胃癌组织中FHIT基因的异常表达
作者：张桂英 段晓明 田芳
单位：张桂英 段晓明(湖南医科大学附属湘雅医院消化内科 长沙 410008)；田芳(湖南省肿瘤研究所)
关键词：胃肿瘤；FHIT基因；PT—PCR；cDNA序列分析；基因表达；异常转录本
中国现代医学杂志000303 目的：探讨FHIT基因与胃癌关系。方法：采用PT-PCR及PCR产物直接测序法，对26例胃癌组织及其配对正常组织的FHIT基因进行检测。结果：7例(26.9%)胃癌组织存在异常FHIT转录本的表达，其中1例无正常FHIT转录本的表达；另6例同时存在正常FHIT转录本的表达；配对正常组织均无异常FHIT转录本的表达；测序证实异常转录本缺失1个或1个以上FHIT外显子。结论：FHIT转录本的异常是胃癌中常见的和肿瘤特有的改变，FHIT基因的异常与我国部分胃癌的发生有关。
分类号 R735.2
, 百拇医药
ABNORMAL EXPRESSION OF THE FHIT GENE IN
HUMAN PRIMARY GASTRIC CANCERS
Zhang Guiying, Duang Xiaoming, Tian Fang,et al.
(Affiliated Xiangya Hopital of Hunan Medical University, Changsha, Hunan 410008)
Objective: To evaluate the relationship between the FHIT gene and gastric cancers. Methods: Matched normal and cancerous tissues from 26 patients with gastric cancers were analysed by nested RT-PCR and direct sequencing of the products. Results: 7 of 26(26.9%) primary gastric cancers expressed aberrant FHIT transcripts, but no aberrant FHIT transcripts was observed in all the matched normal tissues. Sequence analysis of the aberrant transcripts of 2 cancerous tissues confirmed that aberrant transcripts were missing in one or more exons of the FHIT gene. Conclusion: Expression of aberrant FHIT transcripts is common and tumor-specific in gastric cancers and abnormalities of the FHIT gene transcript are associated with gastric carcinogenesis.
, 百拇医药
Key words: Gastric neoplasms； FHIT gene； RT-PCR； cDNA-Sequence analysis； Gene expression； Aberrant transcripts
有关胃癌中FHIT基因与研究国外虽有报导，但结果不一致，国内FHIT基因在胃癌中有无异常尚属未知，为了探讨FHIT基因与胃癌发生的关系，本文采用RT—PCR及PCR产物直接测序检测了胃癌组织及其配对正常组织中FHIT基因的表达。
1 材料与方法
1.1 材料
组织标本：26例胃癌组织及配对正常组织(手术切缘的粘膜)取自湖南医科大学附属湘雅医院 、附属等二医院普外科1997年6月～1998年10月手术切除并经病理证实的胃癌患者。其中男11例，女15例；年龄29～74岁，平均年龄49.8岁。组织学类型；高分化腺癌1例，高-中分化腺癌5例。中-低分化腺癌2例，低分化腺癌8例，未分化腺癌1例，粘液腺癌4例，印戒细胞癌2例，混合型癌3例，术后迅速取材，置液氮中速冻，然后贮存于液氮中待用。
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1.2 方法
1.2.1 总RNA提取 按产品说明书介绍的方法，用TRlzol试剂(GIBCO BRL公司)提取组织的总RNA。
1.2.2 逆转录取1μg总RNA，使用Reverse Transcription System试刘盒(Promega公司)进行逆转录合成cDNA[引物为Oligo(dt)15]。
1.2.3 巢式PCR引物完全参照文献[1]，由上海生物制品研究所合成。引物序列：5U2 5′ATC CTG GAA GCT TTG AAG CTC A-3′，3D2 5′-TCA CTG GTT GAA GAA TAC AGG-3′；5U1 5′-TCC GTA GTG CTA TCT ACA TC-3′，3D1 5′-CAT GCT GAT TCA GTT CCT CTT GG-3′，两对引物扩增产物分别为810 bp、707bp。第1轮PCR：25μl反应体系中含cDNA模板1μl,10xPCR缓冲液2.5μl，2mMdNTPs 1μl,40μ M5U2与3D2混合液0.5μl，Taq酶1.25u；在DNA Thermal Cycler 480 PCR仪(Perkin-Elmer Cetus公司)进行扩增，扩增条件：首先97℃变性5min，然后94℃ 30 s，65℃ 30s，72℃ 30s,25个循环，第2轮PCR：将第1轮扩增产物稀释20倍后取2μl进行第2轮PCR扩增，除反应体积增至50μl,循环数增至30,引物为5U1、3D1外，其余条件均同第1轮。所有标本均至少进行2次巢式PCR，并设置不加cDNA模板的空白对照。
