高密度培养大肠杆菌TG1/pGEX-hCT和高表达重组人降钙素
作者：窦鸿 李民 毛积芳 陈常庆
单位：窦鸿(第二军医大学基础医生物化学与分子生物教研室，上海 200433)；毛积芳 (第二军医大学基础医生物化学与分子生物教研室，上海 200433)；陈常庆(中国科学院上海生物工程研究中心)；李民(中国科学院上海生物工程研究中心)
关键词：降钙素；表达
第二军医大学学报000305 【摘要】 目的：高密度、高表达培养重组大肠杆菌TG1/pGEX-hCT，生产重组人降钙素(rhCT)。方法和结果：应用NBS BioFlo 3000 型5 L自控发酵罐，采用分批培养和补料分批培养相结合的培养技术，控制碳源和氮源的补加，控制溶解氧，使重组菌E. coli TG1/pGEX-hCT发酵光密度[D(600)]达到58.6，人降钙素和GST融合蛋白(GST-hCT)的含量达到3.2 g/L。结论：本研究为工业化生产重组hCT奠定了基础。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 Q 784 【文献标识码】 A 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0213-03
High cell-density culture of E. coli TG1/pGEX-hCT and high expression of recombinant human calcitonin
DOU Hong MAO Ji-Fang
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
LI Min CHEN Chang-Qing
, 百拇医药
(Shanghai Research Centre of Biotechnology, Academia Sinica)
【ABSTRACT】 Objective: High cell-density and high expression culture of recombinant E. coli TG1/pGEX-hCT to produce recombinant human calcitonin(hCT). Methods and Results: Batch and fed-batch culture were used with the carbon-nitrogen control, DO-stat method in 5 L NBS BioFlo 3000 type autocontrol fermentor was carried out to produce recombinant hCT in E.coli TG1/pGEX-hCT. The final cell density and concentration of GST-hCT fusion protein were 58.6 D(600) and 3.2 g/L. Conclusion: This study provides a basic work for production recombinant hCT in industrial scale.
, http://www.100md.com
【KEY WORDS】 calcitonin; expression▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(3): 213-215]
降钙素(calcitonin)是一个32肽的激素，是由哺乳动物的甲状腺或爬行类和鸟类的后腮旁腺的C细胞分泌的，在调节钙和磷酸盐代谢中起非常重要的作用，能够预防和治疗高血钙症、骨质疏松症。鲑鱼以及人的降钙素(hCT)已经在大肠杆菌中获得了表达。Gigova等[1]采用重复基因表达的多聚hCT，进行了10 L的发酵研究，结果最高产量仅达到44～100 mg/L。Ray等[2]也报道了采用GST融合系统生产降钙素的工艺，10 L发酵的最终光密度[D(600)]只有14，生产率都较低。Yabuta等[3]虽成功地应用了高密度发酵技术，使一系列表达hCT重组菌的发酵光密度[D(600)]达到53～120，但是得到的重组蛋白是包涵体。我们曾报道了hCT的克隆和表达[4]，本研究在此基础上进行了高密度、高表达发酵的研究，为重组hCT的工业化生产创造条件。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒 宿主大肠杆菌E.coli TG1 (sup E hsd Δ5 thi Δ(lac-proAB) F′traD36 proAB+ lacIq lacZ ΔM15) 由中科院典型培养物保藏委员会基因库提供。重组质粒 pGEX-hCT由第二军医大学生化教研室提供，hCT的基因融合在GST的 C 端，受tac启动子的控制，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)能诱导GST-hCT融合蛋白的表达。用该质粒转化宿主菌TG1得到表达hCT的工程菌株E.coli TG1/pGEX-hCT，试管培养中GST-hCT融合蛋白的表达量为28%。
