一种简便的蛋白质N端氨基酸测定方法
作者：张平武 魏林 项洪刚 孙树汉
单位：张平武(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)；魏林(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)；项洪刚(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海 200433)；孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
关键词：氨基酸序列；氨基酸N端
第二军医大学学报000333 【中图分类号】 R 【文献标识码】 B 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0253-02▲
蛋白质(或多肽)的两端氨基酸序列测定是分析未知蛋白质的结构和功能的基础。目前蛋白质N端序列分析的技术已较为成熟，可达20～40个氨基酸残基，但由于N端氨基酸序列分析成本高(1 400～4 000元/次)，不大可能反复多次检测。有些多肽N端氨基酸是封闭的，降解后才能进行氨基酸序列分析。如果事先知道N端氨基酸是否封闭，一方面有利于选择序列分析的方式(N端、C端或降解后测序)，另一方面可节省费用，也利于测序结果的分析。一个结构未知的酵母分泌蛋白，其相对分子质量为7.9×104，我们在分析其结构时采用DNS-Cl法对其N端氨基酸进行了测定，知其N端未封闭，然后进行氨基酸序列分析，取得了很好的效果。
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1 材料和方法
1.1 样品和试剂 经SephadexG100和DEAE-52柱层析纯化后的酵母分泌蛋白质[1]，相对分子质量为7.9×104，其他为国产分析纯试剂。
1.2 反应 取400 μg纯化蛋白质，溶于50 μl (0.2 mol/L)的NaHCO3溶液，用1 mol/L NaOH调pH 10.0，加去离子水定容至250 μl。在一小指管内加入上述溶液及200 μl DNS-Cl丙酮液(2.5 mg/ml),石蜡膜封口，40℃温育55 min。真空抽干2 h。在管内加入0.2 ml 6 mol/L HCl后将管口密封，10℃水解反应12 h。真空抽干后加入2滴0.2 mol/L NaHCO3,并用1 mol/L HCl调pH至2.5，加入乙酸乙酯5滴，稍加摇动,DNS-N端氨基酸即在乙酸乙酯层[2]。
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1.3 两相层析 在聚酰胺薄膜上点样,第一相甲酸∶水(1.5∶100)，第二相苯∶冰乙酸(9∶1)层析。
2 结 果
2.1 DNS-Cl法测定N端氨基酸 在紫外灯下(253 nm)观察，可见聚酰胺薄膜上有3个色斑点：左下角的蓝色斑点为DNS-OH，左上角的黄绿色斑点为DNS-氨基酸，右边的蓝绿色斑点为DNS-NH2。由于薄膜上只有一个黄绿色的DNS-氨基酸斑点，可以确定该蛋白的N端是均一的，没有封闭，对照标准的层析图提示末端残基可能为天冬氨酸或精氨酸，从而可以进行N端氨基酸自动分析(图1)。
2.2 N端氨基酸全自动序列分析 全自动氨基酸序列分析测出N端22个氨基酸残基, 结果证实N端为天冬氨酸残基。序列为：N′-Asp Gly Asp Ser Lys Ala Ile Thr Glu Thr Thr Phe Ser Leu Asn Arg Pro Ser Val His Phe Thr -C′。
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图1 7.9×104蛋白N端氨基酸分析
最低点：DNS-OH; 最高点：DNS-AA； 右边点：DNS-NH2；
↑：第一次层析的方向；→：第二次层析的方向
3 讨 论
N端氨基酸序列自动分析是分析氨基酸一级结构的首选方法，但价格昂贵，测序结果不理想时难以判断究竟是测序过程的原因还是末端封闭的原因。确定其N端氨基酸是否封闭有利于分析测序失败的原因。有一实验室测某个蛋白质N端氨基酸序列，测了7次均不理想，开始总在蛋白质纯化环节找原因，最后推测N端可能是封闭的，遂改用其他测序方法，取得了预期结果。利用DNS-Cl法测定N端氨基酸方法简单，成本低，结果可靠，不仅可以确定N端氨基酸是否封闭，也可以初步确定N端为哪一个氨基酸残基。
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另外，如果蛋白质的纯度不够，可将蛋白质先进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜后切下相应条带，再进行N端氨基酸序列分析,这样可以确保其纯度符合测序要求。■
作者简介：张平武(1965-),男(汉族),博士,讲师
【参 考 文 献】
[1] 陈远聪，吴克佐，罗珊珊. 聚酰胺薄膜层析及其用于蛋白质化学分析[J]. 生物化学与生物物理进展，1975,1(1):38-40.
[2] Manzoni M, Cavazzoni V. Purification and characterization of the extracellular inulinase from Kluyveromyces cicerisporus[J]. Lebensm Wiss U. Technol，1991, 24(3):236-240.
