能与HBV－DNA C启动子结合成三链结构的寡核苷酸的设计与筛选
作者：光丽霞 李为明 顾长海 袁发焕 陈国致 奚敏
单位：光丽霞(第三军医大学 附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；李为明(第三军医大学 附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；奚敏(第三军医大学 附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；顾长海(第三军医大学 附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；陈国致(第三军医大学 附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；袁发焕(第三军医大学 附属新桥医院肾内科，重庆 400037)
关键词：乙型肝炎病毒；三链DNA；寡核苷酸；启动子
第三军医大学学报000306
提 要 目的：筛选出能与HBV-DNA C启动子形成三链结构的高亲和力寡核苷酸。方法：以体外合成的32P标记的HBV-DNA C启动子区序列(1 734～1 754)为靶序列，合成5种有可能与该靶序列形成三链结构的寡核苷酸链(TFO)，同时设计对照靶序列和对照TFO，用凝胶滞留试验、酶足迹试验等方法对比分析这些TFO与靶序列是否形成三链结构及其结合的亲和性、特异性。结果：在37°C、pH7.4条件下，CT-TFO和GT-TFOp与32P-靶序列DNA结合的亲和力十分微弱，其Kd均>10-6mol/L；GT-TFOap和AG-TFOs与靶序列DNA结合的亲和力较高，Kd分别为5×10-7mol/L和2.5×10-8mol/L；AG-TFO1与靶序列结合的亲和力最高，Kd为3 ×10-9mol/L，而且两者的结合具有序列特异性。结论：含AG或GT的TFO可与HBV C启动子区类同聚嘌呤链逆平行方向结合成三链DNA，其中AG-TFO1与靶序列结合的亲和力最高，反应完全，可使靶双链DNA均转变成三链DNA，经一定修饰后，可试用于HBV基因转录抑制实验。
, 百拇医药
中图法分类号 R373.21；R394 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0220-04
Design and screening of oligonucleotides forming triplex through binding with homopurine in HBVDNA core promoter
GUANG Li-xia, LI Wei-min, GU Chang-hai, YUAN Fa-huan, CHEN Guo-zhi, XI Min
(Department of Pediatrics, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
, 百拇医药
Abstract Objective: To find oligodeoxyribonucleotides that can bind with HBV core promoter target site with high affinity and specificity. Methods: Similar homopurine domain (1 734～1 754) in HBV core promoter was chosen as the target sequence. Several corresponding oligodeoxyribonucleotides were synthesized. The binding affinity and specificity of the nucleotides were tested by electrophoretic mobility shift and DNase 1 footprinting assay. Results: At 37℃ and pH7.4, CT-TFO and GTTFOp could not bind with the target sequence with Kd values>10-6mol/L. GT-TFOap and AGTFOs could bind with the target sequence with Kd values of 5×10-7mol/L and 2.5×10-8mol/L respectively. AG-TFO1 had the highest affinity among the 5 kinds of oligodexyribonucleotides with a Kd value of 3×10-9mol/L in a sequencedependent manner. Conclusion: TFO containing AG or GT can bind with antiparallel homopurine in HBV core promoter to form triple helix. AG-TFO1 might be the best candidate among all the oligodeoxyribonucleotides designed in this study to inhibit HBV gene transcription.
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Key words hepatitis B virus; triplex DNA; oligonucleotide; promotor
某些寡核苷酸不仅能与其互补的单链核酸结合成双链结构，还能与双链核酸中含丰富嘌呤碱基的区域(同聚嘌呤区)，以序列特异方式结合成三链结构。这种能形成三链结构的寡核苷酸(Triple helix-forming oligonucleotide,TFO)通过Hoogsteen或逆Hoogsteen氢键与双链靶DNA同聚嘌呤区相互作用，缠绕于DNA的深沟内， 并可阻止靶DNA与核酸聚合酶、转录因子等蛋白结合，抑制靶基因复制和表达[1]。TFO使人工调控特定基因表达成为可能，为难治性DNA病毒感染的治疗展示了一个新的方向。鉴于目前尚无根治乙型肝炎病毒感染的理想药物，本实验设计多种理论上有可能与 HBV-DNA C启动子区序列形成三链结构的TFO，观察其与HBV-DNA C启动子区序列结合的亲和性、特异性、筛选最佳TFO，为进一步的HBV基因转录抑制实验奠定基础，探索治疗HBV感染的新方法。
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1 材料与方法
