微生物活细胞检测生物传感器的研究
作者：蔡豪斌
单位：蔡豪斌(桂林医学院生物工程研究所 广西桂林市 541004)
关键词：微生物活细胞；生物传感器；分析
华夏医学000306 摘要 目的：研究微生物活细胞在笔者研制的电化学生物传感器上的响应，探讨使用该生物传感器 系统进行微生物活细胞快速测量的可能。方法：设计、研制了能将微生物活细胞新陈代谢产 生的电子转移转换为电流输出的电化学生物传感器，并设计、研制了单片计算机控制、带恒 温测量池的专用测定仪，研究了传感器对大肠杆菌、啤酒酵母、霍乱弧菌及卡介菌苗的响应 ， 并实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌总数及消毒鲜牛奶中的细菌总数。结果：传感器的电流输 出反映了微生物活细胞新陈代谢的程度和能力。结论：研制的生物传感器系统可用于菌种和 培养基组分的快速筛选、微生物活细胞生长特性的快速评估，还可用于发酵罐中发酵菌的生 长监测及新鲜牛奶中杂菌总数的快速测定。
, 百拇医药
中图分类号 R318.6; R117
A Study on the Biosensor for Analyzing Microbes
Chai Haobin
The Biomedical Ins titute of Guilin Medical College,Guilin 541004
Abstract Objective: To study the responses of the electrochemical biosensor system for a nalyzing microbes to determine whether the system can be used to analyze microb es rapidly. Methods: The electrochemical biosensor system had been develop ed and the responses to colifome, brewage microzyme, comma bacillus and bcg vacc ine had been observed. Results: The current measured from biosensor reflected th e metabo lism of microbes. Conclusion: The system not only could pick upon the op timum strain on fixed culture medium or the optimum substrate to special strain fleetly but also could be used to evaluate the microbe growth character apace, monitor z ymogen upgrowth in fermentor and determine total number of bacteria in fresh cre amery rapidly.
, 百拇医药
Key words microbes，biosensor,analysis
对微生物活细胞的快速检测是一个令人关注的课题。传统的显微镜下微量池计数法致操 作者疲倦，存在较大的主观误差，且不易区分活菌细胞与死菌细胞；平板接种培养后菌落计 数法方法客观、结果可靠，但需要恒温培养至少24h以上方可获得结果，因而无法满足需 要现场甚至是实时获得检测结果的场合，如发酵过程控制、鲜奶中杂菌总数测定等等。用于活菌总数检测的生物传感器已有报道[1～2]，笔者在前人工作的基础 上，研制了一具电 化学生物传感器，可将微生物活细胞新陈代谢产生的电子转移转换为传感器的电流输出，并 设计、研制了单片计算机控制、带恒温测量池的专用测定仪，研究了传感器对大肠杆菌、啤 酒酵母、霍乱弧菌及卡介菌苗的响应，实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌总数及鲜牛奶中的细 菌 总数，结果分别与显微镜下直接计数法及平板接种24h菌落计数法相吻合，但测量时间仅 需数分钟，基本做到了现场、实时的测定。
, http://www.100md.com