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1.2.4 产物检测 取10μl PCR扩增产物，进行1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴乙锭)电泳(100V，1.5h)，紫外线检测仪上观察并摄影记录。
1.2.5 cDNA序列分析 按文献的方法[5]，取第2轮PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以回收、纯化待测序片段；用下游引物3D1和荧光素标记的dNTPs扩增纯化后的cDNA,取标记的扩增产物在ABI PRISM TM 377自动测序仪进行测序。
2 结果
2.1 PT-PCR分析
从胃癌患者的癌组织及其配对于正常组织中提取的PNA经逆转录合成cDNA，经第1轮PCR扩增，电泳均未检测到任何扩增产物，经第2轮PCR扩增后发现，26例配对正常组织均只检测到正常大小的转录本；26例癌组织有7例(26.9%)检测到1～2个分子量较小的异常转录本，其中1例(T8)仅检测到一个异常转录本，其余6例均检测到正常大小的转录本，异常转录本的表达水平比正常大小的转录本低；在7例FHIT基因转录本异常的患者中，5例存在1个异常转录本，2例存在2个异常转录本。
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2.2 cDNA序列分析
选择2例癌组织(T8，T25)的异常转录本，经回收，纯化后进行DNA直接测序，经测序发现，T8中估计大小约400bp的异常转录本缺失FHIT外显子5～7，导致外显子4、8间的融合；T25中估计大小约600bp的异常转录本缺失FHIT外显子4，导致外显子3、5间的融合；所有缺失的起止处均为外显子之间的连接部位，此外，序列分析显示，配对正常组织N8、N25中正常大小的转录本均为野生型FHIT cDNA。
3 讨论
Gemma等发现胃癌中存在FHIT基因点突变[7]，因此，FHIT基因被认为与胃癌有关，但Tamura等报道，采用单步骤PCR在胃癌中未发现异常FHIT转录本[8]，因而，胃癌中FHIT基因的失活机制及其作用仍不清楚。为进一步探讨FHIT基因在胃癌发生中的作用，我们采用PT-PCR及PCR产物直接测序分析了26例胃癌，结果发现26例胃癌组织存在7例异常FHIT转录本，即26.9%存在不同程度的缺失，表明胃癌中异常FHIT转录本的表达是常见的。由于我们使用的RT-PCR巢式扩增检出的仅仅是FHIT基因外显子的异常，所以对胃癌中FHIT基因异常改变的频率估计是保守的。本研究中所有配对正常组织均未检测到异常转录本，与Baffa等的研究结果一致[6]，且配对正常组织N8、N25中正常大小转录本测序证实均为野生型 FHITcDNA，表明胃癌中FHIT转录本的异常是肿瘤特有的，异常FHIT转录本可能成为一个有用的胃癌标志物。本研究显示，所有标本的cDNA经第2轮PCR扩增后才检测到FHIT基因扩增产物，表明FHIT基因普遍低水平表达，且异常FHIT转录本的表达水平常比正常转录本为低，说明异常FHIT转录本难以用单步骤PCR检出，因此，胃癌中FGIT转录本的研究结果不一致的原因可能与PCR方法的不同有关。
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序列分析显示：T8、T25中估计大小约400bp及600bp的转录本分别缺失FHIT外显子5～7、4，说明胃癌FHIT基因常缺失1个或1个以上外显子。异常FHIT转录本缺失的起止处恰巧为外显子之间的连接部位，与文献一致[1，2]。由于外显子5为FHIT基因的第1编码外显子，所以，它的缺失显然尤为重要；外显子4的缺失提示在胃癌的发生中，FHIT基因的非编码区可能发挥某种调控作用，从而影响FHIT基因表达和FHIT蛋白的功能。
癌发生的主要机制之一是抑瘤基因的纯合性缺失。本研究中，7例FHIT基因发生转录本异常的癌组织中有6例同时存在正常大小的的转录本，与文献报道相似[1，2～4]。其原因尚不清楚，可能为肿瘤组织混有正常细胞或肿瘤的异质性所致[3]，也提示FHIT基因的异常可能与经典抑瘤基因的不同。有必要开展对胃癌、癌前病变及正常组织中FHIT蛋白表达和功能的研究，以进一步明确FHIT基因在胃癌发生中的作用。
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总之，FHIT转录本的异常为胃癌中常见的肿瘤特有的改变，FHIT基因与我国部分胃癌的发生有关，并可能在胃癌变过程中扮演重要角色。对胃癌FHIT基因的深人研究有助于揭示胃癌的发病机制，为胃癌的早期诊断、预防及基因治疗提供理论依据。
参考文献：
1 Ohta M,Inoue H,Cotticelli MG,et al.The EHIT gene,spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8)breakpoint,is abnormal in digestive tract cancers.Cell,1996;84:587～597
