丹参对肝脏缺血再灌注后病理变化影响的实验研究
作者：苗雄鹰 庄赞根 齐海智 赵华 黄红生 姜晓华 陈干农
单位：湖南医科大学第二附属医院普外科 长沙 410011
关键词：丹参；肝脏；缺血；再灌注损伤
中国现代医学杂志000305 目的：观察丹参对肝脏热缺血和冷缺血再灌注后病理变化的影响。方法：将家兔12只制成肝脏热缺血模型，电镜下观察热缺血再灌注后丹参对肝脏超微结构变化的影响；对20头猪施行辅助性肝移植术，光镜下观察移植肝在冷缺血再灌注后丹参对肝脏病理变化的影响。结果：兔热缺血再灌注后，在肝细胞超微结构观察中，发现丹参可明显减轻线粒体和粗面内质网肿胀；猪冷缺血再灌注后，在肝脏光镜观察中，发现丹参可明显减轻肝细胞浊肿、脂变和汇管区炎症。结论：丹参可明显减轻肝脏热缺血和冷缺血再灌注后肝脏病理损害。
分类号 R657.3
, 百拇医药
THE EXPERIMENTAL STUDY ON RADIX SALVIAE
MILTIORRHIAS IN THE EFFECTS ON PATHOLOGICAL
CHANGES OF HEPATIC ISCHMIA REPERFUSION
Miao Xiongying, Zhuang Zangen, Qi Haizhi, et al
(Department of Surgery, The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410011)
Objective: To study the effect of radix salviae miltiorrhiae (RSM) on the pathological changes of hepatic ischemia reperfusion. Methods: Warm ischemic models of liver were made by interrupting the blood flow of caudate lobe of liver in 12 rabbits, the effect of RSM on the hepatocyte's ultrastructure was investigated. Cool ischemic models of liver were made by anxiliary liver transplantation in 20 pigs, the effect of RSM on the pathological changes in optic microscope was also observed during reperfusion period. Results: The swollen changes of mitochondria and Rough Endoplasmic Reticulum of the experimental group are much milder than those of the control group in rabbits. And the hepatocellular cloudy swelling and fatty change of the experimental group are slight compair with the controol group in pigs. Conclusion: RSM might play an important role in reducing hepatic pathological injury aftter ischemia reperfusion.
, 百拇医药
Key words: Salvia miltiorrhiza； Liver； Reperfusion injury； Ischemia
缺血再灌注损伤目前仍是肝脏外科的一大难题，在复杂肝切除术和肝移植等手术时常面临再灌注损伤的困难。近年来,丹参在防治肝脏缺血再灌注损伤中的作用已引起人们重视[1]。为此,我们进行了肝脏热缺血和冷缺血后再灌注实验,电镜和光镜下观察丹参对再灌注后肝脏病理改变的影响,以探讨丹参对防治肝脏再灌注损伤的作用。
1 材料与方法
1.1 肝脏热缺血再灌注损伤模型的制备
健康新西兰家兔12只，雌雄不拘，体重2～2.5kg，由我院动物室提供，随机分为实验组和对照组，每组各6只。
1.1.1 实验组：6只。于术前从耳静脉注射复方丹参注射液(2ml/kg，上海第九制药厂产品)。术中进腹后于肝脏腹侧游离显露肝尾状叶，并将尾叶肝蒂用无损伤血管钳夹闭，阻断尾叶血流，制成肝热缺血模型。40min后松钳复流。
, http://www.100md.com
1.1.2 对照组：6只。于术前从耳静脉注射生理盐水2ml/kg。余操作同实验组。
1.2 肝脏冷缺血再灌注损伤模型的制备
健康良种幼猪40头，雌雄不拘，体重15～30kg，随机分为供肝组和移植组。每组各20头，共施行辅助性肝移植术20次，并将其分为实验组和对照组。