1 实验与方法
1.1 试剂
1.1.1 磷酸缓冲溶液(PBS) 磷酸二氢钾(KH2PO4)和磷酸氢二钠(Na2HPO4)均为分析纯，用去离子水配制成0.1M ，pH=7.00的缓冲溶液。
1.1.2 电子放大媒介 1，6-二氯酚啶酚钠盐购自Fluka公司，用去离子水配成1%的溶液。
1.1.3 阴极溶液 铁氰化钾(K[CN]4Fe)为分析纯，用去离子水配成过饱和溶液。
1.2 测试样品
啤酒酵母细胞由桂林漓泉啤酒厂提供，大肠杆菌和霍乱弧菌由广西区卫生防疫站细菌科提供 ，卡介菌苗由桂林市结核病防治研究所提供，消毒鲜牛奶购自桂林市场。
, http://www.100md.com
1.3 专用测定仪[3]的设计
图1是专用测定仪的原理框图。恒温测量池采用水浴式PID控温，可在室温 加5℃至60℃设定 测量池温度T，控温精度为±0.02℃；数字表头采用四位半LED，电流测量范围0.01～99. 99μA；仪器可设定测量池搅拌速度Vr(10～300rpm)、电流采样间隔时间t′(1～999s)和 测量总时间Tt(1～9999s)，可选择“I-t”和“[dI/dt]-t”两种测量方式。
图1 专用测定仪原理框图
1.4 传感器的制备
图2是电化学生物传感器的中纵剖图。传感器主体用直径2.8cm有机玻璃棒车制；阳极系直径 2.2cm铂片，贴于有机玻璃棒的一端；阴极为0.5cm×0.5cm×1.5cm的石墨条，置于充满过饱 和铁 氰化钾溶液的阴极室内。阴极室侧面有一直径3mm的小孔与外界通，此小孔用离子交换膜贴 堵使阴极液不致外泄但可与阳极进行离子交换。阳极和阴极均用细银丝导出与测量仪的输入 端相接。
, 百拇医药
图2 原电池型传感器中纵剖面图
1.5 测量方法
向测量池中加入磷酸缓冲溶液3.5ml，电子媒介溶液1.0ml，设定搅拌速度、温度、电流采 样 时间和测量总时间，选择测量方式(I-t或[dI/dt]-t)，按“测量”键读出本底电流值， 加入待测样品溶液500μl，按“测量”键即可。
2 结果与讨论
2.1 测量液营养成分对响应电流的影响
图3是测量液中含与不含葡萄糖时大肠杆菌的I-t响应曲线。可见，测量液中含 葡萄糖时，电流响应大大增加。
图4是测量液中加与不加啤酒发酵原液时啤酒酵母的电流-时间(I-t)响应曲线，可见，测量 液中含啤酒发酵原液时，电流响应大大增加。
, http://www.100md.com
葡萄糖是许多细菌包括大肠杆菌的营养源，啤酒发酵原液是啤酒酵母的最佳培养基，实验结 果验证了本传感器是拾取微生物活细胞新陈代谢过程中电子转移的原理，其电流值反映了微 生物活细胞新陈代谢的程度[1]，提示使用本传感器系统可以进行快速的菌种 或培养基组分筛选。
图3 大肠杆菌在传感器的I-t响应
图4 啤酒酵母菌在传感器的I-t响应
2.2 几种微生物活细胞电流加速度-时间([dI/dt]-t)响应曲线的比较
[dI/dt]-t代表传感头输出电流加速度与时间的关系，反映了微生物活细胞新陈代谢的速 度[3]。图5是霍乱弧菌、啤酒酵母细胞、大肠杆菌和卡介苗的电流加速度-时间 ([dI/dt]-t) 响应曲线。 可见，霍乱弧菌在1min内即达到响应平台并开始下降，啤酒酵母和大肠杆菌在 10min内达到响应平台并开始下降，而卡介苗则在60min后才达到响应平台并开始下降。结 果说明：几种微生物活细胞的电流加速度-时间([dI/dt]-t)响应顺序与这几种 微生物的新陈代谢速度顺序是相吻合的。实验结果提示本传感器可用于微生物活细胞生长特 性的快速评估。
, http://www.100md.com
图5 霍乱弧菌、啤酒酵母、大肠杆菌及卡介菌苗的[ dI/dt]-t响应曲线
图6 传感器法与显微镜下计数法连续现场监测发酵 罐中啤酒酵母活菌数比较
2.3 啤酒发酵罐中酵母活细胞数的现场测定
啤酒发酵过程中尤其是发酵中后期，需要对发酵罐中的酵母活细胞浓度进行定时测定，以确 定终止发酵的最佳时间。啤酒厂现行的酵母活细胞数测定均采用台盼蓝染色后的显微镜下直 接计数法，此法虽简便易行，但操作人员的情绪波动和疲劳极易导致主观误差的产生。本实 验使用啤酒厂提供的标准啤酒酵母制备标准曲线，在发酵车间现场测定了发酵罐中酵母细胞 数12h的动态变化，其结果如图6。结果表明传感器法与显微镜下直接计数法测得的结果 有高度的一致，但传感器法可大大减轻检验人员的劳动强度，也避免了主观因素导致的误差 。另从图6可以看出，传感器法测得值均偏低于显微镜下直接计数法的测得值，提示本传感 器仅对有生长活性的活菌响应，因而用传感器法监测发酵罐中活菌量较显微镜下直接计数法 更有意义。2.4 消毒鲜牛奶中杂菌总数的测定