1.2 培养液 LB培养液用作试管种子培养，含2%甘油的2-YT培养液用作二级种子培养，半合成培养液用于发酵罐中补料分批培养。LB培养液和2-YT培养液配方见参考文献[5]；半合成发酵培养液中含有(g/L)：polypepton 5, yeast extract 5,甘油 10，KH2PO4 2，K2HPO4 4，Na2HPO4.12H2O 7，(NH4)2SO4 1.2，NH4Cl 0.2， MgSO4.7H2O 1 和微量元素溶液，该溶液中含有(g/L)：MnSO4.5H2O 0.001，CoCl2.6H2O 0.004，Na2MoO4.2H2O 0.002，ZnCl2 0.002，CuSO4.5H2O 0.001， H3BO4 0.0005， FeSO4.7H2O 0.02， CaCl2.2H2O 0.02；补料基质中有(g/L)：甘油170，yeast extract 71，polypepton 71，MgSO4.7H2O 5.7。
, http://www.100md.com
1.3 菌种的制备 菌种的培养按照参考文献[6]。
1.4 5 L发酵培养 在发酵罐中接150 ml三角瓶二级种子，罐中的起始工作体积为2.5 L。控制的几个关键参数为：溶氧及转速。空气流速设定为每分钟一个发酵体积，搅拌转速控制和溶解氧参数相关联，自动升高或降低10 r/min，使溶解氧控制在35%左右，达到最大转速800 r/min后，自动通入纯氧。
1.5 补料的流加 在进行5 h的分批培养后，将补料的流加分两个阶段进行，发酵过程中5～10 h期间补加进去含50 g甘油的补料，流速设定为100 ml/h；10～15 h加入含100 g甘油的补料，流速为200 ml/h。pH设定为7.0，自动流加30%的氨水保持pH稳定；温度设定为37℃；各数据由微机自动收集和记录。
1.6 菌体浓度、GST-hCT融合蛋白表达量的测定、菌体总蛋白的测定 菌体浓度的分光光度测定波长为600 nm，使用BioRad灰度扫描仪测定电泳条带中目的融合蛋白的含量，菌体总蛋白的测定按BradFord染料法，详见文献[7]。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 降钙素试管培养诱导时间的优化 考察诱导持续时间可以了解外源蛋白在菌体内表达和积累的情况，并据此判断高密度发酵结束的时间。因为重组菌在诱导后，大量的能量会消耗在外源蛋白的表达上，使细菌的生长提前进入衰亡期，不及时收获会造成溶菌。在试管培养中，加入0.1 mmol/L IPTG诱导后每隔0.5 h取样分析外源蛋白的表达情况，结果表明诱导2 h后，表达水平不再提高，5 h后GST-hCT融合蛋白的表达水平有所下降(图1)，菌体密度也开始下降，因此发酵结束时间可以在诱导后的2～4 h，控制在菌体密度开始下降前。
图1 IPTG诱导时间对GST-hCT表达水平的影响
Fig 1 Effects of IPTG induction duration on
, 百拇医药
expression of GST-hCT
Lane 1～11:Induction 0.5～5.5 h
2.2 诱导时IPTG浓度对外源蛋白表达水平的影响 在试管培养至对数生长中期[D(600)=0.6]，加入IPTG至0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 mmol/L不同的终浓度，培养 3 h，最终菌体光密度为1.244，取样用SDS-PAGE检测。结果表明0.01 mmol/L的IPTG就足以诱导启动子完全开放，GST-hCT的表达量和1 mmol/L浓度的IPTG诱导效果相同。考虑到高密度发酵中菌体浓度比试管中高出几十倍，因此要加大诱导剂的强度，结合我们的实际经验，本研究采用1 mmol/L的IPTG。
2.3 5 L发酵罐中E. coli TG1/pGEX-hCT的高密度、高表达培养 发酵过程pH控制在7.0左右，溶解氧在35%左右，转速在7 h左右达到 800 r/min，开始供应纯氧。分批培养5 h后菌体光密度达到6，随后进入10 h的补料培养阶段，菌体生长了近10倍。37℃培养至12 h，加入1 mmol/L IPTG诱导，3 h后菌体的比生长速率明显减小，生长趋势开始减缓，故终止发酵(图2)。最终菌体密度为58.6，相当于23.4 g (DCW)/L，重组蛋白的表达量为28%，融合蛋白含量3.2 g/L。
, 百拇医药
图2 高密度发酵过程中 E. coli TG1/pGEX-hCT
生长曲线和比生长速率
Fig 2 E. coli TG1/pGEX-hCT growth curve and specific
growth rate during high cell density fermentation
