P53抑癌基因及人乳头瘤病毒与宫颈病变关系的探讨
作者：计垣 叶联顺 吕静
单位：(重庆市计划生育科研所 400020)
关键词：
重庆医学000328 P53基因及人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈病变有着密切的关系[1，3]，因此，了解各种宫颈病变时P53基因及HPV感染的情况，对于防治子宫颈癌具有重要价值。我们共选择100例中、重度糜烂病例和40例宫颈癌病例，进行了有关的研究。现将结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 宫颈炎(中、重度糜烂)及宫颈癌的HPV16，18检测：
宫颈炎病例标本为我所附属医院妇产科门诊宫颈中、重度糜烂患者100例，年龄20～45岁。
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宫颈癌病例来自市内各大医院收集的石蜡标本40例。
1.1.1 提取DNA
①宫颈炎病例 用高压灭菌消毒的棉拭子取宫颈粘液放入盛有1ml生理盐水的反应管内振荡，离心收集宫颈脱落细胞。管内加入裂解液经100℃水煮沸15分钟变性，10.000r/min离心5分钟，提取上清液待测。
②宫颈癌标本 石蜡标本先切片，选有内容物的石蜡切片放入反应管内进行二甲苯、梯度酒精脱蜡、脱水，收集细胞，加裂解液55℃水浴孵育30分钟，100℃沸水煮沸15分钟变性，10.000r/min离心5分钟，取上清液待测。
1.1.2 DNA扩增
购采华美公司HPV-PCR试剂盒，有效扩增长度为230～270bp。宫颈炎和宫颈癌待测标本分别取4ul加入PCR反应管内，在基因扩增仪上进行预热94℃，5分钟，变性(94℃30秒)、退火(55℃30秒)、延伸(72℃30秒)，共35次循环，终延伸72℃5分钟。同时设不加模板的阴性对照和加入阳性物模板的阳性对照。
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1.1.3 显示
取反应物15ul加入含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳30分钟(电压50mv/cm)，将凝胶放在紫外透射仪下观察。结果230～270bp处出现阳性带与阳性对照在同一部位，则为阳性，反之为阴性。
1.2 宫颈癌病例P53抑癌基因检测。
1.2.1 P53-PCR检测。
使用北方同正公司提供的P53基因PCR检测试验盒，待测标本5ul加入PCR反应管内在基因扩增仪上进行变性(94℃45秒)、退火(55℃45秒)、延伸(72℃45秒)共35次循环。同时用正常人白细胞DNA模板作为正常对照。取反应物15ul加入含有溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中电泳60分钟(电压40mv/cm)。将凝胶放在紫外透射仪下观察，若样本带与正常对照常在同一位置则说明P53未发生突变或缺失；若标本带与正常带不在同一位置上或根本没有扩增带，则说明P53已发生突变或缺失。
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1.2.2 P53免疫组化检测：
①载玻片选择APES法进行防脱片处理，浸泡10分钟后，捞出置烤箱60℃30分钟，以便切片紧密粘附。
②宫颈癌组织标本切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡至水。
③3%H2O2室温10分钟灭活内源性酶，蒸馏水洗2分钟共3次，切片浸入0.01MPH6.0，柠模酸盐缓冲液中，电炉加热至100℃30分钟，后冷却。滴加抗原修正液，室温10分钟，蒸馏水洗2分钟共3次，滴加封闭液，室温10分钟，甩去多余液体，不洗。滴加抗P53蛋白的抗体，4℃过液。0.01MPBS洗2分钟共3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，20-37℃20分钟，0.01MPBS洗2分钟共3次，滴加试剂SABC，37℃20分钟。0.01MPBS洗5分钟共4次，DAB显色剂显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染。脱水、透明、封片、显微镜观察，阳性细胞核着色呈棕黄色。