1.2.1 实验组：10例，供肝切取前1h和受体猪接受供肝植入时静脉滴注复方丹参注射液(1ml/kg)。于1h内滴注完毕。
1.2.2 对照组：10例，与实验组同步时间滴注生理盐水(1ml/kg)。
供肝切取采用标准取肝法[2]。肝脏灌洗用4℃乳酸林格氏液。灌洗量为门静脉1000ml，肝动脉500ml，供肝切下后置于4℃保存液中行修肝手术。各组热缺血时间为0min，修肝时冷缺血时间为20±5min。肝脏植入受体肝下，先行腔静脉端侧吻合，再行门静脉端侧吻合，此时开放门静脉进入再灌注期。累计冷缺血时间为40±10min。最后行带腹主动脉片肝动脉与受体腹主动脉端侧吻合，平均植肝时间50±10min。
, http://www.100md.com
1.3 观察项目
1.3.1 热缺血再灌注损伤模型的观察指标 实验组和对照组均分别于阻断血流前、阻断血流后40min和再灌注40min后取肝脏组织制成电镜标本，超薄切片，铅铀双重染色，JEM-100CX Ⅱ型透射电镜观察拍照。
1.3.2 冷缺血再灌注损伤模型的观察指标
实验组和对照组均分别于供肝切取前、再灌注前和再灌注40min后取肝脏组织制成光镜标本，石腊包埋切片后行光学显微镜检查。
1.4 统计学处理
采用χ2检验。
2 结果
2.1 肝脏热缺血再灌注后电镜检查结果
, 百拇医药
肝细胞超微结构形态学观察显示，在阻断血流前实验组和对照组超微结构无明显改变，而在阻断血流40min后对照组线粒体明显肿胀成球形，嵴断裂；粗面内质网明显扩张成囊池状并有脱颗粒现象；肝细胞核皱缩、核染色质在边缘浓集；而实验组则线粒体和粗面内质网肿胀较轻，嵴基本完整，细胞核也无明显变化。再灌注40min后对照组线粒体仍明显肿胀，嵴消失，基质透明，粗面内质网明显扩张，脱颗粒现象仍存在，细胞核皱缩未见改善，提示损伤加剧。而实验组线粒体和粗面内质网肿胀明显好转，嵴完整。
2.2 肝脏冷缺血再灌注后光镜检查结果
供肝切取前光镜检查未见明显病理改变。再灌注前和再灌注后光镜检查示肝脏有不同程度细胞损害，以肝细胞浊肿、脂变和汇管区炎症最多见，尤其是再灌注40min后这种病理损害更为明显。但实验组这种损害明显低于对照组(均P<0.01)，再灌注后的损伤也较轻微。而对照组再灌注后损伤明显高于再灌注前(均P<0.05)，见附表。
, http://www.100md.com
附表 肝脏冷缺血再灌注后光镜检查结果 例数(%) 组别
例数
再灌注前
再灌注40min
浊肿
脂变
炎症
浊肿
脂变
炎症
对照组
10
8
, http://www.100md.com
(80.0)
7
(70.0)
6
(60.0)
101)
(100.0)
101)
(100.0)
101)
(100.0)
实验组
, http://www.100md.com
10
42)
(40.0)
32)
(30.0)
32)
(30.0)
62)
(60.0)
52)
(50.5)
52)
, 百拇医药
(50.0)
注：1)与再灌注前比较P<0.05
2)与对照组比较P<0.01
3 讨论
肝脏缺血后再灌注时常出现再灌注损伤，无论是热缺血抑或冷缺血后再灌注都有类似改变，这给肝脏外科那些需完全阻断肝血流的手术如肝叶切除术和肝移植术等均带来诸多不利，常导致术后肝功能损害。许多研究表明，再灌注损伤与钙超载和氧自由基增多有密切关系[3～6]。钙超载可干扰线粒体的氧化磷酸化作用，并能激活磷酯酶、蛋白酶，导致膜性结构破坏。而氧自由基除了直接损伤膜性结构外，还可以产生脂质过氧化物和炎症介质，加重细胞损害[6]。
本实验也表明，在肝脏热缺血和冷缺血再灌注后均出现了程度不同的肝细胞损伤。肝细胞中线粒体和粗面内质网是最重要的细胞器，与能量生成和蛋白质合成有密切关系，因而是判断肝细胞功能的重要指标，但它们对缺血、缺氧等改变却十分敏感。本实验观察到，在热缺血40min后线粒体和粗面内质网均出现肿胀扩张，再灌注40min后这种病理损害加重。而肝脏冷缺血后也出现了明显肝细胞浊肿、脂变和汇管区炎症，再灌注后这种损害更为明显。因而防治再灌注损伤，保护肝脏功能对肝脏外科尤显重要。
, http://www.100md.com
丹参是近年来引起人们重视的一种传统中药，已有研究表明它能防治钙超载，减轻氧自由基等物质对细胞的损害[3，4]，还可明显提高机体耐缺氧能力，调节和改善微循环障碍、抑制血小板和红细胞聚集，对缺血组织有保护作用[1]。同时丹参还能保护缺血或残肝细胞以促进肝细胞再生[7]，并可在低温情况下提高组织中ATP含量和Na+-K+ ATP酶活性继而减轻器官在低温下的损伤[8]。本实验也观察到，使用丹参后能明显减轻肝脏缺血后和再灌注后的肝细胞浊肿、脂变、汇管区炎症以及线粒体和粗面内质网的肿胀，表明丹参对缺血的肝细胞有保护作用且可明显减轻再灌注后肝细胞的损害。这无疑为肝脏外科领域防治肝脏缺血再灌注损伤提供了新的方法。
基金项目：湖南省卫生厅科研基金资助课题