2 Sozzi G,Veronese ML,Negrini M,et al.The FHIT gene at 3p14.2 is abnoramal in lung cancer.Cell,1996;85:17～26
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3 Negrini M,Monaco C,Vorechovsky I,et al.The FHIT gene at 3p14.2 is abormal in breast carcinomas.Cancer Res,1996;56:3173～3179
4 Greenspan DL,Connolly DC,Wu R,et al.Loss of the FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors.Cancer Res,1997;57:4592～4698
5 J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1996：332～333
6 Baffa R,Veronese ML.Santoro R,et al.Lose of FHIT expression in gastric carcinoma.Cancer Res,1998;58:4708～4714
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7 Gemma A,Hagiwara K,Ke Y,et al.FHIT mutations in human primary gastric cancer.Cancer Res,1997;57:1435～1437
8 Tamura G,Sakata K,Nishizuka S,et al.Analysis of the fragile histidine triad gene in primary gastric carcinomas and gastric carcinoma cell lines.Genes Chromosomes Cancer,1997;20:98～102
(1999-10-11收稿), http://www.100md.com
单位：张桂英 段晓明(湖南医科大学附属湘雅医院消化内科 长沙 410008)；田芳(湖南省肿瘤研究所)
关键词：胃肿瘤；FHIT基因；PT—PCR；cDNA序列分析；基因表达；异常转录本
中国现代医学杂志000303 目的：探讨FHIT基因与胃癌关系。方法：采用PT-PCR及PCR产物直接测序法，对26例胃癌组织及其配对正常组织的FHIT基因进行检测。结果：7例(26.9%)胃癌组织存在异常FHIT转录本的表达，其中1例无正常FHIT转录本的表达；另6例同时存在正常FHIT转录本的表达；配对正常组织均无异常FHIT转录本的表达；测序证实异常转录本缺失1个或1个以上FHIT外显子。结论：FHIT转录本的异常是胃癌中常见的和肿瘤特有的改变，FHIT基因的异常与我国部分胃癌的发生有关。
分类号 R735.2
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ABNORMAL EXPRESSION OF THE FHIT GENE IN
HUMAN PRIMARY GASTRIC CANCERS
Zhang Guiying, Duang Xiaoming, Tian Fang,et al.
(Affiliated Xiangya Hopital of Hunan Medical University, Changsha, Hunan 410008)
Objective: To evaluate the relationship between the FHIT gene and gastric cancers. Methods: Matched normal and cancerous tissues from 26 patients with gastric cancers were analysed by nested RT-PCR and direct sequencing of the products. Results: 7 of 26(26.9%) primary gastric cancers expressed aberrant FHIT transcripts, but no aberrant FHIT transcripts was observed in all the matched normal tissues. Sequence analysis of the aberrant transcripts of 2 cancerous tissues confirmed that aberrant transcripts were missing in one or more exons of the FHIT gene. Conclusion: Expression of aberrant FHIT transcripts is common and tumor-specific in gastric cancers and abnormalities of the FHIT gene transcript are associated with gastric carcinogenesis.
