烧伤病人痂下水肿液对中性粒细胞膜表面CD11/CD18表达的影响
作者：李志清 周一平 荣新洲 陈文 王振岳
单位：李志清(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)；周一平(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)；荣新洲(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)；陈文(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)；王振岳(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)
关键词：烧伤；痂下水肿液；中性粒细胞；CD11/CD18
第一军医大学学报000320 摘要；目的 了解烧伤病人痂下水肿液(STF)对中性粒细胞(PMN)活化及CD11/CD18表达的影响。方法 应用流式细胞术动态检测严重烧伤病人STF 刺激健康人PMN后PMN膜表面CD11a/CD18和CD11b/CD18的表达以及STF与PMN同孵育后培养液中髓过氧化物酶(MPO)变化。结果 健康人PMN在STF刺激1 h后，培养液中MPO活性即迅速升高并在24 h内保持此高水平，同时，PMN膜表面CD11a/CD18和CD11b/CD18也迅速升高达峰值并在24 h内保持此高水平。结论 STF可活化PMN并刺激PMN表达CD11a/CD18和CD11b/CD18，STF对烧伤后PMN致组织损害可能起重要作用。
, 百拇医药
中图分类号：R644 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0222-02
Effect of subeschar tissue fluid from burn patients on the expression of CD11/CD18 on PMN in vitro
LI Zhi-qing, ZHOU Yi-ping, RONG Xin-zhou, CHEN Wen, WANG Zhen-yue
(Department of Burn, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To investigate the effect of changes in CD11/CD18 expressions on polymorphonuclear neutrophils (PMNs) in response to subeschar tissue fluid (STF) obtained from burn patients. Methods The expression of CD11a/CD18 on the membrane of STF-treated PMN from normal subjects and CD11b/CD18 were determined by flow cytometry, and the activity of myeloperoxidase (MPO) in the media was determined. Results In response to STF stimulation, the expression of CD11a/CD18 and CD11b/CD18 on the membrane of PMN increased, reaching its peak at 1 h, and maintained during the following 24 h. The activity of MPO in the media underwent almost the same process. Conclusion STF can activate the PMNs and stimulate the expression of CD11/CD18 on the membrane of PMNs.
, 百拇医药
Key words: burn; subeschar tissue fluid; polymorphonuclear neutrophil; CD11/CD18
既往研究表明[1]，严重烧伤后有大量中性粒细胞(PMN) 粘附于血管内皮并可导致脏器损伤。PMN膜表面D11/CD18(主要是CD11a/CD18和CD11b/CD18)在PMN与内皮细胞粘附中起重要作用[2]。本研究检测了烧伤病人痂下水肿液(STF)对PMN膜表面CD11/CD18表达的影响，以探讨STF在烧伤后PMN与内皮细胞粘附中的作用。
1 材料与方法
1.1 临床资料
烧伤组：1996年8月～1998年8月本院收治的8例严重烧伤病人，男性6名、女性2名，年龄(23.5±8.7)岁，伤前健康无既往病史，烧伤总面积占体表总面积(TBSA)的(46.3±12.5)%，其中Ⅲ°烧伤面积均超过TBSA的20%；对照组：8例健康成人，男性6名、女性2名，年龄(24.3±7.4)岁。
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1.2 中性粒细胞分离
应用淋巴细胞分离液从对照组外血中分离PMN。
1.3 烧伤痂下水肿液收集
在烧伤组伤后
在烧伤组伤后3～4 d 切痂术中用无菌注射器收集STF，并从对照组外周血中分离血清。STF和血清按20%的体积比例与M199培养液混合，分别刺激对照组的PMN。
1.4 流式细胞术检测
将