1.1 寡核苷酸的合成
在Gibco BRL公司以亚磷酰胺三脂固相法合成图1所示的脱氧寡核苷酸，经C-18反相柱、聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
图1 靶序列和寡聚核苷酸序列
Fig 1 The sequence of targets and TFOs
1.2 靶DNA片段的标记和纯化
分别取两对上述合成的互补寡核苷酸(Target1和Target2)的正链和副链各500 pmol，混合，加5 mol/L NaCl 4 μl、无菌超纯水84 μl，75°C水浴12 min，逐渐冷至25°C，使互补的寡核苷酸杂交成双链靶DNA，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测证实杂交完全。然后以3′末端填充法标记靶DNA：取靶DNA 40 pmol,加20 μCi[α-32P]dCTP(～3 000 Ci/mmol),10 mmol/L dATP、dGTP、dTTP各1 μl，大肠杆菌DNA聚合酶I klenow片段10 U,补充无菌超纯水使反应总体积达20 μl，30°C温育30 min，加0.5 mol/L EDTA 1 μl终止反应，然后以Sephadex G50柱层析纯化标记的靶DNA片段，并以荧光分光光度法测标记靶DNA浓度，用FH液体闪烁计数器测其放射活性，估算靶DNA放射比活性。
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1.3 三链DNA形成及凝胶滞留试验
32P标记靶DNA片段1 pmol(1 300 cpm)与不同终浓度的各种TFO混合于三链DNA结合缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH7.4，10 mmol/L MgCl2，10%蔗糖)中，反应总体积10 μl，37°C水浴过夜。结合反应产物点样于15%聚丙酰胺凝胶(丙烯酰胺∶亚甲双丙烯酰胺=19∶1)上，用TEM10电泳缓冲液(89 mmol/L Tris硼酸pH8,10 mmol/L MgCl2)，在4°C环境中电泳(9 V/cm)过夜。然后进行凝胶放射自显影，并用薄层扫描仪测X线显影带的光密度。
1.4 三链DNA解离常数的计算
参照文献[2]，按下列公式计算三链DNA解离常数(Kd)：
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式中triplex为三链DNA，duplex为双链DNA，[]表示终浓度，当寡核苷酸与靶序列结合，反应体系中[triplex]=[duplex]时(即薄层扫描显示X线片中三链DNA与双链DNA条带的光密度值相等)，Kd=[TFO]，由于反应体系中[TFO]>>[triplex]，反应平衡后的TFO的终浓度的近似于其反应初浓度，故Kd值约等于反应体系中所加入的TFO浓度。
参照Olivas的方法[3]，以本实验体系最好的TFO为参考基准，计算各TFO与靶序列结合的相对亲和力(Relative affinity)：
式中Kd.best TFO为本实验体系中筛选出的最好的TFO与靶序列杂交形成的三链DNA的解离常数，Kd.exp TFO为本实验所测各TFO与靶序列杂交形成的三链DNA的解离常数。
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1.5 酶足迹试验
三链DNA结合反应方法同凝胶滞留试验，取结合反应产物8 μl，加DNase 1(终浓度15 U/ml)、消化1 min，加98%去离子甲酰胺-10 mol/L EDTA-0.25%二甲苯青FF液5 μl终止反应，90°C水浴变性5 min，点样于12%变性聚丙酰胺凝胶上，以1 800 V恒电压，电泳2 h，抽干凝胶，进行放射自显影。同时按快速Maxam-Gilbort测序法测靶DNA的A+G序列。
2 结果
2.1 靶序列的选择与寡核苷酸的设计
本研究寡核苷酸设计满足以下两个条件：1位于基因调控区(HBV C启动子)；2TFO的靶序列类似于同聚嘌呤序列(1734～1754)。
设计TFO时我们注意到了碱基配对方式对碱基三联体稳定性的影响，为避免非典型三联体形成，我们针对纯同聚嘌呤区(1 744～1 754)，以碱基配对标准方式，合成了4条11 nt寡核苷酸；为了考察增加TFO长度对三链DNA形成的影响，还合成了1条21 nt寡核苷酸，为排除TFO与双链DNA非特异性结合的可能性，同时合成无关靶序列2和TFOc作为对照，见图1。
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2.2 TFO与靶序列结合情况及亲和力
在37°C、pH7.4环境中，分别将5种TFO以渐增浓度(0，5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×10-8，5×10-8，2.5×10-7，5×10-7，2.5×10-6，5×10-6 mol/L)与1 pmol32P标记靶序列(target1)杂交，用聚丙酰胺凝胶电泳分离，然后进行放射自显影。结果：①CT-TFO、GT-TFOp在本实验所设计的浓度范围内均不能与靶序列结合{只见双链靶DNA带(duplex)，无三链DNA带出现}；②GT-TFOap达5×10-8、AG-TFOs在2.5×10-9、AG-TFO1达2.5×10-9 mol/L以上时，即能与32P-靶DNA结合{在双链靶DNA带后方，出现三链DNA带(triplex)}；③当GT-TFOap和AG-TFOs浓度达最高值时，三链DNA带前方仍然存在双链DNA带；④当AG-TFO1浓度达2.5×10-8 mol/L时，双链DNA带消失，只有三链DNA带存在，见图2。
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图2 凝胶滞留试验结果
1道：对照32P-靶序列2，无TFO；2道：对照32P-靶序列2与5×10-6 mol/L的AG-TFOl杂交；
3道：32P-靶序列1与TFOc杂交；4道：32P-靶序列1，无TFO；
5～11道：32P-靶序列1与渐增浓度(5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×108，5×108 mol/L)的AG-TFOl杂交
Fig 2 The results of gel mobillty shift assay
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Lane 1：32P-labeled target 2(lpmol) without TFO.