, http://www.100md.com
随着人民生活水平的提高，新鲜牛奶的消费越来越普及，而新鲜牛奶中微生物的污染也就受 到人们越来越多的关注。国家标准[4]规定特级生鲜牛奶中细菌总数不得超过5 ×105cells/m l，消毒鲜奶中细菌总数不得超过0.3×105cells/ml。由于平板培养菌落计数法需 要 培养24h才能获得细菌总数的检验结果，许多中小型的奶场往往在细菌培养结果出来之前 已将产品销出，因而给人民健康带来潜在的危害。为探讨本传感器用于新鲜牛奶中杂菌总数 快速测定的可能，从市场上购得桂林市某乳品厂生产的消毒鲜奶增菌培养分离后，在本传感 器系统制备标准曲线如图7。用此标准曲线测定了同一产家的20袋鲜奶，同时用常规平板培 养24h菌落计数法做平行对照测定，所得结果如表1。对两组数据进行相关分析，相关系 数R=0.979，说明两种方法测得的结果有较好的一致性，使用本传感器系统完全可以代替传 统的平板培养24h菌落计数法对消毒鲜牛奶中的杂菌总数进行快速、现场的测定。由于测 定一份样品的时间不超过10min，本传感器系统除可用于乳品厂对新鲜牛奶的杂菌总数的快 速测定外，若对仪器整机进行便携式设计，将可帮助工商管理人员和卫生监督监测人员对新 鲜牛奶的卫生质量实现所谓的“柜台边监测”。
, 百拇医药
图7 鲜奶中杂菌总数测定标准曲线
表1 传感器法与平板培养菌落计数法检测消毒鲜奶中杂菌总数结果对照表 样品编号
传感器法
(×105cells/ml)
平板培养菌落计数法
(×105CFU/ml)
1
0.22
0.30
2
0.63
, http://www.100md.com
0.86
3
2.10
1.98
4
0.20
0.12
5
0.20
0.27
6
0.66
0.67
, http://www.100md.com
7
0.20
0.30
8
1.53
1.67
9
0.20
0.21
10
0.20
0.18
11
, http://www.100md.com
2.50
2.69
12
0.20
0.11
13
0.25
0.23
14
0.26
0.22
15
0.20
, 百拇医药
0.24
16
1.00
0.86
17
0.32
0.36
18
0.20
0.12
19
0.85
0.99
, 百拇医药
20
0.20
0.12
R=0.979
3 结论
对研制的电化学生物传感器系统的初步研究，已证实其可以实现对微 生物活细胞的快速检测，诸如培养基的快速筛选和发酵菌种的筛选，还可用于新鲜牛奶中细 菌总数的快速检定。进一步的研究，是将该系统小型化、实用化和商品化。
广西科技厅攻关 项目基金资助课题 桂科攻9817105
作者简介：蔡豪斌(1963-)，男。1985年毕业于广西医学院，199 2年毕业于哈尔滨医科大学，获医学硕士学位。现任桂林医学院生物工程研究所所长， 桂林 医学特种检测中心主任。
, 百拇医药
参考文献
1，Nishikawa S, Sakai S, Karube I, et al. Dye-coupled electrode syste m for the r apid determination of cell populations in polluted water. Appl.Environ Microbial , 1982 Apr，43(4):814～8
2，Perez FG, Mascini M, Tothill IE, et al.Immunomagnetic separation with mediatedflow injection analysis amperometric detection of viable Escherich ia coli O157. Anal Chem，1998 Jun 1，70(11):2380～6
3，蔡豪斌.生物传感器在环境监测中的应用.华夏医学，1999，12(2)：228
4，中华人民共和国国家标准.消毒牛乳，GB5408-85