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2 结果
2.1 100例宫颈炎标本检测出含有HPV16，18DNA为34例，检出率为34%。
2.2 40例宫颈癌癌标本检测出含有HPV16，18DNA为20例，检出率为50%。
2.3 40例宫颈标本中检出P53基因缺失或突变共18例，检出率为45%，其中P53-5因子缺失10例，P53-6因子缺失1例，P53-7因子缺失3例，P53-8因子缺失6例。
2.4 40例宫颈癌标本P53基因免疫组化检测细胞着色呈棕黄色(阳性)为15例，检出率为37.5%。
3 讨论
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自1976年Zur-Hausen首先研究发现人乳头瘤病毒(HPV)可能是宫颈癌的致病因素以来，对HPV的基因结构，功能及HPV-DNA的致癌机制进行了大量的研究。随着分子生物技术的不断发展，发现某些HPV型别与宫颈炎(中，重度宫颈糜烂)、宫颈癌之间有很强的相关性，尤其以HPV16，18，31，33型为主。
为了解本地区宫颈炎、宫颈癌患者中HPV感染及宫颈癌中P53基因情况，本文作者在研究中选择了本单位附属医院100例宫颈炎(中，重度宫颈糜灶)患者，本地区医院收集40例宫颈癌石蜡标本作为研究对象，对其进行HPV16，18-DNA检测，发现宫颈炎组HPV16，18感染率为34%，宫颈癌组感染率为50%。比较宫颈炎组与宫颈癌组标本中HPV16，18-DNA的存在，发现HPV的感染在宫颈癌组织中明显升高，经统计学检验有显著意义，P<0.05，提示HPV感染在宫颈癌的发生过程中起着重要作用。据国内文献报告宫颈癌组织中HPV16，18感染率为71.42%[5]、90.97%[2]，他们的研究也证实HPV感染与宫颈的发生关系密切，HPV16，18是致宫颈癌的重要类型。在他们的研究中均用新鲜肿瘤标本进行检测。而我们是用陈旧石蜡标本，因在石蜡标本进行DNA提取，扩增过程中，DNA表达较新鲜组织有差异，因此我们所报道的阳性率比国内文献报道较低。
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P53基因是一种抑癌基因，近来研究发现P53基因突变或缺失在宫颈癌的发生中起一定的作用。P53基因位于人类染色体(17P3、1)上，有11个外显子，第5-8外显子为突变的高频区。HPV的E6蛋白(转化蛋白)能与P53蛋白结合并使其失去抑癌活性。我们对40例宫颈癌组织标本进行P535-8外显示检测。发现40例中有18例发生基因突变或缺失。其中外显子5，10例；外显子6，1例；外显子7，3例；外显示8，6例。40例中有2例分别发生5，7和6，8双缺失。Masami等人[4]。对36例子宫颈癌标本的P53基因5-8例显示检测，发现其突变率为5%。国内孙毅等对35例宫颈癌组织P53基因外显子7检测均无异常。而在我们的检测中检出率分别为25%、2.5%、7.5%、15%，尤其以外显子5为高，可能与我们检测的方法及标本来源的地区性及肿瘤的型别(磷癌为主)有关。
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在方法学上我们尽量广取博采探讨更适合于临床的其它检测手段，如P53免疫组化方法，用普通石蜡切片在较短时间内就能作出初步订断，阳性率为37.5%，在40例宫颈癌组织标本中P53-PCR检测发现18例发生突变或缺失，而用P53免疫组化检测中发现有15例发生该棕黄色着色。在18例突变中15例出现核呈棕黄色反应，有3例未着色，两种方法吻合率为83.33%。方法学上比较说明基因水平检测的灵敏度高于细胞水平灵敏度。但作为一般门诊，在尚缺基因诊断条件的情况下，P53免疫组化作为初筛也不失为一种好方法。
本研究表明HPV感染是宫颈肿瘤的一个重要致病因素。在门诊中如发现中，重度宫颈糜烂患者伴有HPV感染，应进行早期治疗，特别在宫颈刮片发现核异质的患者应进行病理组织活检，以减少宫颈肿瘤的发生。达到早期预防宫颈癌的目的。
参考文献
1，Wrede D,et.al,Carcinoma,1991,4(3);171