Lane 2:32P-labeled target 2(lpmol) were hybridized
with AG-TFOl(5×10-6 mol/L). Lane 3:32P-labeled target 1(1pmol)
were hybridized with TFOc. Lane 4:32P-labeled target 1 (1pmol)
without TFO. Lane 5～11:32P-labeled target 1 (1pmol) were hybridized
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with increasing molar concentration (5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×10-8，5×10-8 mol/L) AG-TFOl
用薄层扫描仪分析X线片显影带的光密度，按前述方法计算出各TFO与靶序列形成三链DNA的解离常数及相对亲和力，见表1。结果显示，在37°C、pH7.4条件下，CT-TFO、GT-TFOp与32P-靶DNA结合的亲和力十分微弱，其Kd均>>10-6mol/L，即使寡核苷酸浓度高达10-6mol/L，仍不能与靶序列结合成三链DNA。在相同条件下，GT-TFOap、AG-TFOs与靶序列结合的亲和力较高；Kd分别为5×10-7mol/L，2.5×10-8mol/L。四条短寡核苷酸中AG-TFOs的Kd值最低，提示其与靶序列结合的亲和力相对较高。与短AG寡核苷酸相比，21 ntAG寡核苷酸与靶序列结合的亲和力更高，Kd为3×10-9mol/L。
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表1 三链DNA解离常数值和TFO与靶序列的相对亲和力
Tab1 Triplex Kd values and relative affinity TFO
Kd(mol/L)
Relative affinity
CT-TFO
>>5×10-6
<<0.0006
GT-TFOp
>>5×10-6
<<0.0006
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GT-TFOap
5×10-7
0.006
AG-TFOs
2.5×10-8
0.12
AG-TFO1
3×10-9
1
2.3 TFO与靶序列结合的特异性
凝胶留滞试验结果显示(见图2)，对照寡核苷酸不能与靶序列(targetl)杂交成三链DNA(lane 3)；5×10-6mol/L AG-TFOl也不能与对照靶序列(target 2)杂交成三链DNA(lane 2)。对AG-TFO1与靶序列形成的三链DNA作酶足迹试验，经DNA酶切后电泳，放射显影结果显示见图3。在靶序列纯同聚嘌呤区，随着AG-TFOl浓度增高，逐渐形成一清晰的足迹(无DNA条带)，但在三链DNA中部的两个非典型碱基三联体处仍可见DNA条带；对照寡核苷酸则无足迹效应(有DNA条带)。
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图3 酶足迹试验结果
1道：32P-靶序列1与对照TFOc杂交；2道：32P-靶序列1，无TFO；
3～9道：32P-靶序列1与渐增浓度(5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×10-8,5×10-8 mol/L)的AG-TFOl杂交；
10、11道：32P-靶序列1的A+G序列
Fig 3 The results of DNase 1 footprinting analysis
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Lane 1:32P-labeled larget 1(1pmole) were hybridized with TFOc.
Lane2:32P-labeled target 1(1pmole) without TFO.
Lane 3～9:32P-labeled target 1(1 pmole) were hybridized with
increasing molar concentration (5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×10-8，5×10-8 mol/L) AG-TFOl.