(收稿 2000-04-18), 百拇医药
单位：蔡豪斌(桂林医学院生物工程研究所 广西桂林市 541004)
关键词：微生物活细胞；生物传感器；分析
华夏医学000306 摘要 目的：研究微生物活细胞在笔者研制的电化学生物传感器上的响应，探讨使用该生物传感器 系统进行微生物活细胞快速测量的可能。方法：设计、研制了能将微生物活细胞新陈代谢产 生的电子转移转换为电流输出的电化学生物传感器，并设计、研制了单片计算机控制、带恒 温测量池的专用测定仪，研究了传感器对大肠杆菌、啤酒酵母、霍乱弧菌及卡介菌苗的响应 ， 并实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌总数及消毒鲜牛奶中的细菌总数。结果：传感器的电流输 出反映了微生物活细胞新陈代谢的程度和能力。结论：研制的生物传感器系统可用于菌种和 培养基组分的快速筛选、微生物活细胞生长特性的快速评估，还可用于发酵罐中发酵菌的生 长监测及新鲜牛奶中杂菌总数的快速测定。
, 百拇医药
中图分类号 R318.6; R117
A Study on the Biosensor for Analyzing Microbes
Chai Haobin
The Biomedical Ins titute of Guilin Medical College,Guilin 541004
Abstract Objective: To study the responses of the electrochemical biosensor system for a nalyzing microbes to determine whether the system can be used to analyze microb es rapidly. Methods: The electrochemical biosensor system had been develop ed and the responses to colifome, brewage microzyme, comma bacillus and bcg vacc ine had been observed. Results: The current measured from biosensor reflected th e metabo lism of microbes. Conclusion: The system not only could pick upon the op timum strain on fixed culture medium or the optimum substrate to special strain fleetly but also could be used to evaluate the microbe growth character apace, monitor z ymogen upgrowth in fermentor and determine total number of bacteria in fresh cre amery rapidly.
, 百拇医药
Key words microbes，biosensor,analysis
对微生物活细胞的快速检测是一个令人关注的课题。传统的显微镜下微量池计数法致操 作者疲倦，存在较大的主观误差，且不易区分活菌细胞与死菌细胞；平板接种培养后菌落计 数法方法客观、结果可靠，但需要恒温培养至少24h以上方可获得结果，因而无法满足需 要现场甚至是实时获得检测结果的场合，如发酵过程控制、鲜奶中杂菌总数测定等等。用于活菌总数检测的生物传感器已有报道[1～2]，笔者在前人工作的基础 上，研制了一具电 化学生物传感器，可将微生物活细胞新陈代谢产生的电子转移转换为传感器的电流输出，并 设计、研制了单片计算机控制、带恒温测量池的专用测定仪，研究了传感器对大肠杆菌、啤 酒酵母、霍乱弧菌及卡介菌苗的响应，实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌总数及鲜牛奶中的细 菌 总数，结果分别与显微镜下直接计数法及平板接种24h菌落计数法相吻合，但测量时间仅 需数分钟，基本做到了现场、实时的测定。
, http://www.100md.com
1 实验与方法