2，郑鹏生，等.白求恩医科大学学报，1995，21(5)：511
3，韩萍，等.国外医学妇产科分册，1996，23(3)：149
4，Masermi F,et.al,Can Res，1992,52:5323, http://www.100md.com
单位：(重庆市计划生育科研所 400020)
关键词：
重庆医学000328 P53基因及人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈病变有着密切的关系[1，3]，因此，了解各种宫颈病变时P53基因及HPV感染的情况，对于防治子宫颈癌具有重要价值。我们共选择100例中、重度糜烂病例和40例宫颈癌病例，进行了有关的研究。现将结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 宫颈炎(中、重度糜烂)及宫颈癌的HPV16，18检测：
宫颈炎病例标本为我所附属医院妇产科门诊宫颈中、重度糜烂患者100例，年龄20～45岁。
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宫颈癌病例来自市内各大医院收集的石蜡标本40例。
1.1.1 提取DNA
①宫颈炎病例 用高压灭菌消毒的棉拭子取宫颈粘液放入盛有1ml生理盐水的反应管内振荡，离心收集宫颈脱落细胞。管内加入裂解液经100℃水煮沸15分钟变性，10.000r/min离心5分钟，提取上清液待测。
②宫颈癌标本 石蜡标本先切片，选有内容物的石蜡切片放入反应管内进行二甲苯、梯度酒精脱蜡、脱水，收集细胞，加裂解液55℃水浴孵育30分钟，100℃沸水煮沸15分钟变性，10.000r/min离心5分钟，取上清液待测。
1.1.2 DNA扩增
购采华美公司HPV-PCR试剂盒，有效扩增长度为230～270bp。宫颈炎和宫颈癌待测标本分别取4ul加入PCR反应管内，在基因扩增仪上进行预热94℃，5分钟，变性(94℃30秒)、退火(55℃30秒)、延伸(72℃30秒)，共35次循环，终延伸72℃5分钟。同时设不加模板的阴性对照和加入阳性物模板的阳性对照。
, 百拇医药
1.1.3 显示
取反应物15ul加入含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳30分钟(电压50mv/cm)，将凝胶放在紫外透射仪下观察。结果230～270bp处出现阳性带与阳性对照在同一部位，则为阳性，反之为阴性。
1.2 宫颈癌病例P53抑癌基因检测。
1.2.1 P53-PCR检测。
使用北方同正公司提供的P53基因PCR检测试验盒，待测标本5ul加入PCR反应管内在基因扩增仪上进行变性(94℃45秒)、退火(55℃45秒)、延伸(72℃45秒)共35次循环。同时用正常人白细胞DNA模板作为正常对照。取反应物15ul加入含有溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中电泳60分钟(电压40mv/cm)。将凝胶放在紫外透射仪下观察，若样本带与正常对照常在同一位置则说明P53未发生突变或缺失；若标本带与正常带不在同一位置上或根本没有扩增带，则说明P53已发生突变或缺失。
, 百拇医药
1.2.2 P53免疫组化检测：
①载玻片选择APES法进行防脱片处理，浸泡10分钟后，捞出置烤箱60℃30分钟，以便切片紧密粘附。
②宫颈癌组织标本切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡至水。
③3%H2O2室温10分钟灭活内源性酶，蒸馏水洗2分钟共3次，切片浸入0.01MPH6.0，柠模酸盐缓冲液中，电炉加热至100℃30分钟，后冷却。滴加抗原修正液，室温10分钟，蒸馏水洗2分钟共3次，滴加封闭液，室温10分钟，甩去多余液体，不洗。滴加抗P53蛋白的抗体，4℃过液。0.01MPBS洗2分钟共3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，20-37℃20分钟，0.01MPBS洗2分钟共3次，滴加试剂SABC，37℃20分钟。0.01MPBS洗5分钟共4次，DAB显色剂显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染。脱水、透明、封片、显微镜观察，阳性细胞核着色呈棕黄色。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 100例宫颈炎标本检测出含有HPV16，18DNA为34例，检出率为34%。