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Lane 10 and 11:A+G sequence of 32P-labeled target 1
3 讨论
HBV C启动子负责调控前基因组RNA和前C mRNA的转录，而前基因组RNA不仅是翻译HBV核壳蛋白，HBV-DNA多聚酶的信息RNA，也是逆转录复制HBV的模板，阻断该区可阻止HBVDNA的转录和复制，故我们选择此区类似同聚嘌呤序列(1 734～1 745)为靶位点。
本实验合成的寡核苷酸分为二类，嘧啶型寡核苷酸(CT-TFO)和嘌呤型寡核苷酸(AG-TFO和GT-TFO)。理论上，嘧啶型寡核苷酸能与靶序列嘌呤链中的嘌呤间形成Hoogsteen氢键而形成三链DNA；但本实验结果表明，在生理温度和pH范围内，CT-TFO不能与靶序列结合，可能与本实验的pH值高于该类寡核苷酸所要求的酸性环境有关[5]，说明未经改造或修饰的CT-TFO不适用于生理条件下的HBV转录抑制实验。本实验两条GT-TFO(GT-TFOp，GT-TFOap)所含碱基数目和碱基排列顺序完全相同，但方向相反，GT-TFOp与靶链的方向平行，GT-TFOap与靶链的方向逆平行；理论上，含GT的TFO能通过Hoogsteen或逆Hoogsteen氢键平行或逆平行地与靶序列嘌呤链结合；但本实验结果显示，GT-TFOap能与靶序列结合，而GT-TFOp则否，可能与这两条GT-TFO含成串的G有关，因含成串G的TFO易与靶序列同聚嘌呤链逆平行方向结合[1]。本研究表明，AG-TFOs亦可与靶序列结合。比较AG-TFOs和GT-TFOap这两条11 nt寡核苷酸与靶序列的亲和力，AG-TFOs高于GT-TFOap，说明在四种短TFO中，以AG-TFOs最好。
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在从4条11 nt寡核苷酸中筛选出最好的AG-TFOs的基础上，我们进一步延长AG-TFOs长度至21 nt，以探讨TFO长度对TFO与靶序列结合的亲和力和特异性的影响，结果表明21 nt AG-TFO与靶序列结合的亲和力相当于11 ng AG-TFOs的8.3倍，提示在一定范围内，增加TFO链长度，有助于提高TFO与靶序列结合的亲和力。
对AG-TFOl与靶序列形成的三链DNA作酶足迹试验结果显示，在纯同聚嘌呤区有清晰的足迹(无DNA条带)，说明此段三链DNA中的典型碱基三联体结合牢固，从而保护靶链，不为DNA酶所切开；但在靶序列中部的两个胸腺嘧啶处，却无足迹形成(有DNA条带)，说明此处的非典型碱基三联体(C*TA)结合松散，对DNA酶抵抗力弱，不能保护靶链，尽管我们选择了在非典型碱基三联体中最稳定的胞嘧啶与胸腺嘧啶的配对方式[4]。提示在设计TFO时，应权衡增加TFO长度的利弊，所选靶序列中嘧啶碱基的量越多，三链DNA的稳定性将越差。
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本研究凝胶留滞试验结果显示，对照寡核苷酸不能与靶序列杂交成三链DNA，高浓度AG-TFOl也不能与对照靶序列杂交成三链DNA；酶足迹试验结果显示对照寡核苷酸无足迹效应。说明AG-TFOl与靶序列DNA结合成三链DAN具有高度的特异性。
本实验中，我们还观察到11 nt AG-TFOs和11 nt GT-TFOα的浓度达最高值时，反应体系中仍有双链DNA存在，可能是因为这两种寡核苷酸中的G易形成自身相关结构，如G四聚体、二聚体等，降低了TFO与靶序列结合的有效浓度所致[5]。21 nt AG-TFO与靶序列结合较完全，当反应体系中TFO浓度达一定值时，双链DAN几乎均转变成三链DNA。21 nt AG-TFO同样含丰富的鸟嘌呤，为什么能与靶序列结合完全，其机制有待深究。
本实验证实，含AG或GT的TFO可与HBV C启动子区类同聚嘌呤链逆平行方向结合成三链DNA，其中21 nt AG-TFO与靶序列结合的亲和力最高，反应完全，可使双链靶DNA均转变成三链DNA，且具有高度特异性，经一定修饰后，可试用于HBV基因转录抑制实验。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800128)
作者简介：光丽霞(1956.4)， 女， 湖北省丐阳市人，硕士，副主任医师，副教授,主要从事乙肝防治方面的研究，发表论文16篇。
参考文献
[1] Radhakrishnan I, Patel J. DNA triplex: solution structures,hydration sites, energetics, interactions, and function[J].Biochemistry,1994,33(38):11 405-11 416.
[2] Rando R F, Paolis L D, Durland R H, et al. Inhibition of T7 and T3 RNA polymerase directed transcription elongation in vitro[J]. Nucleic Acids Res,1994,22(4):678-685.
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[3] Olivas W M, Maher L J. Overcoming potassiummediated triplex inhibition[J]. Nucleic Acids Res, 1995, 23(11):1 936-1 941.
[4] Chandler S P, Fox K R. Specificity of antiparallel DNA triple helix formation[J]. Biochemistry, 1996, 35(47):15 038-15 048.
[5] Faruqi A F, Krawczyk S H, Matteucci M D, et al. Potassium resistant triple helix formation and improved intracellular gene targeting by oligodeoxyribonucleotides containing 7deazaxan thine[J]. Nucleic Acids Res,1997,25(3):633-640.