1.1 试剂
1.1.1 磷酸缓冲溶液(PBS) 磷酸二氢钾(KH2PO4)和磷酸氢二钠(Na2HPO4)均为分析纯，用去离子水配制成0.1M ，pH=7.00的缓冲溶液。
1.1.2 电子放大媒介 1，6-二氯酚啶酚钠盐购自Fluka公司，用去离子水配成1%的溶液。
1.1.3 阴极溶液 铁氰化钾(K[CN]4Fe)为分析纯，用去离子水配成过饱和溶液。
1.2 测试样品
啤酒酵母细胞由桂林漓泉啤酒厂提供，大肠杆菌和霍乱弧菌由广西区卫生防疫站细菌科提供 ，卡介菌苗由桂林市结核病防治研究所提供，消毒鲜牛奶购自桂林市场。
, http://www.100md.com
1.3 专用测定仪[3]的设计
图1是专用测定仪的原理框图。恒温测量池采用水浴式PID控温，可在室温 加5℃至60℃设定 测量池温度T，控温精度为±0.02℃；数字表头采用四位半LED，电流测量范围0.01～99. 99μA；仪器可设定测量池搅拌速度Vr(10～300rpm)、电流采样间隔时间t′(1～999s)和 测量总时间Tt(1～9999s)，可选择“I-t”和“[dI/dt]-t”两种测量方式。
图1 专用测定仪原理框图
1.4 传感器的制备
图2是电化学生物传感器的中纵剖图。传感器主体用直径2.8cm有机玻璃棒车制；阳极系直径 2.2cm铂片，贴于有机玻璃棒的一端；阴极为0.5cm×0.5cm×1.5cm的石墨条，置于充满过饱 和铁 氰化钾溶液的阴极室内。阴极室侧面有一直径3mm的小孔与外界通，此小孔用离子交换膜贴 堵使阴极液不致外泄但可与阳极进行离子交换。阳极和阴极均用细银丝导出与测量仪的输入 端相接。
, 百拇医药
图2 原电池型传感器中纵剖面图
1.5 测量方法
向测量池中加入磷酸缓冲溶液3.5ml，电子媒介溶液1.0ml，设定搅拌速度、温度、电流采 样 时间和测量总时间，选择测量方式(I-t或[dI/dt]-t)，按“测量”键读出本底电流值， 加入待测样品溶液500μl，按“测量”键即可。
2 结果与讨论
2.1 测量液营养成分对响应电流的影响
图3是测量液中含与不含葡萄糖时大肠杆菌的I-t响应曲线。可见，测量液中含 葡萄糖时，电流响应大大增加。
图4是测量液中加与不加啤酒发酵原液时啤酒酵母的电流-时间(I-t)响应曲线，可见，测量 液中含啤酒发酵原液时，电流响应大大增加。
, http://www.100md.com
葡萄糖是许多细菌包括大肠杆菌的营养源，啤酒发酵原液是啤酒酵母的最佳培养基，实验结 果验证了本传感器是拾取微生物活细胞新陈代谢过程中电子转移的原理，其电流值反映了微 生物活细胞新陈代谢的程度[1]，提示使用本传感器系统可以进行快速的菌种 或培养基组分筛选。
图3 大肠杆菌在传感器的I-t响应
图4 啤酒酵母菌在传感器的I-t响应
2.2 几种微生物活细胞电流加速度-时间([dI/dt]-t)响应曲线的比较
[dI/dt]-t代表传感头输出电流加速度与时间的关系，反映了微生物活细胞新陈代谢的速 度[3]。图5是霍乱弧菌、啤酒酵母细胞、大肠杆菌和卡介苗的电流加速度-时间 ([dI/dt]-t) 响应曲线。 可见，霍乱弧菌在1min内即达到响应平台并开始下降，啤酒酵母和大肠杆菌在 10min内达到响应平台并开始下降，而卡介苗则在60min后才达到响应平台并开始下降。结 果说明：几种微生物活细胞的电流加速度-时间([dI/dt]-t)响应顺序与这几种 微生物的新陈代谢速度顺序是相吻合的。实验结果提示本传感器可用于微生物活细胞生长特 性的快速评估。
, http://www.100md.com
图5 霍乱弧菌、啤酒酵母、大肠杆菌及卡介菌苗的[ dI/dt]-t响应曲线
图6 传感器法与显微镜下计数法连续现场监测发酵 罐中啤酒酵母活菌数比较
2.3 啤酒发酵罐中酵母活细胞数的现场测定
啤酒发酵过程中尤其是发酵中后期，需要对发酵罐中的酵母活细胞浓度进行定时测定，以确 定终止发酵的最佳时间。啤酒厂现行的酵母活细胞数测定均采用台盼蓝染色后的显微镜下直 接计数法，此法虽简便易行，但操作人员的情绪波动和疲劳极易导致主观误差的产生。本实 验使用啤酒厂提供的标准啤酒酵母制备标准曲线，在发酵车间现场测定了发酵罐中酵母细胞 数12h的动态变化，其结果如图6。结果表明传感器法与显微镜下直接计数法测得的结果 有高度的一致，但传感器法可大大减轻检验人员的劳动强度，也避免了主观因素导致的误差 。另从图6可以看出，传感器法测得值均偏低于显微镜下直接计数法的测得值，提示本传感 器仅对有生长活性的活菌响应，因而用传感器法监测发酵罐中活菌量较显微镜下直接计数法 更有意义。2.4 消毒鲜牛奶中杂菌总数的测定