○: Cell density; ■: Specific growth rate; Arrow
indicates the induction time
诱导后每隔0.5 h取样分析重组蛋白的表达水平，表达SDS-PAGE(图3)，可见在IPTG加入2 h后，融合蛋白的表达量达到了26%，因此外源蛋白的表达主要集中在2～3 h之间(图4)。
, 百拇医药
图3 GST-hCT表达的SDS-PAGE电泳图
Fig 3 Electrophotogram of SDS-PAGE of
GST-hCT expression
Lane 1～6: GST-hCT expression after induction 0.5～3 h
图4 E. coli TG1/pGEX-hCT诱导后GST-hCT表达
量与诱导时间的关系
Fig 4 Relationship between GST-hCT expression and
, 百拇医药
induction time of E. coli TG1/pGEX-hCT
3 讨 论
在影响外源蛋白表达的诸多因素中，保证细菌代谢产生的有害物质(主要是乙酸)的低含量[6]以及诱导表达时细菌的旺盛生理状态[7]是最为重要的，我们采取的控制养料的流加、保持溶解氧和在对数生长期进行诱导是高密度、高表达发酵取得成功的关键。
高密度发酵技术能够减少培养体积、强化下游分离提取、缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本。微生物的培养按方式不同可分为分批培养、分批补料培养和连续培养3种。传统的分批发酵技术所能得到的菌体密度很低，究其原因是培养过程中营养物质的消耗和有害代谢产物的积累，导致菌体生长速率的降低。连续培养技术通过不断补充新鲜的培养液，同时以同样的速率将培养液从反应器中抽出，消除有害代谢产物对生长的抑制作用，但是也导致培养液成分未充分利用和有用培养物的流失，且由于培养时间长易发生染菌和质粒的丢失。分批补料培养技术则是在培养过程中不断补充培养液，使菌体在较长时间内保持较高的生长速率，从而达到高密度。重组大肠杆菌发酵密度目前可以达到100 g(DCW)/L[6]，我们以往的高密度发酵研究也达到了100 [D(600)]以上，但这往往是以较长的发酵时间和较复杂的控制为代价的。从提高基因工程产品的比生产率的角度讲，本研究采用的发酵技术周期短，产率高而且稳定可靠，更值得推广应用。
, 百拇医药
高密度、高表达发酵技术的应用完全可以满足工业化生产重组hCT的要求。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870170)
作者简介：窦鸿(1967-)，男(汉族)，博士
【参 考 文 献】
[1] Gigova L, Wishart P, Uscheva A, et al. Expression of repetitive human calcitonin genes in Escherichia coli[J]. Biotechnol Appl Biochem, 1989, 11(4):401-412.
[2] Ray ML, Shields PP, van Duyne P, et al. Production of recombinant salmon calcitonin by in vitro amidation of an Escherichia coli produced peptide[J]. Biotechnology, 1993, 11:64-70.
, 百拇医药
[3] Yabuta M, Suzuki Y, Ohsuye K. High expression of a recombinant human calcitonin precursor peptide in Escherichia coli[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1995, 42(5):703-708.
[4] 蔡在龙，窦 鸿，毛积芳,等.人降钙素cDNA的化学合成与克隆[J].第二军医大学学报，1996，17(5):447-449.
[5] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, eds. Molecular cloning. A laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Laboratory Press, 1989. 908-910.
[6] Lee SY. High cell-density culture Escherichia coli[J].Trends Biotechnol, 1996, 14(3):98-105.
[7] 李 民，陈常庆，朴 勤,等. 利用恒溶氧-补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A[J]. 生物工程学报,1998,14(3):270-276.