将PMN制成1×106/ml细胞悬液。先加一抗(大鼠抗人CD11a/CD18 mAb和CD11b/CD18 mAb各100 m l， 抗体效价均为1:20，德国宝灵曼公司产品)，并用相应大鼠1gG作对照，再加荧光素标记的二抗100 μl(羊抗大鼠IgG-FITC，丹麦DAKO公司产品)，置FACS测试管上机检测，测定平均荧光密度(MFI)。
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1.5 髓过氧化物(MPO)测定
将正常血清和STF分别与PMN一同孵育，取1、3、 6、12、24 h 各时相点的培养液2 ml，加反应液(用PBS与16.7 mg磷酸邻联回香胺配制成0.05 mol/L)，用紫外分光光度计于 460 nm 波长记录光密度值，计算MPO活性)。
1.6 统计处理
所有数据以
±s表示，组间数据比较采用两样本均数t检验。
2 结果
2.1 培养液中MPO活性变化
STF刺激健康人中性粒细胞后1 h，培养液中MPO活性即迅速升高，并在刺激后24 h 内维持此高水平；健康人血清刺激PMN后培养液中MPO活性无明显变化(表1)。
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表1 STF刺激PMN后，培养液中MPO活性变化(nmol. s-1.L-1)
Tab.1 Activity of MPO in media after incubation
of PMN with STF (nmol.s-1.L-1) Group
Incubation time (h)
1
3
6
12
, 百拇医药 24
STF
0.44±0.03*
0.43±0.04*
0.42±0.05*
0.44±0.04*
0.41±0.03*
Control
0.09±0.01
0.09±0.03
0.08±0.02
, 百拇医药
0.09±0.02
0.10±0.04
* P<0.01 vs control group2.1 CD11a/CD18和CD11b/CD18的变化
应用流式细胞术检测发现对照组PMN膜表面均有CD11a/CD18和CD11b/CD18表达，且以CD11a/CD18表达较多。STF刺激PMN后，CD11a/CD18和CD11b/CD18表达均迅速增多，1 h 后达峰值，并在24 h 内维持此高水平；而用健康人血清刺激PMN后，CD11a/CD18和CD11b/CD18表达无明显变化(表2)。
表2 PMN受STF刺激后CD11a/CD18和CD11b/CD18表达变化(MFI)
Tab.2 Expressions of CD11a/CD18 and CD11b/CD18 on
, http://www.100md.com
the membrane of PMN in response to STF stimulation(MFI) Group
Incubation time (h)
1
3
6
12
24
STF
CD11a/CD18
302.04±17.01*
289.28±17.81*
, http://www.100md.com
294.43±26.51*
287.28±26.09*
296.57±23.34*
CD11b/CD18
352.57±12.33*
346.00±19.13*
320.42±37.99*
337.86±33.72*
329.71±23.12*
, 百拇医药
Control
CD11a/CD18
112.14±18.13
123.45±21.67
109.82±19.24
115.43±21.94
114.61±19.48
CD11b/CD18
56.71±7.74
52.46±9.5
60.84±10.68
, http://www.100md.com
49.38±8.24
55.63±12.57
MFI: mean fluorescence intensity; * P<0.01 vs control group3 讨论
严重烧伤后，PMN可迅速向烧伤组织局部和远隔脏器聚集并可导致脏器内皮细胞和组织损伤，PMN激活并与内皮细胞粘附是其关键步骤。在PMN与内皮细胞粘附过程中，PMN膜表面的CD11/CD18(主要是CD11a/CD18和CD11b/CD18)起主要作用[3]。
本研究发现STF刺激体外健康人PMN后1 h，培养液中MPO活性显著增高。MPO是PMN嗜天青颗粒中含量较高的酶，它的变化反映了PMN颗粒释放和PMN活化情况。STF刺激PMN导致MPO活性增高，说明STF可激活PMN。我们进一步应用流式细胞术检测在STF刺激下PMN膜表面CD11/CD18的表达情况，发现PMN在STF刺激后1 h，CD11a/CD18和CD11b/CD18迅速升高达峰值并在24 h 内维持此高水平。CD11a/CD18和CD11b/CD18在细胞活化后表达增加，并与内皮细胞相应受体互相作用，导致PMN快速粘附并跨过内皮游走至受损部位，促进PMN吞噬活性，诱导其呼吸爆发与分泌反应等[4、5]，参与和诱导炎症反应。STF激活PMN，诱导PMN膜表面CD11a/CD18和CD11b/CD18的表达，从而可能加强PMN与内皮细胞粘附，并渗出血管，达到炎症区域和组织器官，在过度激活情况下发挥其组织损伤作用。随着STF的回吸收入全身血液循环，其作用将不仅仅局限于痂下组织局部。综上所述，STF在PMN的活化及PMN与内皮细胞粘附中可能起着重要作用。因此，烧伤早期大面积切痂植皮应尽早切除坏死组织和清除STF [6]，尽早清除STF将有利于减轻烧伤后组织损伤。
, 百拇医药
军队九五科技攻关项目
李志清(1967-),男,湖南沅江人,1996年毕业于第三军医大学,硕士,主治医师
参考文献
[1] 杨宗城, 罗向东, 高建川等. 严重烧伤后内皮细胞损伤及其在早期脏器损害发病中的作用[J]. 解放军医学杂志, 1996, 21(1):10～2.