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Key words: Gastric neoplasms； FHIT gene； RT-PCR； cDNA-Sequence analysis； Gene expression； Aberrant transcripts
有关胃癌中FHIT基因与研究国外虽有报导，但结果不一致，国内FHIT基因在胃癌中有无异常尚属未知，为了探讨FHIT基因与胃癌发生的关系，本文采用RT—PCR及PCR产物直接测序检测了胃癌组织及其配对正常组织中FHIT基因的表达。
1 材料与方法
1.1 材料
组织标本：26例胃癌组织及配对正常组织(手术切缘的粘膜)取自湖南医科大学附属湘雅医院 、附属等二医院普外科1997年6月～1998年10月手术切除并经病理证实的胃癌患者。其中男11例，女15例；年龄29～74岁，平均年龄49.8岁。组织学类型；高分化腺癌1例，高-中分化腺癌5例。中-低分化腺癌2例，低分化腺癌8例，未分化腺癌1例，粘液腺癌4例，印戒细胞癌2例，混合型癌3例，术后迅速取材，置液氮中速冻，然后贮存于液氮中待用。
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1.2 方法
1.2.1 总RNA提取 按产品说明书介绍的方法，用TRlzol试剂(GIBCO BRL公司)提取组织的总RNA。
1.2.2 逆转录取1μg总RNA，使用Reverse Transcription System试刘盒(Promega公司)进行逆转录合成cDNA[引物为Oligo(dt)15]。
1.2.3 巢式PCR引物完全参照文献[1]，由上海生物制品研究所合成。引物序列：5U2 5′ATC CTG GAA GCT TTG AAG CTC A-3′，3D2 5′-TCA CTG GTT GAA GAA TAC AGG-3′；5U1 5′-TCC GTA GTG CTA TCT ACA TC-3′，3D1 5′-CAT GCT GAT TCA GTT CCT CTT GG-3′，两对引物扩增产物分别为810 bp、707bp。第1轮PCR：25μl反应体系中含cDNA模板1μl,10xPCR缓冲液2.5μl，2mMdNTPs 1μl,40μ M5U2与3D2混合液0.5μl，Taq酶1.25u；在DNA Thermal Cycler 480 PCR仪(Perkin-Elmer Cetus公司)进行扩增，扩增条件：首先97℃变性5min，然后94℃ 30 s，65℃ 30s，72℃ 30s,25个循环，第2轮PCR：将第1轮扩增产物稀释20倍后取2μl进行第2轮PCR扩增，除反应体积增至50μl,循环数增至30,引物为5U1、3D1外，其余条件均同第1轮。所有标本均至少进行2次巢式PCR，并设置不加cDNA模板的空白对照。
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1.2.4 产物检测 取10μl PCR扩增产物，进行1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴乙锭)电泳(100V，1.5h)，紫外线检测仪上观察并摄影记录。
1.2.5 cDNA序列分析 按文献的方法[5]，取第2轮PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以回收、纯化待测序片段；用下游引物3D1和荧光素标记的dNTPs扩增纯化后的cDNA,取标记的扩增产物在ABI PRISM TM 377自动测序仪进行测序。
2 结果
2.1 PT-PCR分析
从胃癌患者的癌组织及其配对于正常组织中提取的PNA经逆转录合成cDNA，经第1轮PCR扩增，电泳均未检测到任何扩增产物，经第2轮PCR扩增后发现，26例配对正常组织均只检测到正常大小的转录本；26例癌组织有7例(26.9%)检测到1～2个分子量较小的异常转录本，其中1例(T8)仅检测到一个异常转录本，其余6例均检测到正常大小的转录本，异常转录本的表达水平比正常大小的转录本低；在7例FHIT基因转录本异常的患者中，5例存在1个异常转录本，2例存在2个异常转录本。
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2.2 cDNA序列分析
选择2例癌组织(T8，T25)的异常转录本，经回收，纯化后进行DNA直接测序，经测序发现，T8中估计大小约400bp的异常转录本缺失FHIT外显子5～7，导致外显子4、8间的融合；T25中估计大小约600bp的异常转录本缺失FHIT外显子4，导致外显子3、5间的融合；所有缺失的起止处均为外显子之间的连接部位，此外，序列分析显示，配对正常组织N8、N25中正常大小的转录本均为野生型FHIT cDNA。
3 讨论