, http://www.100md.com
随着人民生活水平的提高，新鲜牛奶的消费越来越普及，而新鲜牛奶中微生物的污染也就受 到人们越来越多的关注。国家标准[4]规定特级生鲜牛奶中细菌总数不得超过5 ×105cells/m l，消毒鲜奶中细菌总数不得超过0.3×105cells/ml。由于平板培养菌落计数法需 要 培养24h才能获得细菌总数的检验结果，许多中小型的奶场往往在细菌培养结果出来之前 已将产品销出，因而给人民健康带来潜在的危害。为探讨本传感器用于新鲜牛奶中杂菌总数 快速测定的可能，从市场上购得桂林市某乳品厂生产的消毒鲜奶增菌培养分离后，在本传感 器系统制备标准曲线如图7。用此标准曲线测定了同一产家的20袋鲜奶，同时用常规平板培 养24h菌落计数法做平行对照测定，所得结果如表1。对两组数据进行相关分析，相关系 数R=0.979，说明两种方法测得的结果有较好的一致性，使用本传感器系统完全可以代替传 统的平板培养24h菌落计数法对消毒鲜牛奶中的杂菌总数进行快速、现场的测定。由于测 定一份样品的时间不超过10min，本传感器系统除可用于乳品厂对新鲜牛奶的杂菌总数的快 速测定外，若对仪器整机进行便携式设计，将可帮助工商管理人员和卫生监督监测人员对新 鲜牛奶的卫生质量实现所谓的“柜台边监测”。
, 百拇医药
图7 鲜奶中杂菌总数测定标准曲线
表1 传感器法与平板培养菌落计数法检测消毒鲜奶中杂菌总数结果对照表 样品编号
传感器法
(×105cells/ml)
平板培养菌落计数法
(×105CFU/ml)
1
0.22
0.30
2
0.63
, http://www.100md.com
0.86
3
2.10
1.98
4
0.20
0.12
5
0.20
0.27
6
0.66
0.67
, http://www.100md.com
7
0.20
0.30
8
1.53
1.67
9
0.20
0.21
10
0.20
0.18
11
, http://www.100md.com
2.50
2.69
12
0.20
0.11
13
0.25
0.23
14
0.26
0.22
15
0.20
, 百拇医药
0.24
16
1.00
0.86
17
0.32
0.36
18
0.20
0.12
19
0.85
0.99
, 百拇医药
20
0.20
0.12
R=0.979
3 结论
对研制的电化学生物传感器系统的初步研究，已证实其可以实现对微 生物活细胞的快速检测，诸如培养基的快速筛选和发酵菌种的筛选，还可用于新鲜牛奶中细 菌总数的快速检定。进一步的研究，是将该系统小型化、实用化和商品化。
广西科技厅攻关 项目基金资助课题 桂科攻9817105
作者简介：蔡豪斌(1963-)，男。1985年毕业于广西医学院，199 2年毕业于哈尔滨医科大学，获医学硕士学位。现任桂林医学院生物工程研究所所长， 桂林 医学特种检测中心主任。
, 百拇医药
参考文献
1，Nishikawa S, Sakai S, Karube I, et al. Dye-coupled electrode syste m for the r apid determination of cell populations in polluted water. Appl.Environ Microbial , 1982 Apr，43(4):814～8
2，Perez FG, Mascini M, Tothill IE, et al.Immunomagnetic separation with mediatedflow injection analysis amperometric detection of viable Escherich ia coli O157. Anal Chem，1998 Jun 1，70(11):2380～6
3，蔡豪斌.生物传感器在环境监测中的应用.华夏医学，1999，12(2)：228
4，中华人民共和国国家标准.消毒牛乳，GB5408-85
(收稿 2000-04-18), 百拇医药