参考文献：
, http://www.100md.com 1 叶荣森，唐奇光.丹参等药物对实验性肝脏微循环障碍纠正作用的初步研究.中国中西医结合杂志，1987；7：420
2 夏穗生.器官移植学.上海：上海科学技术出版社，1995；178～181
3 卢绮萍，史陈让，吴在德，等.丹参防治肝缺血再灌注期肝细胞内钙超载的实验与临床研究.中华外科杂志，1996；2：98～101
4 Thomas CE, Reed DJ.Current Status of calcium in hepatocellular injury.Hepatology, 1989;10:375～378
5 夏志雄，李彦树，刘志军.流氮卓酮对失血性休克犬肝脏的保护作用及机理.中国现代医学杂志，1999；9(10)：18～19
6 陈曼娜，张天庭，虞佩兰.肠缺血/再灌流实验研究.中国现代医学杂志，1997；7(5)：17～18
7 程 斌.肝脏的缺血再灌注损伤.中华器官移植杂志，1992；1：47～48
8 张志伟，吴在德，官 阳.丹参对鼠缺血后残肝细胞超微结构的影响.中华实验外科杂志，1995；6：366～367
9 李幼生，黎介寿，李 宁，等.丹参对低温保存小肠的保护作用.中华实验外科杂志，1997；3：177～178
(1999-10-28收稿), http://www.100md.com
单位：湖南医科大学第二附属医院普外科 长沙 410011
关键词：丹参；肝脏；缺血；再灌注损伤
中国现代医学杂志000305 目的：观察丹参对肝脏热缺血和冷缺血再灌注后病理变化的影响。方法：将家兔12只制成肝脏热缺血模型，电镜下观察热缺血再灌注后丹参对肝脏超微结构变化的影响；对20头猪施行辅助性肝移植术，光镜下观察移植肝在冷缺血再灌注后丹参对肝脏病理变化的影响。结果：兔热缺血再灌注后，在肝细胞超微结构观察中，发现丹参可明显减轻线粒体和粗面内质网肿胀；猪冷缺血再灌注后，在肝脏光镜观察中，发现丹参可明显减轻肝细胞浊肿、脂变和汇管区炎症。结论：丹参可明显减轻肝脏热缺血和冷缺血再灌注后肝脏病理损害。
分类号 R657.3
, 百拇医药
THE EXPERIMENTAL STUDY ON RADIX SALVIAE
MILTIORRHIAS IN THE EFFECTS ON PATHOLOGICAL
CHANGES OF HEPATIC ISCHMIA REPERFUSION
Miao Xiongying, Zhuang Zangen, Qi Haizhi, et al
(Department of Surgery, The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410011)
Objective: To study the effect of radix salviae miltiorrhiae (RSM) on the pathological changes of hepatic ischemia reperfusion. Methods: Warm ischemic models of liver were made by interrupting the blood flow of caudate lobe of liver in 12 rabbits, the effect of RSM on the hepatocyte's ultrastructure was investigated. Cool ischemic models of liver were made by anxiliary liver transplantation in 20 pigs, the effect of RSM on the pathological changes in optic microscope was also observed during reperfusion period. Results: The swollen changes of mitochondria and Rough Endoplasmic Reticulum of the experimental group are much milder than those of the control group in rabbits. And the hepatocellular cloudy swelling and fatty change of the experimental group are slight compair with the controol group in pigs. Conclusion: RSM might play an important role in reducing hepatic pathological injury aftter ischemia reperfusion.