[2] 李志清, 杨宗城, 罗向东等. 烧伤血清对中性粒细胞与内皮细胞粘附力学特性的影响[J]. 解放军医学杂志, 1998, 23(2)：98～100.
[3] Huang AJ, Sliverstein SC. Mechanisms of neutrophil migration across endothelium[M]. In: Endothelial cell dysfunction. New York: Plenum Press, 1992. 201～4.
, 百拇医药
[4] Wahi SM, Feldman GM, McCarthy JB.Regulation of leukocyte adhesion and signaling in inflammation and disease[J]. J Leukoc Biol, 1996, 59: 789～96.
[5] Smith JA. Neutrophils, host defence and inflammation: a double edged sword[J], J Leukoc Biol, 1994, 56:672～96.
[6] 李志清, 黄跃生, 杨宗城等. 一次性大面积切痂前后烧伤血清中内毒素和肿瘤坏死因子及血清损伤内皮细胞的变化[J]. 第一军医大学学报, 1998, 18:280～1.
1999-11-03, 百拇医药
单位：李志清(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)；周一平(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)；荣新洲(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)；陈文(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)；王振岳(第一军医大学南方医院烧伤科，广东 广州 510515)
关键词：烧伤；痂下水肿液；中性粒细胞；CD11/CD18
第一军医大学学报000320 摘要；目的 了解烧伤病人痂下水肿液(STF)对中性粒细胞(PMN)活化及CD11/CD18表达的影响。方法 应用流式细胞术动态检测严重烧伤病人STF 刺激健康人PMN后PMN膜表面CD11a/CD18和CD11b/CD18的表达以及STF与PMN同孵育后培养液中髓过氧化物酶(MPO)变化。结果 健康人PMN在STF刺激1 h后，培养液中MPO活性即迅速升高并在24 h内保持此高水平，同时，PMN膜表面CD11a/CD18和CD11b/CD18也迅速升高达峰值并在24 h内保持此高水平。结论 STF可活化PMN并刺激PMN表达CD11a/CD18和CD11b/CD18，STF对烧伤后PMN致组织损害可能起重要作用。
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中图分类号：R644 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0222-02
Effect of subeschar tissue fluid from burn patients on the expression of CD11/CD18 on PMN in vitro
LI Zhi-qing, ZHOU Yi-ping, RONG Xin-zhou, CHEN Wen, WANG Zhen-yue
(Department of Burn, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To investigate the effect of changes in CD11/CD18 expressions on polymorphonuclear neutrophils (PMNs) in response to subeschar tissue fluid (STF) obtained from burn patients. Methods The expression of CD11a/CD18 on the membrane of STF-treated PMN from normal subjects and CD11b/CD18 were determined by flow cytometry, and the activity of myeloperoxidase (MPO) in the media was determined. Results In response to STF stimulation, the expression of CD11a/CD18 and CD11b/CD18 on the membrane of PMN increased, reaching its peak at 1 h, and maintained during the following 24 h. The activity of MPO in the media underwent almost the same process. Conclusion STF can activate the PMNs and stimulate the expression of CD11/CD18 on the membrane of PMNs.