Gemma等发现胃癌中存在FHIT基因点突变[7]，因此，FHIT基因被认为与胃癌有关，但Tamura等报道，采用单步骤PCR在胃癌中未发现异常FHIT转录本[8]，因而，胃癌中FHIT基因的失活机制及其作用仍不清楚。为进一步探讨FHIT基因在胃癌发生中的作用，我们采用PT-PCR及PCR产物直接测序分析了26例胃癌，结果发现26例胃癌组织存在7例异常FHIT转录本，即26.9%存在不同程度的缺失，表明胃癌中异常FHIT转录本的表达是常见的。由于我们使用的RT-PCR巢式扩增检出的仅仅是FHIT基因外显子的异常，所以对胃癌中FHIT基因异常改变的频率估计是保守的。本研究中所有配对正常组织均未检测到异常转录本，与Baffa等的研究结果一致[6]，且配对正常组织N8、N25中正常大小转录本测序证实均为野生型 FHITcDNA，表明胃癌中FHIT转录本的异常是肿瘤特有的，异常FHIT转录本可能成为一个有用的胃癌标志物。本研究显示，所有标本的cDNA经第2轮PCR扩增后才检测到FHIT基因扩增产物，表明FHIT基因普遍低水平表达，且异常FHIT转录本的表达水平常比正常转录本为低，说明异常FHIT转录本难以用单步骤PCR检出，因此，胃癌中FGIT转录本的研究结果不一致的原因可能与PCR方法的不同有关。
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序列分析显示：T8、T25中估计大小约400bp及600bp的转录本分别缺失FHIT外显子5～7、4，说明胃癌FHIT基因常缺失1个或1个以上外显子。异常FHIT转录本缺失的起止处恰巧为外显子之间的连接部位，与文献一致[1，2]。由于外显子5为FHIT基因的第1编码外显子，所以，它的缺失显然尤为重要；外显子4的缺失提示在胃癌的发生中，FHIT基因的非编码区可能发挥某种调控作用，从而影响FHIT基因表达和FHIT蛋白的功能。
癌发生的主要机制之一是抑瘤基因的纯合性缺失。本研究中，7例FHIT基因发生转录本异常的癌组织中有6例同时存在正常大小的的转录本，与文献报道相似[1，2～4]。其原因尚不清楚，可能为肿瘤组织混有正常细胞或肿瘤的异质性所致[3]，也提示FHIT基因的异常可能与经典抑瘤基因的不同。有必要开展对胃癌、癌前病变及正常组织中FHIT蛋白表达和功能的研究，以进一步明确FHIT基因在胃癌发生中的作用。
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总之，FHIT转录本的异常为胃癌中常见的肿瘤特有的改变，FHIT基因与我国部分胃癌的发生有关，并可能在胃癌变过程中扮演重要角色。对胃癌FHIT基因的深人研究有助于揭示胃癌的发病机制，为胃癌的早期诊断、预防及基因治疗提供理论依据。
参考文献：
1 Ohta M,Inoue H,Cotticelli MG,et al.The EHIT gene,spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8)breakpoint,is abnormal in digestive tract cancers.Cell,1996;84:587～597
2 Sozzi G,Veronese ML,Negrini M,et al.The FHIT gene at 3p14.2 is abnoramal in lung cancer.Cell,1996;85:17～26
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3 Negrini M,Monaco C,Vorechovsky I,et al.The FHIT gene at 3p14.2 is abormal in breast carcinomas.Cancer Res,1996;56:3173～3179
4 Greenspan DL,Connolly DC,Wu R,et al.Loss of the FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors.Cancer Res,1997;57:4592～4698
5 J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1996：332～333
6 Baffa R,Veronese ML.Santoro R,et al.Lose of FHIT expression in gastric carcinoma.Cancer Res,1998;58:4708～4714
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7 Gemma A,Hagiwara K,Ke Y,et al.FHIT mutations in human primary gastric cancer.Cancer Res,1997;57:1435～1437
8 Tamura G,Sakata K,Nishizuka S,et al.Analysis of the fragile histidine triad gene in primary gastric carcinomas and gastric carcinoma cell lines.Genes Chromosomes Cancer,1997;20:98～102
(1999-10-11收稿), http://www.100md.com