收稿日期：1999-07-06；修回日期：1999-12-22, http://www.100md.com
单位：光丽霞(第三军医大学 附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；李为明(第三军医大学 附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；奚敏(第三军医大学 附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；顾长海(第三军医大学 附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；陈国致(第三军医大学 附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；袁发焕(第三军医大学 附属新桥医院肾内科，重庆 400037)
关键词：乙型肝炎病毒；三链DNA；寡核苷酸；启动子
第三军医大学学报000306
提 要 目的：筛选出能与HBV-DNA C启动子形成三链结构的高亲和力寡核苷酸。方法：以体外合成的32P标记的HBV-DNA C启动子区序列(1 734～1 754)为靶序列，合成5种有可能与该靶序列形成三链结构的寡核苷酸链(TFO)，同时设计对照靶序列和对照TFO，用凝胶滞留试验、酶足迹试验等方法对比分析这些TFO与靶序列是否形成三链结构及其结合的亲和性、特异性。结果：在37°C、pH7.4条件下，CT-TFO和GT-TFOp与32P-靶序列DNA结合的亲和力十分微弱，其Kd均>10-6mol/L；GT-TFOap和AG-TFOs与靶序列DNA结合的亲和力较高，Kd分别为5×10-7mol/L和2.5×10-8mol/L；AG-TFO1与靶序列结合的亲和力最高，Kd为3 ×10-9mol/L，而且两者的结合具有序列特异性。结论：含AG或GT的TFO可与HBV C启动子区类同聚嘌呤链逆平行方向结合成三链DNA，其中AG-TFO1与靶序列结合的亲和力最高，反应完全，可使靶双链DNA均转变成三链DNA，经一定修饰后，可试用于HBV基因转录抑制实验。
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文章编号：1000-5404(2000)03-0220-04
Design and screening of oligonucleotides forming triplex through binding with homopurine in HBVDNA core promoter
GUANG Li-xia, LI Wei-min, GU Chang-hai, YUAN Fa-huan, CHEN Guo-zhi, XI Min
(Department of Pediatrics, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
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Abstract Objective: To find oligodeoxyribonucleotides that can bind with HBV core promoter target site with high affinity and specificity. Methods: Similar homopurine domain (1 734～1 754) in HBV core promoter was chosen as the target sequence. Several corresponding oligodeoxyribonucleotides were synthesized. The binding affinity and specificity of the nucleotides were tested by electrophoretic mobility shift and DNase 1 footprinting assay. Results: At 37℃ and pH7.4, CT-TFO and GTTFOp could not bind with the target sequence with Kd values>10-6mol/L. GT-TFOap and AGTFOs could bind with the target sequence with Kd values of 5×10-7mol/L and 2.5×10-8mol/L respectively. AG-TFO1 had the highest affinity among the 5 kinds of oligodexyribonucleotides with a Kd value of 3×10-9mol/L in a sequencedependent manner. Conclusion: TFO containing AG or GT can bind with antiparallel homopurine in HBV core promoter to form triple helix. AG-TFO1 might be the best candidate among all the oligodeoxyribonucleotides designed in this study to inhibit HBV gene transcription.
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某些寡核苷酸不仅能与其互补的单链核酸结合成双链结构，还能与双链核酸中含丰富嘌呤碱基的区域(同聚嘌呤区)，以序列特异方式结合成三链结构。这种能形成三链结构的寡核苷酸(Triple helix-forming oligonucleotide,TFO)通过Hoogsteen或逆Hoogsteen氢键与双链靶DNA同聚嘌呤区相互作用，缠绕于DNA的深沟内， 并可阻止靶DNA与核酸聚合酶、转录因子等蛋白结合，抑制靶基因复制和表达[1]。TFO使人工调控特定基因表达成为可能，为难治性DNA病毒感染的治疗展示了一个新的方向。鉴于目前尚无根治乙型肝炎病毒感染的理想药物，本实验设计多种理论上有可能与 HBV-DNA C启动子区序列形成三链结构的TFO，观察其与HBV-DNA C启动子区序列结合的亲和性、特异性、筛选最佳TFO，为进一步的HBV基因转录抑制实验奠定基础，探索治疗HBV感染的新方法。
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1 材料与方法