, 百拇医药
Key words: burn; subeschar tissue fluid; polymorphonuclear neutrophil; CD11/CD18
既往研究表明[1]，严重烧伤后有大量中性粒细胞(PMN) 粘附于血管内皮并可导致脏器损伤。PMN膜表面D11/CD18(主要是CD11a/CD18和CD11b/CD18)在PMN与内皮细胞粘附中起重要作用[2]。本研究检测了烧伤病人痂下水肿液(STF)对PMN膜表面CD11/CD18表达的影响，以探讨STF在烧伤后PMN与内皮细胞粘附中的作用。
1 材料与方法
1.1 临床资料
烧伤组：1996年8月～1998年8月本院收治的8例严重烧伤病人，男性6名、女性2名，年龄(23.5±8.7)岁，伤前健康无既往病史，烧伤总面积占体表总面积(TBSA)的(46.3±12.5)%，其中Ⅲ°烧伤面积均超过TBSA的20%；对照组：8例健康成人，男性6名、女性2名，年龄(24.3±7.4)岁。
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1.2 中性粒细胞分离
应用淋巴细胞分离液从对照组外血中分离PMN。
1.3 烧伤痂下水肿液收集
在烧伤组伤后
在烧伤组伤后3～4 d 切痂术中用无菌注射器收集STF，并从对照组外周血中分离血清。STF和血清按20%的体积比例与M199培养液混合，分别刺激对照组的PMN。
1.4 流式细胞术检测
将
将PMN制成1×106/ml细胞悬液。先加一抗(大鼠抗人CD11a/CD18 mAb和CD11b/CD18 mAb各100 m l， 抗体效价均为1:20，德国宝灵曼公司产品)，并用相应大鼠1gG作对照，再加荧光素标记的二抗100 μl(羊抗大鼠IgG-FITC，丹麦DAKO公司产品)，置FACS测试管上机检测，测定平均荧光密度(MFI)。
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1.5 髓过氧化物(MPO)测定
将正常血清和STF分别与PMN一同孵育，取1、3、 6、12、24 h 各时相点的培养液2 ml，加反应液(用PBS与16.7 mg磷酸邻联回香胺配制成0.05 mol/L)，用紫外分光光度计于 460 nm 波长记录光密度值，计算MPO活性)。
1.6 统计处理
所有数据以
±s表示，组间数据比较采用两样本均数t检验。2 结果
2.1 培养液中MPO活性变化
STF刺激健康人中性粒细胞后1 h，培养液中MPO活性即迅速升高，并在刺激后24 h 内维持此高水平；健康人血清刺激PMN后培养液中MPO活性无明显变化(表1)。
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表1 STF刺激PMN后，培养液中MPO活性变化(nmol. s-1.L-1)
Tab.1 Activity of MPO in media after incubation
of PMN with STF (nmol.s-1.L-1) Group
Incubation time (h)
1
3
6
12
, 百拇医药 24
STF
0.44±0.03*
0.43±0.04*
0.42±0.05*
0.44±0.04*
0.41±0.03*
Control
0.09±0.01
0.09±0.03
0.08±0.02
, 百拇医药
0.09±0.02
0.10±0.04
* P<0.01 vs control group2.1 CD11a/CD18和CD11b/CD18的变化
应用流式细胞术检测发现对照组PMN膜表面均有CD11a/CD18和CD11b/CD18表达，且以CD11a/CD18表达较多。STF刺激PMN后，CD11a/CD18和CD11b/CD18表达均迅速增多，1 h 后达峰值，并在24 h 内维持此高水平；而用健康人血清刺激PMN后，CD11a/CD18和CD11b/CD18表达无明显变化(表2)。
表2 PMN受STF刺激后CD11a/CD18和CD11b/CD18表达变化(MFI)
Tab.2 Expressions of CD11a/CD18 and CD11b/CD18 on
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the membrane of PMN in response to STF stimulation(MFI) Group
Incubation time (h)
1
3
6
12
24
STF
CD11a/CD18
302.04±17.01*
