.1.5 每2～3天换液一次，每次换液一半。
1.1.6 原代培养至第10天左右将长满瓶底的单层细胞用胰酶消化法行传代处理，接种密度为0.5×105个/cm2，并将部分传代细胞接种于预先涂有多聚赖氨酸(PLL,Sigma)的盖玻片上培养1～2天。用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP，重庆医科大学肿瘤病理生理研究室)抗体行免疫细胞化学染色，GFAP阳性细胞数占细胞总数的比例经统计分析为96.32%，±3.05%。
1.2 药物诱发MDR1试验
PB(吉林公主岭南红光制药厂)，以50%乙醇溶解为10mg/ml，pH调至7.2；VPA(Sanofi,France)，以三蒸水溶解为100mg/ml，pH为7.4。以上试剂用0.22μm的滤器(Cloning)过滤除菌。使用时用DMEM/F12分别将PB和VPA稀释成80μg/ml和200μg/ml，加入生长状态良好的培养细胞后再培养30天，用SP免疫组化试剂盒(福建迈新生物技术开发公司)，按改良即用型SP免疫组化法进行抗JSB-1的Pgp测定，在BH-2型光学显微镜(Olympus,日本)400倍下观察胞浆染成棕黄色的细胞为Pgp阳性细胞。每张盖玻片随机选择五个部位，每个部位计数200个细胞，计Pgp阳性，细胞数占细胞总数的比例。
, 百拇医药
1.3 西比灵逆转MDR1试验
1.3.1 分别将培养成功的正常胶质细胞(亲本细胞)和已有Pgp表达的胶质细胞(耐药细胞)用胰蛋白酶消化成细胞悬液，按密度为1×105个/孔接种于96孔板。
1.3.2 将PB和VPA分别稀释制成不同终浓度(PB组为0、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml，VPA组为0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10000μg/ml)，加入以上细胞组，每种浓度8孔，其中4孔再加入终浓度为5μg/ml的西比灵(70%乙醇溶解，用时稀释)，调整AEDs的量以保持PB、VPA与未加西比灵组浓度相同。在37℃、5%CO2内培养3天。(预实验表明5～10μg/ml西比灵对星形胶质细胞没有杀伤作用)。
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1.3.3 吸弃含AED的培养液。
1.3.4 加入含终浓度为5mg/ml的MTT无血清培养液，37℃保温4小时。
1.3.5 离心，弃培养液。
1.3.6 每孔加入200μl二甲亚砜，振荡混匀。
1.3.7 用波长600nm的自动酶标仪测光密度值。
1.3.8 以上方法每次作三个平行实验，取均值。
1.3.9 以测得的光密度值对药物浓度的对数作图，按图用加权面归法求出杀死半数细胞的药物浓度即IC50，结果以X±S表示，用成组设计的t检验行统计学处理。
1.3.10 计算：逆转倍数=加用西比灵前后耐药细胞IC50之比；相对逆转效率=[加用西比灵前后耐药细胞IC50之差/无西比灵时耐药细胞IC50与亲本细胞IC50之差]×100%，以评价西比灵的逆转程度。
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2 结果
2.1 PB或VPA诱导的MDR1表达(见图1、图2)
图1 Pgp阴性表达的星形胶质细胞
(抗JSB-1免疫细胞化学染色×400)
图2 Pgp阳性表达的星形胶质细胞
(抗JSB-1免疫细胞化学染色×400)
加入80μg/ml PB和200μg/ml VPA培养30天的星形胶质细胞Pgp表达率分别为49.42%±2.40%、37.15%±2.67%。与正常星形胶质细胞(其Pgp表达率为3.81%±2.04%)相比有显著性差异(P<0.01)。
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2.2 西比灵对MDR1的逆转作用
加用西比灵后耐药星形胶质细胞对PB、VPA抵抗能力明显降低，其IC50显著低于无西比灵的耐药细胞，显示西比灵可逆转此耐药性。同时，西比灵对耐PB或VPA的细胞逆转倍数分别为2.09和2.51，相对逆转效率分别为76.25%和67.8%，显示西比灵有部分逆转效果。(见表1)。
表1 西比灵的逆转效果 药物
IC50(μg/ml，
±S)逆转
倍数
相对逆
, 百拇医药
转效率
亲本
耐药
PB
316.2±18.2
1000±53.7
PB+西比灵
281.2±14.9
478.6±22.4*
2.09
76.25%
VPA
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794.3±36.3
7079.46±151.36
VPA+西比灵
730.9±30.5
2818.38±91.20*
2.51
67.80%
*表示加入西比灵的耐药细胞IC50与无西比灵者相比
P<0.05
3 讨论