, 百拇医药
Key words: Salvia miltiorrhiza； Liver； Reperfusion injury； Ischemia
缺血再灌注损伤目前仍是肝脏外科的一大难题，在复杂肝切除术和肝移植等手术时常面临再灌注损伤的困难。近年来,丹参在防治肝脏缺血再灌注损伤中的作用已引起人们重视[1]。为此,我们进行了肝脏热缺血和冷缺血后再灌注实验,电镜和光镜下观察丹参对再灌注后肝脏病理改变的影响,以探讨丹参对防治肝脏再灌注损伤的作用。
1 材料与方法
1.1 肝脏热缺血再灌注损伤模型的制备
健康新西兰家兔12只，雌雄不拘，体重2～2.5kg，由我院动物室提供，随机分为实验组和对照组，每组各6只。
1.1.1 实验组：6只。于术前从耳静脉注射复方丹参注射液(2ml/kg，上海第九制药厂产品)。术中进腹后于肝脏腹侧游离显露肝尾状叶，并将尾叶肝蒂用无损伤血管钳夹闭，阻断尾叶血流，制成肝热缺血模型。40min后松钳复流。
, http://www.100md.com
1.1.2 对照组：6只。于术前从耳静脉注射生理盐水2ml/kg。余操作同实验组。
1.2 肝脏冷缺血再灌注损伤模型的制备
健康良种幼猪40头，雌雄不拘，体重15～30kg，随机分为供肝组和移植组。每组各20头，共施行辅助性肝移植术20次，并将其分为实验组和对照组。
1.2.1 实验组：10例，供肝切取前1h和受体猪接受供肝植入时静脉滴注复方丹参注射液(1ml/kg)。于1h内滴注完毕。
1.2.2 对照组：10例，与实验组同步时间滴注生理盐水(1ml/kg)。
供肝切取采用标准取肝法[2]。肝脏灌洗用4℃乳酸林格氏液。灌洗量为门静脉1000ml，肝动脉500ml，供肝切下后置于4℃保存液中行修肝手术。各组热缺血时间为0min，修肝时冷缺血时间为20±5min。肝脏植入受体肝下，先行腔静脉端侧吻合，再行门静脉端侧吻合，此时开放门静脉进入再灌注期。累计冷缺血时间为40±10min。最后行带腹主动脉片肝动脉与受体腹主动脉端侧吻合，平均植肝时间50±10min。
, http://www.100md.com
1.3 观察项目
1.3.1 热缺血再灌注损伤模型的观察指标 实验组和对照组均分别于阻断血流前、阻断血流后40min和再灌注40min后取肝脏组织制成电镜标本，超薄切片，铅铀双重染色，JEM-100CX Ⅱ型透射电镜观察拍照。
1.3.2 冷缺血再灌注损伤模型的观察指标
实验组和对照组均分别于供肝切取前、再灌注前和再灌注40min后取肝脏组织制成光镜标本，石腊包埋切片后行光学显微镜检查。
1.4 统计学处理
采用χ2检验。
2 结果
2.1 肝脏热缺血再灌注后电镜检查结果
, 百拇医药
肝细胞超微结构形态学观察显示，在阻断血流前实验组和对照组超微结构无明显改变，而在阻断血流40min后对照组线粒体明显肿胀成球形，嵴断裂；粗面内质网明显扩张成囊池状并有脱颗粒现象；肝细胞核皱缩、核染色质在边缘浓集；而实验组则线粒体和粗面内质网肿胀较轻，嵴基本完整，细胞核也无明显变化。再灌注40min后对照组线粒体仍明显肿胀，嵴消失，基质透明，粗面内质网明显扩张，脱颗粒现象仍存在，细胞核皱缩未见改善，提示损伤加剧。而实验组线粒体和粗面内质网肿胀明显好转，嵴完整。
2.2 肝脏冷缺血再灌注后光镜检查结果
供肝切取前光镜检查未见明显病理改变。再灌注前和再灌注后光镜检查示肝脏有不同程度细胞损害，以肝细胞浊肿、脂变和汇管区炎症最多见，尤其是再灌注40min后这种病理损害更为明显。但实验组这种损害明显低于对照组(均P<0.01)，再灌注后的损伤也较轻微。而对照组再灌注后损伤明显高于再灌注前(均P<0.05)，见附表。
, http://www.100md.com
附表 肝脏冷缺血再灌注后光镜检查结果 例数(%) 组别
例数
再灌注前
再灌注40min
浊肿