2.2 40例宫颈癌癌标本检测出含有HPV16，18DNA为20例，检出率为50%。
2.3 40例宫颈标本中检出P53基因缺失或突变共18例，检出率为45%，其中P53-5因子缺失10例，P53-6因子缺失1例，P53-7因子缺失3例，P53-8因子缺失6例。
2.4 40例宫颈癌标本P53基因免疫组化检测细胞着色呈棕黄色(阳性)为15例，检出率为37.5%。
3 讨论
, 百拇医药
自1976年Zur-Hausen首先研究发现人乳头瘤病毒(HPV)可能是宫颈癌的致病因素以来，对HPV的基因结构，功能及HPV-DNA的致癌机制进行了大量的研究。随着分子生物技术的不断发展，发现某些HPV型别与宫颈炎(中，重度宫颈糜烂)、宫颈癌之间有很强的相关性，尤其以HPV16，18，31，33型为主。
为了解本地区宫颈炎、宫颈癌患者中HPV感染及宫颈癌中P53基因情况，本文作者在研究中选择了本单位附属医院100例宫颈炎(中，重度宫颈糜灶)患者，本地区医院收集40例宫颈癌石蜡标本作为研究对象，对其进行HPV16，18-DNA检测，发现宫颈炎组HPV16，18感染率为34%，宫颈癌组感染率为50%。比较宫颈炎组与宫颈癌组标本中HPV16，18-DNA的存在，发现HPV的感染在宫颈癌组织中明显升高，经统计学检验有显著意义，P<0.05，提示HPV感染在宫颈癌的发生过程中起着重要作用。据国内文献报告宫颈癌组织中HPV16，18感染率为71.42%[5]、90.97%[2]，他们的研究也证实HPV感染与宫颈的发生关系密切，HPV16，18是致宫颈癌的重要类型。在他们的研究中均用新鲜肿瘤标本进行检测。而我们是用陈旧石蜡标本，因在石蜡标本进行DNA提取，扩增过程中，DNA表达较新鲜组织有差异，因此我们所报道的阳性率比国内文献报道较低。
, http://www.100md.com
P53基因是一种抑癌基因，近来研究发现P53基因突变或缺失在宫颈癌的发生中起一定的作用。P53基因位于人类染色体(17P3、1)上，有11个外显子，第5-8外显子为突变的高频区。HPV的E6蛋白(转化蛋白)能与P53蛋白结合并使其失去抑癌活性。我们对40例宫颈癌组织标本进行P535-8外显示检测。发现40例中有18例发生基因突变或缺失。其中外显子5，10例；外显子6，1例；外显子7，3例；外显示8，6例。40例中有2例分别发生5，7和6，8双缺失。Masami等人[4]。对36例子宫颈癌标本的P53基因5-8例显示检测，发现其突变率为5%。国内孙毅等对35例宫颈癌组织P53基因外显子7检测均无异常。而在我们的检测中检出率分别为25%、2.5%、7.5%、15%，尤其以外显子5为高，可能与我们检测的方法及标本来源的地区性及肿瘤的型别(磷癌为主)有关。
, http://www.100md.com
在方法学上我们尽量广取博采探讨更适合于临床的其它检测手段，如P53免疫组化方法，用普通石蜡切片在较短时间内就能作出初步订断，阳性率为37.5%，在40例宫颈癌组织标本中P53-PCR检测发现18例发生突变或缺失，而用P53免疫组化检测中发现有15例发生该棕黄色着色。在18例突变中15例出现核呈棕黄色反应，有3例未着色，两种方法吻合率为83.33%。方法学上比较说明基因水平检测的灵敏度高于细胞水平灵敏度。但作为一般门诊，在尚缺基因诊断条件的情况下，P53免疫组化作为初筛也不失为一种好方法。
本研究表明HPV感染是宫颈肿瘤的一个重要致病因素。在门诊中如发现中，重度宫颈糜烂患者伴有HPV感染，应进行早期治疗，特别在宫颈刮片发现核异质的患者应进行病理组织活检，以减少宫颈肿瘤的发生。达到早期预防宫颈癌的目的。
参考文献
1，Wrede D,et.al,Carcinoma,1991,4(3);171
2，郑鹏生，等.白求恩医科大学学报，1995，21(5)：511
3，韩萍，等.国外医学妇产科分册，1996，23(3)：149
4，Masermi F,et.al,Can Res，1992,52:5323, http://www.100md.com