【收稿日期】 1999-10-13
【修回日期】 2000-01-20, http://www.100md.com
单位：窦鸿(第二军医大学基础医生物化学与分子生物教研室，上海 200433)；毛积芳 (第二军医大学基础医生物化学与分子生物教研室，上海 200433)；陈常庆(中国科学院上海生物工程研究中心)；李民(中国科学院上海生物工程研究中心)
关键词：降钙素；表达
第二军医大学学报000305 【摘要】 目的：高密度、高表达培养重组大肠杆菌TG1/pGEX-hCT，生产重组人降钙素(rhCT)。方法和结果：应用NBS BioFlo 3000 型5 L自控发酵罐，采用分批培养和补料分批培养相结合的培养技术，控制碳源和氮源的补加，控制溶解氧，使重组菌E. coli TG1/pGEX-hCT发酵光密度[D(600)]达到58.6，人降钙素和GST融合蛋白(GST-hCT)的含量达到3.2 g/L。结论：本研究为工业化生产重组hCT奠定了基础。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 Q 784 【文献标识码】 A 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0213-03
High cell-density culture of E. coli TG1/pGEX-hCT and high expression of recombinant human calcitonin
DOU Hong MAO Ji-Fang
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
LI Min CHEN Chang-Qing
, 百拇医药
(Shanghai Research Centre of Biotechnology, Academia Sinica)
【ABSTRACT】 Objective: High cell-density and high expression culture of recombinant E. coli TG1/pGEX-hCT to produce recombinant human calcitonin(hCT). Methods and Results: Batch and fed-batch culture were used with the carbon-nitrogen control, DO-stat method in 5 L NBS BioFlo 3000 type autocontrol fermentor was carried out to produce recombinant hCT in E.coli TG1/pGEX-hCT. The final cell density and concentration of GST-hCT fusion protein were 58.6 D(600) and 3.2 g/L. Conclusion: This study provides a basic work for production recombinant hCT in industrial scale.
, http://www.100md.com
【KEY WORDS】 calcitonin; expression▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(3): 213-215]
降钙素(calcitonin)是一个32肽的激素，是由哺乳动物的甲状腺或爬行类和鸟类的后腮旁腺的C细胞分泌的，在调节钙和磷酸盐代谢中起非常重要的作用，能够预防和治疗高血钙症、骨质疏松症。鲑鱼以及人的降钙素(hCT)已经在大肠杆菌中获得了表达。Gigova等[1]采用重复基因表达的多聚hCT，进行了10 L的发酵研究，结果最高产量仅达到44～100 mg/L。Ray等[2]也报道了采用GST融合系统生产降钙素的工艺，10 L发酵的最终光密度[D(600)]只有14，生产率都较低。Yabuta等[3]虽成功地应用了高密度发酵技术，使一系列表达hCT重组菌的发酵光密度[D(600)]达到53～120，但是得到的重组蛋白是包涵体。我们曾报道了hCT的克隆和表达[4]，本研究在此基础上进行了高密度、高表达发酵的研究，为重组hCT的工业化生产创造条件。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒 宿主大肠杆菌E.coli TG1 (sup E hsd Δ5 thi Δ(lac-proAB) F′traD36 proAB+ lacIq lacZ ΔM15) 由中科院典型培养物保藏委员会基因库提供。重组质粒 pGEX-hCT由第二军医大学生化教研室提供，hCT的基因融合在GST的 C 端，受tac启动子的控制，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)能诱导GST-hCT融合蛋白的表达。用该质粒转化宿主菌TG1得到表达hCT的工程菌株E.coli TG1/pGEX-hCT，试管培养中GST-hCT融合蛋白的表达量为28%。