1.1 寡核苷酸的合成
在Gibco BRL公司以亚磷酰胺三脂固相法合成图1所示的脱氧寡核苷酸，经C-18反相柱、聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
图1 靶序列和寡聚核苷酸序列
Fig 1 The sequence of targets and TFOs
1.2 靶DNA片段的标记和纯化
分别取两对上述合成的互补寡核苷酸(Target1和Target2)的正链和副链各500 pmol，混合，加5 mol/L NaCl 4 μl、无菌超纯水84 μl，75°C水浴12 min，逐渐冷至25°C，使互补的寡核苷酸杂交成双链靶DNA，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测证实杂交完全。然后以3′末端填充法标记靶DNA：取靶DNA 40 pmol,加20 μCi[α-32P]dCTP(～3 000 Ci/mmol),10 mmol/L dATP、dGTP、dTTP各1 μl，大肠杆菌DNA聚合酶I klenow片段10 U,补充无菌超纯水使反应总体积达20 μl，30°C温育30 min，加0.5 mol/L EDTA 1 μl终止反应，然后以Sephadex G50柱层析纯化标记的靶DNA片段，并以荧光分光光度法测标记靶DNA浓度，用FH液体闪烁计数器测其放射活性，估算靶DNA放射比活性。
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1.3 三链DNA形成及凝胶滞留试验
32P标记靶DNA片段1 pmol(1 300 cpm)与不同终浓度的各种TFO混合于三链DNA结合缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH7.4，10 mmol/L MgCl2，10%蔗糖)中，反应总体积10 μl，37°C水浴过夜。结合反应产物点样于15%聚丙酰胺凝胶(丙烯酰胺∶亚甲双丙烯酰胺=19∶1)上，用TEM10电泳缓冲液(89 mmol/L Tris硼酸pH8,10 mmol/L MgCl2)，在4°C环境中电泳(9 V/cm)过夜。然后进行凝胶放射自显影，并用薄层扫描仪测X线显影带的光密度。
1.4 三链DNA解离常数的计算
参照文献[2]，按下列公式计算三链DNA解离常数(Kd)：
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式中triplex为三链DNA，duplex为双链DNA，[]表示终浓度，当寡核苷酸与靶序列结合，反应体系中[triplex]=[duplex]时(即薄层扫描显示X线片中三链DNA与双链DNA条带的光密度值相等)，Kd=[TFO]，由于反应体系中[TFO]>>[triplex]，反应平衡后的TFO的终浓度的近似于其反应初浓度，故Kd值约等于反应体系中所加入的TFO浓度。
参照Olivas的方法[3]，以本实验体系最好的TFO为参考基准，计算各TFO与靶序列结合的相对亲和力(Relative affinity)：
式中Kd.best TFO为本实验体系中筛选出的最好的TFO与靶序列杂交形成的三链DNA的解离常数，Kd.exp TFO为本实验所测各TFO与靶序列杂交形成的三链DNA的解离常数。
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1.5 酶足迹试验
三链DNA结合反应方法同凝胶滞留试验，取结合反应产物8 μl，加DNase 1(终浓度15 U/ml)、消化1 min，加98%去离子甲酰胺-10 mol/L EDTA-0.25%二甲苯青FF液5 μl终止反应，90°C水浴变性5 min，点样于12%变性聚丙酰胺凝胶上，以1 800 V恒电压，电泳2 h，抽干凝胶，进行放射自显影。同时按快速Maxam-Gilbort测序法测靶DNA的A+G序列。
2 结果
2.1 靶序列的选择与寡核苷酸的设计
本研究寡核苷酸设计满足以下两个条件：1位于基因调控区(HBV C启动子)；2TFO的靶序列类似于同聚嘌呤序列(1734～1754)。
设计TFO时我们注意到了碱基配对方式对碱基三联体稳定性的影响，为避免非典型三联体形成，我们针对纯同聚嘌呤区(1 744～1 754)，以碱基配对标准方式，合成了4条11 nt寡核苷酸；为了考察增加TFO长度对三链DNA形成的影响，还合成了1条21 nt寡核苷酸，为排除TFO与双链DNA非特异性结合的可能性，同时合成无关靶序列2和TFOc作为对照，见图1。
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2.2 TFO与靶序列结合情况及亲和力
在37°C、pH7.4环境中，分别将5种TFO以渐增浓度(0，5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×10-8，5×10-8，2.5×10-7，5×10-7，2.5×10-6，5×10-6 mol/L)与1 pmol32P标记靶序列(target1)杂交，用聚丙酰胺凝胶电泳分离，然后进行放射自显影。结果：①CT-TFO、GT-TFOp在本实验所设计的浓度范围内均不能与靶序列结合{只见双链靶DNA带(duplex)，无三链DNA带出现}；②GT-TFOap达5×10-8、AG-TFOs在2.5×10-9、AG-TFO1达2.5×10-9 mol/L以上时，即能与32P-靶DNA结合{在双链靶DNA带后方，出现三链DNA带(triplex)}；③当GT-TFOap和AG-TFOs浓度达最高值时，三链DNA带前方仍然存在双链DNA带；④当AG-TFO1浓度达2.5×10-8 mol/L时，双链DNA带消失，只有三链DNA带存在，见图2。
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图2 凝胶滞留试验结果
1道：对照32P-靶序列2，无TFO；2道：对照32P-靶序列2与5×10-6 mol/L的AG-TFOl杂交；
3道：32P-靶序列1与TFOc杂交；4道：32P-靶序列1，无TFO；
5～11道：32P-靶序列1与渐增浓度(5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×108，5×108 mol/L)的AG-TFOl杂交
Fig 2 The results of gel mobillty shift assay
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Lane 1：32P-labeled target 2(lpmol) without TFO.