MDR1是人体一种正常的、可调控基因，其表达有高度时空性，受外来药物或毒物刺激及体内基因的调节而表达，其基因产物是Pgp，这种糖蛋白具有能量依赖性外排泵作用，可将进入细胞内的药物或毒物重新排到细胞外，构成了人体抵抗外来药物和毒物的一道重要生理防道。但在疾病状态下，Pgp在保护细胞内环境稳定的同时也向胞外排出治疗性药物，故降低了药物对人体的作用而诱导耐药性的产生。在此情况下如果改变其表达将改善疾病治疗前景。
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MDR1表达增强成为难治性癫痫重要机制的发现无疑为癫痫的治疗提供了新的理论依据，采用适当的方法逆转MDR1表达以克服这种耐药性将改善难治性癫痫的治疗[1、2]。
目前已证实有逆转MDR1表达作用的药物有钙通道阻滞剂、激素、类固醇、抗雌激素药、抗生素、抗疟药(奎宁和氯喹)、钙调蛋白抑制剂、环孢霉素、抗心律失常药、蛋白激酶抑制剂、环孢霉素、抗心律失常药、蛋白激酶抑制剂、表面活化剂等，但均因其必须大剂量才有效，而随之带来的严重副作用使其不能常规用于临床[3、4]。
西比灵是一种公认的选择性钙通道阻滞剂，将其与其它抗癫痫药同用于临床可使30%左右病人发作减少50%以上，且副作用小，适合多种不同的发作类型，但将其单用于临床则难以达到常用抗癫痫药所具有的抗癫痫效应[5、6]。虽其机理不清楚，但其作用方式和产生的效果与某些逆转剂相似。西比灵分子式为：C26H26F2N2*2HCI，分子量477.42，亲脂性，易通过血脑屏障，化学结构式内有含氮杂环，具备国际公认理想逆转剂的基本条件，因而我们有理由推测它可能是通过逆转MDR1而发挥作用的。在本组实验中我们用MTT法发现耐药细胞中加用西比灵后酶标吸收值有一定程度的降低，表明在相同药物作用下细胞的存活数量减少，耐受药物作用的能力降低，提示西比灵确有逆转MDR1的作用，因而难治性癫痫病人加用西比灵可减少对AEDs的耐药性，提高AEDs的治疗效果。
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西比灵逆转MDR1的作用可能与其阻滞钙通道作用无关，而可能是其受体和Pgp底物的受体关系密切，可竞争性结合Pgp而增加胞内治疗性药物聚集量来实现其逆转作用[7]，增加药物剂量可能增加其作用强度；也可能是从转录水平上抑制Pgp的合成而逆转MDR1表达，降低细胞耐药物作用的能力[8]。因此，我们认为西比灵逆转MDR1可能是其重要抗癫痫机制的发现将为难治性癫痫病人的治疗开辟一条新的途径。
参考文献
1，Tishler DM, Weinberg Kl, Hinton DR,et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia, 1995,36(1):1～6
2，肖争，晏勇，王学峰.耐苯妥因钠和苯巴比妥钠杏仁核点燃模型及多耐药受基因表达.中华神经科杂志，1999，32(6)：365～368
, 百拇医药
3，付东，王玉芝.肿瘤耐药逆转剂的研究进展.国外医学肿瘤学分册，1997,24(1)：18～21
4，Lum BL,Fisher GA, Brophy, et al. Clinical trial of modulation of multidrug resistance. Cancer,1993，72:3502～3512
5，Hoppu K, Nergardh AR, Eriksson AS, et al. Flunarizine of limited value in children with intractable epilepsy. Pediatr Neurol, 1995,13(2):143～147
6，Treiman DM, Pledger GW, DeGiorgio C, et al. Increasing plasma concentration tolerability study of flunarizine in comedicated epileptic patients. Epilepsia, 1993,34(5):994～953
, 百拇医药
7，Shudo N, Mizoguchi T, Kiyosue T. Two pyridine analogues with more effective ability to reverse multidrug resistance and with lower alcium channel blooking activity than their dihydropyridine counterparts. Cancer Res 1990,50(10):3055～3061
8，Muller C, Goubin F, Ferrandis E, et al. Evidence for transcriptional control of human mdrl gene expression by verapamil in multidrug resistant leukemic cells. Mol Pharmacol, 1995,47(1):51～56, http://www.100md.com