1.2 培养液 LB培养液用作试管种子培养，含2%甘油的2-YT培养液用作二级种子培养，半合成培养液用于发酵罐中补料分批培养。LB培养液和2-YT培养液配方见参考文献[5]；半合成发酵培养液中含有(g/L)：polypepton 5, yeast extract 5,甘油 10，KH2PO4 2，K2HPO4 4，Na2HPO4.12H2O 7，(NH4)2SO4 1.2，NH4Cl 0.2， MgSO4.7H2O 1 和微量元素溶液，该溶液中含有(g/L)：MnSO4.5H2O 0.001，CoCl2.6H2O 0.004，Na2MoO4.2H2O 0.002，ZnCl2 0.002，CuSO4.5H2O 0.001， H3BO4 0.0005， FeSO4.7H2O 0.02， CaCl2.2H2O 0.02；补料基质中有(g/L)：甘油170，yeast extract 71，polypepton 71，MgSO4.7H2O 5.7。
, http://www.100md.com
1.3 菌种的制备 菌种的培养按照参考文献[6]。
1.4 5 L发酵培养 在发酵罐中接150 ml三角瓶二级种子，罐中的起始工作体积为2.5 L。控制的几个关键参数为：溶氧及转速。空气流速设定为每分钟一个发酵体积，搅拌转速控制和溶解氧参数相关联，自动升高或降低10 r/min，使溶解氧控制在35%左右，达到最大转速800 r/min后，自动通入纯氧。
1.5 补料的流加 在进行5 h的分批培养后，将补料的流加分两个阶段进行，发酵过程中5～10 h期间补加进去含50 g甘油的补料，流速设定为100 ml/h；10～15 h加入含100 g甘油的补料，流速为200 ml/h。pH设定为7.0，自动流加30%的氨水保持pH稳定；温度设定为37℃；各数据由微机自动收集和记录。
1.6 菌体浓度、GST-hCT融合蛋白表达量的测定、菌体总蛋白的测定 菌体浓度的分光光度测定波长为600 nm，使用BioRad灰度扫描仪测定电泳条带中目的融合蛋白的含量，菌体总蛋白的测定按BradFord染料法，详见文献[7]。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 降钙素试管培养诱导时间的优化 考察诱导持续时间可以了解外源蛋白在菌体内表达和积累的情况，并据此判断高密度发酵结束的时间。因为重组菌在诱导后，大量的能量会消耗在外源蛋白的表达上，使细菌的生长提前进入衰亡期，不及时收获会造成溶菌。在试管培养中，加入0.1 mmol/L IPTG诱导后每隔0.5 h取样分析外源蛋白的表达情况，结果表明诱导2 h后，表达水平不再提高，5 h后GST-hCT融合蛋白的表达水平有所下降(图1)，菌体密度也开始下降，因此发酵结束时间可以在诱导后的2～4 h，控制在菌体密度开始下降前。
图1 IPTG诱导时间对GST-hCT表达水平的影响
Fig 1 Effects of IPTG induction duration on
, 百拇医药
expression of GST-hCT
Lane 1～11:Induction 0.5～5.5 h
2.2 诱导时IPTG浓度对外源蛋白表达水平的影响 在试管培养至对数生长中期[D(600)=0.6]，加入IPTG至0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 mmol/L不同的终浓度，培养 3 h，最终菌体光密度为1.244，取样用SDS-PAGE检测。结果表明0.01 mmol/L的IPTG就足以诱导启动子完全开放，GST-hCT的表达量和1 mmol/L浓度的IPTG诱导效果相同。考虑到高密度发酵中菌体浓度比试管中高出几十倍，因此要加大诱导剂的强度，结合我们的实际经验，本研究采用1 mmol/L的IPTG。
2.3 5 L发酵罐中E. coli TG1/pGEX-hCT的高密度、高表达培养 发酵过程pH控制在7.0左右，溶解氧在35%左右，转速在7 h左右达到 800 r/min，开始供应纯氧。分批培养5 h后菌体光密度达到6，随后进入10 h的补料培养阶段，菌体生长了近10倍。37℃培养至12 h，加入1 mmol/L IPTG诱导，3 h后菌体的比生长速率明显减小，生长趋势开始减缓，故终止发酵(图2)。最终菌体密度为58.6，相当于23.4 g (DCW)/L，重组蛋白的表达量为28%，融合蛋白含量3.2 g/L。
, 百拇医药
图2 高密度发酵过程中 E. coli TG1/pGEX-hCT
生长曲线和比生长速率
Fig 2 E. coli TG1/pGEX-hCT growth curve and specific
growth rate during high cell density fermentation
○: Cell density; ■: Specific growth rate; Arrow