289.28±17.81*
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294.43±26.51*
287.28±26.09*
296.57±23.34*
CD11b/CD18
352.57±12.33*
346.00±19.13*
320.42±37.99*
337.86±33.72*
329.71±23.12*
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Control
CD11a/CD18
112.14±18.13
123.45±21.67
109.82±19.24
115.43±21.94
114.61±19.48
CD11b/CD18
56.71±7.74
52.46±9.5
60.84±10.68
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49.38±8.24
55.63±12.57
MFI: mean fluorescence intensity; * P<0.01 vs control group3 讨论
严重烧伤后，PMN可迅速向烧伤组织局部和远隔脏器聚集并可导致脏器内皮细胞和组织损伤，PMN激活并与内皮细胞粘附是其关键步骤。在PMN与内皮细胞粘附过程中，PMN膜表面的CD11/CD18(主要是CD11a/CD18和CD11b/CD18)起主要作用[3]。
本研究发现STF刺激体外健康人PMN后1 h，培养液中MPO活性显著增高。MPO是PMN嗜天青颗粒中含量较高的酶，它的变化反映了PMN颗粒释放和PMN活化情况。STF刺激PMN导致MPO活性增高，说明STF可激活PMN。我们进一步应用流式细胞术检测在STF刺激下PMN膜表面CD11/CD18的表达情况，发现PMN在STF刺激后1 h，CD11a/CD18和CD11b/CD18迅速升高达峰值并在24 h 内维持此高水平。CD11a/CD18和CD11b/CD18在细胞活化后表达增加，并与内皮细胞相应受体互相作用，导致PMN快速粘附并跨过内皮游走至受损部位，促进PMN吞噬活性，诱导其呼吸爆发与分泌反应等[4、5]，参与和诱导炎症反应。STF激活PMN，诱导PMN膜表面CD11a/CD18和CD11b/CD18的表达，从而可能加强PMN与内皮细胞粘附，并渗出血管，达到炎症区域和组织器官，在过度激活情况下发挥其组织损伤作用。随着STF的回吸收入全身血液循环，其作用将不仅仅局限于痂下组织局部。综上所述，STF在PMN的活化及PMN与内皮细胞粘附中可能起着重要作用。因此，烧伤早期大面积切痂植皮应尽早切除坏死组织和清除STF [6]，尽早清除STF将有利于减轻烧伤后组织损伤。
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军队九五科技攻关项目
李志清(1967-),男,湖南沅江人,1996年毕业于第三军医大学,硕士,主治医师
参考文献
[1] 杨宗城, 罗向东, 高建川等. 严重烧伤后内皮细胞损伤及其在早期脏器损害发病中的作用[J]. 解放军医学杂志, 1996, 21(1):10～2.
[2] 李志清, 杨宗城, 罗向东等. 烧伤血清对中性粒细胞与内皮细胞粘附力学特性的影响[J]. 解放军医学杂志, 1998, 23(2)：98～100.
[3] Huang AJ, Sliverstein SC. Mechanisms of neutrophil migration across endothelium[M]. In: Endothelial cell dysfunction. New York: Plenum Press, 1992. 201～4.
, 百拇医药
[4] Wahi SM, Feldman GM, McCarthy JB.Regulation of leukocyte adhesion and signaling in inflammation and disease[J]. J Leukoc Biol, 1996, 59: 789～96.
[5] Smith JA. Neutrophils, host defence and inflammation: a double edged sword[J], J Leukoc Biol, 1994, 56:672～96.
[6] 李志清, 黄跃生, 杨宗城等. 一次性大面积切痂前后烧伤血清中内毒素和肿瘤坏死因子及血清损伤内皮细胞的变化[J]. 第一军医大学学报, 1998, 18:280～1.
1999-11-03, 百拇医药