Lane 2:32P-labeled target 2(lpmol) were hybridized
with AG-TFOl(5×10-6 mol/L). Lane 3:32P-labeled target 1(1pmol)
were hybridized with TFOc. Lane 4:32P-labeled target 1 (1pmol)
without TFO. Lane 5～11:32P-labeled target 1 (1pmol) were hybridized
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with increasing molar concentration (5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×10-8，5×10-8 mol/L) AG-TFOl
用薄层扫描仪分析X线片显影带的光密度，按前述方法计算出各TFO与靶序列形成三链DNA的解离常数及相对亲和力，见表1。结果显示，在37°C、pH7.4条件下，CT-TFO、GT-TFOp与32P-靶DNA结合的亲和力十分微弱，其Kd均>>10-6mol/L，即使寡核苷酸浓度高达10-6mol/L，仍不能与靶序列结合成三链DNA。在相同条件下，GT-TFOap、AG-TFOs与靶序列结合的亲和力较高；Kd分别为5×10-7mol/L，2.5×10-8mol/L。四条短寡核苷酸中AG-TFOs的Kd值最低，提示其与靶序列结合的亲和力相对较高。与短AG寡核苷酸相比，21 ntAG寡核苷酸与靶序列结合的亲和力更高，Kd为3×10-9mol/L。
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表1 三链DNA解离常数值和TFO与靶序列的相对亲和力
Tab1 Triplex Kd values and relative affinity TFO
Kd(mol/L)
Relative affinity
CT-TFO
>>5×10-6
<<0.0006
GT-TFOp
>>5×10-6
<<0.0006
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GT-TFOap
5×10-7
0.006
AG-TFOs
2.5×10-8
0.12
AG-TFO1
3×10-9
1
2.3 TFO与靶序列结合的特异性
凝胶留滞试验结果显示(见图2)，对照寡核苷酸不能与靶序列(targetl)杂交成三链DNA(lane 3)；5×10-6mol/L AG-TFOl也不能与对照靶序列(target 2)杂交成三链DNA(lane 2)。对AG-TFO1与靶序列形成的三链DNA作酶足迹试验，经DNA酶切后电泳，放射显影结果显示见图3。在靶序列纯同聚嘌呤区，随着AG-TFOl浓度增高，逐渐形成一清晰的足迹(无DNA条带)，但在三链DNA中部的两个非典型碱基三联体处仍可见DNA条带；对照寡核苷酸则无足迹效应(有DNA条带)。
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图3 酶足迹试验结果
1道：32P-靶序列1与对照TFOc杂交；2道：32P-靶序列1，无TFO；
3～9道：32P-靶序列1与渐增浓度(5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×10-8,5×10-8 mol/L)的AG-TFOl杂交；
10、11道：32P-靶序列1的A+G序列
Fig 3 The results of DNase 1 footprinting analysis
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Lane 1:32P-labeled larget 1(1pmole) were hybridized with TFOc.
Lane2:32P-labeled target 1(1pmole) without TFO.
Lane 3～9:32P-labeled target 1(1 pmole) were hybridized with
increasing molar concentration (5×10-11，2.5×10-10，5×10-10，2.5×10-9，5×10-9，2.5×10-8，5×10-8 mol/L) AG-TFOl.