indicates the induction time
诱导后每隔0.5 h取样分析重组蛋白的表达水平，表达SDS-PAGE(图3)，可见在IPTG加入2 h后，融合蛋白的表达量达到了26%，因此外源蛋白的表达主要集中在2～3 h之间(图4)。
, 百拇医药
图3 GST-hCT表达的SDS-PAGE电泳图
Fig 3 Electrophotogram of SDS-PAGE of
GST-hCT expression
Lane 1～6: GST-hCT expression after induction 0.5～3 h
图4 E. coli TG1/pGEX-hCT诱导后GST-hCT表达
量与诱导时间的关系
Fig 4 Relationship between GST-hCT expression and
, 百拇医药
induction time of E. coli TG1/pGEX-hCT
3 讨 论
在影响外源蛋白表达的诸多因素中，保证细菌代谢产生的有害物质(主要是乙酸)的低含量[6]以及诱导表达时细菌的旺盛生理状态[7]是最为重要的，我们采取的控制养料的流加、保持溶解氧和在对数生长期进行诱导是高密度、高表达发酵取得成功的关键。
高密度发酵技术能够减少培养体积、强化下游分离提取、缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本。微生物的培养按方式不同可分为分批培养、分批补料培养和连续培养3种。传统的分批发酵技术所能得到的菌体密度很低，究其原因是培养过程中营养物质的消耗和有害代谢产物的积累，导致菌体生长速率的降低。连续培养技术通过不断补充新鲜的培养液，同时以同样的速率将培养液从反应器中抽出，消除有害代谢产物对生长的抑制作用，但是也导致培养液成分未充分利用和有用培养物的流失，且由于培养时间长易发生染菌和质粒的丢失。分批补料培养技术则是在培养过程中不断补充培养液，使菌体在较长时间内保持较高的生长速率，从而达到高密度。重组大肠杆菌发酵密度目前可以达到100 g(DCW)/L[6]，我们以往的高密度发酵研究也达到了100 [D(600)]以上，但这往往是以较长的发酵时间和较复杂的控制为代价的。从提高基因工程产品的比生产率的角度讲，本研究采用的发酵技术周期短，产率高而且稳定可靠，更值得推广应用。
, 百拇医药
高密度、高表达发酵技术的应用完全可以满足工业化生产重组hCT的要求。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870170)
作者简介：窦鸿(1967-)，男(汉族)，博士
【参 考 文 献】
[1] Gigova L, Wishart P, Uscheva A, et al. Expression of repetitive human calcitonin genes in Escherichia coli[J]. Biotechnol Appl Biochem, 1989, 11(4):401-412.
[2] Ray ML, Shields PP, van Duyne P, et al. Production of recombinant salmon calcitonin by in vitro amidation of an Escherichia coli produced peptide[J]. Biotechnology, 1993, 11:64-70.
, 百拇医药
[3] Yabuta M, Suzuki Y, Ohsuye K. High expression of a recombinant human calcitonin precursor peptide in Escherichia coli[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1995, 42(5):703-708.
[4] 蔡在龙，窦 鸿，毛积芳,等.人降钙素cDNA的化学合成与克隆[J].第二军医大学学报，1996，17(5):447-449.
[5] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, eds. Molecular cloning. A laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Laboratory Press, 1989. 908-910.
[6] Lee SY. High cell-density culture Escherichia coli[J].Trends Biotechnol, 1996, 14(3):98-105.
[7] 李 民，陈常庆，朴 勤,等. 利用恒溶氧-补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A[J]. 生物工程学报,1998,14(3):270-276.
【收稿日期】 1999-10-13
【修回日期】 2000-01-20, http://www.100md.com