脂变
炎症
浊肿
脂变
炎症
对照组
10
8
, http://www.100md.com
(80.0)
7
(70.0)
6
(60.0)
101)
(100.0)
101)
(100.0)
101)
(100.0)
实验组
, http://www.100md.com
10
42)
(40.0)
32)
(30.0)
32)
(30.0)
62)
(60.0)
52)
(50.5)
52)
, 百拇医药
(50.0)
注：1)与再灌注前比较P<0.05
2)与对照组比较P<0.01
3 讨论
肝脏缺血后再灌注时常出现再灌注损伤，无论是热缺血抑或冷缺血后再灌注都有类似改变，这给肝脏外科那些需完全阻断肝血流的手术如肝叶切除术和肝移植术等均带来诸多不利，常导致术后肝功能损害。许多研究表明，再灌注损伤与钙超载和氧自由基增多有密切关系[3～6]。钙超载可干扰线粒体的氧化磷酸化作用，并能激活磷酯酶、蛋白酶，导致膜性结构破坏。而氧自由基除了直接损伤膜性结构外，还可以产生脂质过氧化物和炎症介质，加重细胞损害[6]。
本实验也表明，在肝脏热缺血和冷缺血再灌注后均出现了程度不同的肝细胞损伤。肝细胞中线粒体和粗面内质网是最重要的细胞器，与能量生成和蛋白质合成有密切关系，因而是判断肝细胞功能的重要指标，但它们对缺血、缺氧等改变却十分敏感。本实验观察到，在热缺血40min后线粒体和粗面内质网均出现肿胀扩张，再灌注40min后这种病理损害加重。而肝脏冷缺血后也出现了明显肝细胞浊肿、脂变和汇管区炎症，再灌注后这种损害更为明显。因而防治再灌注损伤，保护肝脏功能对肝脏外科尤显重要。
, http://www.100md.com
丹参是近年来引起人们重视的一种传统中药，已有研究表明它能防治钙超载，减轻氧自由基等物质对细胞的损害[3，4]，还可明显提高机体耐缺氧能力，调节和改善微循环障碍、抑制血小板和红细胞聚集，对缺血组织有保护作用[1]。同时丹参还能保护缺血或残肝细胞以促进肝细胞再生[7]，并可在低温情况下提高组织中ATP含量和Na+-K+ ATP酶活性继而减轻器官在低温下的损伤[8]。本实验也观察到，使用丹参后能明显减轻肝脏缺血后和再灌注后的肝细胞浊肿、脂变、汇管区炎症以及线粒体和粗面内质网的肿胀，表明丹参对缺血的肝细胞有保护作用且可明显减轻再灌注后肝细胞的损害。这无疑为肝脏外科领域防治肝脏缺血再灌注损伤提供了新的方法。
基金项目：湖南省卫生厅科研基金资助课题
参考文献：
, http://www.100md.com 1 叶荣森，唐奇光.丹参等药物对实验性肝脏微循环障碍纠正作用的初步研究.中国中西医结合杂志，1987；7：420
2 夏穗生.器官移植学.上海：上海科学技术出版社，1995；178～181
3 卢绮萍，史陈让，吴在德，等.丹参防治肝缺血再灌注期肝细胞内钙超载的实验与临床研究.中华外科杂志，1996；2：98～101
4 Thomas CE, Reed DJ.Current Status of calcium in hepatocellular injury.Hepatology, 1989;10:375～378
5 夏志雄，李彦树，刘志军.流氮卓酮对失血性休克犬肝脏的保护作用及机理.中国现代医学杂志，1999；9(10)：18～19
6 陈曼娜，张天庭，虞佩兰.肠缺血/再灌流实验研究.中国现代医学杂志，1997；7(5)：17～18
7 程 斌.肝脏的缺血再灌注损伤.中华器官移植杂志，1992；1：47～48
8 张志伟，吴在德，官 阳.丹参对鼠缺血后残肝细胞超微结构的影响.中华实验外科杂志，1995；6：366～367
9 李幼生，黎介寿，李 宁，等.丹参对低温保存小肠的保护作用.中华实验外科杂志，1997；3：177～178
(1999-10-28收稿), http://www.100md.com