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Lane 10 and 11:A+G sequence of 32P-labeled target 1
3 讨论
HBV C启动子负责调控前基因组RNA和前C mRNA的转录，而前基因组RNA不仅是翻译HBV核壳蛋白，HBV-DNA多聚酶的信息RNA，也是逆转录复制HBV的模板，阻断该区可阻止HBVDNA的转录和复制，故我们选择此区类似同聚嘌呤序列(1 734～1 745)为靶位点。
本实验合成的寡核苷酸分为二类，嘧啶型寡核苷酸(CT-TFO)和嘌呤型寡核苷酸(AG-TFO和GT-TFO)。理论上，嘧啶型寡核苷酸能与靶序列嘌呤链中的嘌呤间形成Hoogsteen氢键而形成三链DNA；但本实验结果表明，在生理温度和pH范围内，CT-TFO不能与靶序列结合，可能与本实验的pH值高于该类寡核苷酸所要求的酸性环境有关[5]，说明未经改造或修饰的CT-TFO不适用于生理条件下的HBV转录抑制实验。本实验两条GT-TFO(GT-TFOp，GT-TFOap)所含碱基数目和碱基排列顺序完全相同，但方向相反，GT-TFOp与靶链的方向平行，GT-TFOap与靶链的方向逆平行；理论上，含GT的TFO能通过Hoogsteen或逆Hoogsteen氢键平行或逆平行地与靶序列嘌呤链结合；但本实验结果显示，GT-TFOap能与靶序列结合，而GT-TFOp则否，可能与这两条GT-TFO含成串的G有关，因含成串G的TFO易与靶序列同聚嘌呤链逆平行方向结合[1]。本研究表明，AG-TFOs亦可与靶序列结合。比较AG-TFOs和GT-TFOap这两条11 nt寡核苷酸与靶序列的亲和力，AG-TFOs高于GT-TFOap，说明在四种短TFO中，以AG-TFOs最好。
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在从4条11 nt寡核苷酸中筛选出最好的AG-TFOs的基础上，我们进一步延长AG-TFOs长度至21 nt，以探讨TFO长度对TFO与靶序列结合的亲和力和特异性的影响，结果表明21 nt AG-TFO与靶序列结合的亲和力相当于11 ng AG-TFOs的8.3倍，提示在一定范围内，增加TFO链长度，有助于提高TFO与靶序列结合的亲和力。
对AG-TFOl与靶序列形成的三链DNA作酶足迹试验结果显示，在纯同聚嘌呤区有清晰的足迹(无DNA条带)，说明此段三链DNA中的典型碱基三联体结合牢固，从而保护靶链，不为DNA酶所切开；但在靶序列中部的两个胸腺嘧啶处，却无足迹形成(有DNA条带)，说明此处的非典型碱基三联体(C*TA)结合松散，对DNA酶抵抗力弱，不能保护靶链，尽管我们选择了在非典型碱基三联体中最稳定的胞嘧啶与胸腺嘧啶的配对方式[4]。提示在设计TFO时，应权衡增加TFO长度的利弊，所选靶序列中嘧啶碱基的量越多，三链DNA的稳定性将越差。
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本研究凝胶留滞试验结果显示，对照寡核苷酸不能与靶序列杂交成三链DNA，高浓度AG-TFOl也不能与对照靶序列杂交成三链DNA；酶足迹试验结果显示对照寡核苷酸无足迹效应。说明AG-TFOl与靶序列DNA结合成三链DAN具有高度的特异性。
本实验中，我们还观察到11 nt AG-TFOs和11 nt GT-TFOα的浓度达最高值时，反应体系中仍有双链DNA存在，可能是因为这两种寡核苷酸中的G易形成自身相关结构，如G四聚体、二聚体等，降低了TFO与靶序列结合的有效浓度所致[5]。21 nt AG-TFO与靶序列结合较完全，当反应体系中TFO浓度达一定值时，双链DAN几乎均转变成三链DNA。21 nt AG-TFO同样含丰富的鸟嘌呤，为什么能与靶序列结合完全，其机制有待深究。
本实验证实，含AG或GT的TFO可与HBV C启动子区类同聚嘌呤链逆平行方向结合成三链DNA，其中21 nt AG-TFO与靶序列结合的亲和力最高，反应完全，可使双链靶DNA均转变成三链DNA，且具有高度特异性，经一定修饰后，可试用于HBV基因转录抑制实验。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800128)
作者简介：光丽霞(1956.4)， 女， 湖北省丐阳市人，硕士，副主任医师，副教授,主要从事乙肝防治方面的研究，发表论文16篇。
参考文献
[1] Radhakrishnan I, Patel J. DNA triplex: solution structures,hydration sites, energetics, interactions, and function[J].Biochemistry,1994,33(38):11 405-11 416.
[2] Rando R F, Paolis L D, Durland R H, et al. Inhibition of T7 and T3 RNA polymerase directed transcription elongation in vitro[J]. Nucleic Acids Res,1994,22(4):678-685.
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[3] Olivas W M, Maher L J. Overcoming potassiummediated triplex inhibition[J]. Nucleic Acids Res, 1995, 23(11):1 936-1 941.
[4] Chandler S P, Fox K R. Specificity of antiparallel DNA triple helix formation[J]. Biochemistry, 1996, 35(47):15 038-15 048.
[5] Faruqi A F, Krawczyk S H, Matteucci M D, et al. Potassium resistant triple helix formation and improved intracellular gene targeting by oligodeoxyribonucleotides containing 7deazaxan thine[J]. Nucleic Acids Res,1997,25(3):633-640.
收稿日期：1999-07-06；修回日期：1999-12-22, http://www.100md.com