【收稿日期】 1999-10-16
【修回日期】 1999-12-22, http://www.100md.com
单位：张平武(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)；魏林(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)；项洪刚(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海 200433)；孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
关键词：氨基酸序列；氨基酸N端
第二军医大学学报000333 【中图分类号】 R 【文献标识码】 B 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0253-02▲
蛋白质(或多肽)的两端氨基酸序列测定是分析未知蛋白质的结构和功能的基础。目前蛋白质N端序列分析的技术已较为成熟，可达20～40个氨基酸残基，但由于N端氨基酸序列分析成本高(1 400～4 000元/次)，不大可能反复多次检测。有些多肽N端氨基酸是封闭的，降解后才能进行氨基酸序列分析。如果事先知道N端氨基酸是否封闭，一方面有利于选择序列分析的方式(N端、C端或降解后测序)，另一方面可节省费用，也利于测序结果的分析。一个结构未知的酵母分泌蛋白，其相对分子质量为7.9×104，我们在分析其结构时采用DNS-Cl法对其N端氨基酸进行了测定，知其N端未封闭，然后进行氨基酸序列分析，取得了很好的效果。
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1 材料和方法
1.1 样品和试剂 经SephadexG100和DEAE-52柱层析纯化后的酵母分泌蛋白质[1]，相对分子质量为7.9×104，其他为国产分析纯试剂。
1.2 反应 取400 μg纯化蛋白质，溶于50 μl (0.2 mol/L)的NaHCO3溶液，用1 mol/L NaOH调pH 10.0，加去离子水定容至250 μl。在一小指管内加入上述溶液及200 μl DNS-Cl丙酮液(2.5 mg/ml),石蜡膜封口，40℃温育55 min。真空抽干2 h。在管内加入0.2 ml 6 mol/L HCl后将管口密封，10℃水解反应12 h。真空抽干后加入2滴0.2 mol/L NaHCO3,并用1 mol/L HCl调pH至2.5，加入乙酸乙酯5滴，稍加摇动,DNS-N端氨基酸即在乙酸乙酯层[2]。
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1.3 两相层析 在聚酰胺薄膜上点样,第一相甲酸∶水(1.5∶100)，第二相苯∶冰乙酸(9∶1)层析。
2 结 果
2.1 DNS-Cl法测定N端氨基酸 在紫外灯下(253 nm)观察，可见聚酰胺薄膜上有3个色斑点：左下角的蓝色斑点为DNS-OH，左上角的黄绿色斑点为DNS-氨基酸，右边的蓝绿色斑点为DNS-NH2。由于薄膜上只有一个黄绿色的DNS-氨基酸斑点，可以确定该蛋白的N端是均一的，没有封闭，对照标准的层析图提示末端残基可能为天冬氨酸或精氨酸，从而可以进行N端氨基酸自动分析(图1)。
2.2 N端氨基酸全自动序列分析 全自动氨基酸序列分析测出N端22个氨基酸残基, 结果证实N端为天冬氨酸残基。序列为：N′-Asp Gly Asp Ser Lys Ala Ile Thr Glu Thr Thr Phe Ser Leu Asn Arg Pro Ser Val His Phe Thr -C′。
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图1 7.9×104蛋白N端氨基酸分析
最低点：DNS-OH; 最高点：DNS-AA； 右边点：DNS-NH2；
↑：第一次层析的方向；→：第二次层析的方向
3 讨 论
N端氨基酸序列自动分析是分析氨基酸一级结构的首选方法，但价格昂贵，测序结果不理想时难以判断究竟是测序过程的原因还是末端封闭的原因。确定其N端氨基酸是否封闭有利于分析测序失败的原因。有一实验室测某个蛋白质N端氨基酸序列，测了7次均不理想，开始总在蛋白质纯化环节找原因，最后推测N端可能是封闭的，遂改用其他测序方法，取得了预期结果。利用DNS-Cl法测定N端氨基酸方法简单，成本低，结果可靠，不仅可以确定N端氨基酸是否封闭，也可以初步确定N端为哪一个氨基酸残基。
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另外，如果蛋白质的纯度不够，可将蛋白质先进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜后切下相应条带，再进行N端氨基酸序列分析,这样可以确保其纯度符合测序要求。■
作者简介：张平武(1965-),男(汉族),博士,讲师
【参 考 文 献】
[1] 陈远聪，吴克佐，罗珊珊. 聚酰胺薄膜层析及其用于蛋白质化学分析[J]. 生物化学与生物物理进展，1975,1(1):38-40.
[2] Manzoni M, Cavazzoni V. Purification and characterization of the extracellular inulinase from Kluyveromyces cicerisporus[J]. Lebensm Wiss U. Technol，1991, 24(3):236-240.
【收稿日期】 1999-10-16
【修回日期】 1999-12-22, http://www.100md.com