烟碱诱导基因的差异表达
作者：闫道广 罗深秋 陈保生
单位：闫道广(第一军医大学生物教研室，广东 广州 510515)；罗深秋(第一军医大学生物教研室，广东 广州 510515)；陈保生(中国医学科学院生物化学教研室，北京， 100000)
关键词：mRNA差异显示；烟碱；差异表达cDNA片段
第一军医大学学报000314 摘要: 目的 通过测定分析烟碱诱导出现的差异表达片段的序列，观察与烟碱相关的动脉粥样硬化的致病基因。方法 提取以烟碱处理培养的胎儿脐静脉内皮细胞的RNA，利用mRNA差异显示技术显示差异表达cDNA片段(EST)，经Northern 印迹证明并测序，经基因库比较查询。结果 发现60条EST，Northern 印迹证实23条cDNA确属差异表达片段，测序发现11条未见报道同源序列的EST。结论 确定了11条差异表达片段的序列，为全长cDNA筛选和克隆打下基础。
, 百拇医药
中图分类号：Q75 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)03-0236-03
Nicotine induced differentially genes expression
YAN Dao-guang1, LUO Shen-qiu1, CHEN Bao-sheng2
1Department of Cell Biology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Department of Biochemistry, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100000, ChinaAbstract: Objective To identify the sequences of cDNA fragments that were differentially expressed between normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and HUVEC stimulated by nicotine. Methods The differential display reverse transcription polymerase chain reaction was used to search for differences between the mRNA expression of HUVEC and HUVEC induced by nicotine. Some differentially expressed cDNA fragments (ESTs) were found, which was further comfirmed by Northern blotting, and then compared with Gene bank. Results Sixty cDNA differentially expressed fragments (ESTs) were displayed, among them, 23 were reconfirmed by Northern blotting. In comparison with Gene bank, 11 novel ESTs were obtained. The article reported the results of one of them, CY31. Conclusion Eleven novel ESTs were ascertained, which provides a basis for our further research.
, http://www.100md.com
Key Words: mRNA differential display; nicotine; EST
流行病学调查证明，吸烟是动脉粥样硬化(AS)发生发展的环境危险因子，但其致病机制未明。本实验旨在筛选和克隆与烟碱相关的AS致病基因.
1 材料与方法
1.1 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养
烟碱培养HUVEC组：参照Gimbrone等[1]的方法并稍作改进。当内皮细胞培养在24 ml培养瓶中亚融合时弃去培养液，PBS液洗2次，然后用含与吸烟人群平均血清浓度相同烟碱(10-7 mol/L)M199完全培养基继续培养24 h，弃去培养液，–70℃保存备用。同时设无烟碱对照HUVEC组。
1.2 mRNA 差异显示
, 百拇医药
参照Clonetech公司提供的试剂盒说明书和文献[2]的方法并稍加改进。
1.3 EST的序列测定
使用373A DNA测序自动分析仪(美国应用生物公司生产)，Taq酶荧光标记引物循环测序法测序[3]。
1.4 Northern 印迹
1.4.1 探针制备(1)酶切反应：取10 μg质粒DNA ，加入10×EcoR I 缓冲液及50 U EcoR I，双蒸馏水补足反应体积，37℃酶切2 h以上，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。(2)探针回收：WizardTM DNA Clean up Kit(购自美国Promega公司)，待酶切完全后，用1 μl 5 mol/L NaI于60℃溶解凝胶，加入1 ml树脂，室温5 min，然后用套上过滤柱的注射器滤过，去掉洗脱液；加入2 ml 80%的异丙醇洗涤小柱子，取下小柱子套上一个新的1.5 ml反应管，13 000×g 离心20 s，室温5 min，然后加入适量的预热到65%75℃的 TE 缓冲液(pH 7.0)洗脱DNA，12 000×g离心3 min，收集DNA，电泳鉴定并定量，–20℃保存备用。(3)探针标记：按照随机引物标记试剂盒(购自美国Promega公司)说明书进行。
, 百拇医药
1.4.2 预杂交反应 将转RNA的尼龙膜放入杂交袋，加入适量的预杂交液，去气泡并封口，65℃保温3 h；剪开杂交袋，倒出预杂交液，每袋加入适量的预杂交液和标记探针，立即封口，放置65℃保温72 h；用2×SSC(含0.1%SDS)于65℃水浴中洗膜3次，每次30 min，膜干后压片，置–70℃、72 h洗片。
2 结果
2.1 对照组和烟碱组HUVEC mRNA的差异显示
对照组和烟碱组HUVEC的mRNA经反转录cDNA后同时用上游引物和下游引物扩增，产物经PAGE电泳后放射自显影，发现60个差异条带，提示两组HUVEC之间mRNA 的差异，有可能反映了两组间基因表达差异。图1为烟碱组HUVEC其中1个差异带CY31的放射自显影图，箭头所指为CY31。
, 百拇医药
图1 PAGE 放射自显影图
Fig.1 Auto-radiographs of PAGE
CDNA fragments was differentially displayed
2.2 对照组与烟碱组HUVEC差异表达cDNA片段(EST)的克隆
从PAGE切下EST，处理后以同样引物扩增，克隆到pGEM-T Easy中，经转化后，利用互补现象来筛选重组质粒。本实验挑选两个阳性克隆1，2(白色)和一个阴性克隆(蓝色)，pGEM-T Easy载体插入位点两边各有一个EcoR 酶切位点，酶切后行1%凝胶电泳，证明有380 bp左右的cDNA插入片段(图2)。
, 百拇医药
图2 EcoR I酶切后重组质粒(B0、B1、B2)PCR产物的1%凝胶电泳图
Fig.2 1%garose gel electrophoretogram of PCR products
of recombinants plasmids B0, B1, B2 digested by EcoR I
1:λDNA/Hind Ⅲ marker; 2: B0/Ec0R I; 3: B1/ EcoR I;
4: B2/ EcoR I; 5: pBR322/ BstN I marker
2.3 Northern 印迹的结果
, 百拇医药
Northern 印迹结果显示，60条EST中有23条有杂交信号且有差异表达，其余片段没有杂交信号或无差异，认为是假阳性条带，未作进一步研究。CY31的Northern 印迹结果(图3)。
图3 Northern 印迹结果
Fig.3 Northern blotting results
2.4 EST阳性克隆的序列测定结果
测序后将克隆序列与基因序列进行序列比较，发现11条未报道同源序列的EST，其中的CY31的序列如下。
GGTCTATCAC
CGACTTTCAG
, 百拇医药
TAAAAACATA
GCTTACAGAG
AATTCCAGTG
AGCTCTGAAT
CAGAGGAGTA
AATGAAATGG
GGTGCTGATC
CAAGAAGTCC
AAGAGCTACA
AAGAAAAAAA
ACTTGAAAGG
, 百拇医药
TATTTTGTAC
AAAATCATTA
TAGAATGTAT
TATTGCAATT
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TAATAAACAT
TTAACTAGCT
GTAAACTTCA
CGGGAACTCT
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TTTCTTAAGA
TTTTATTTTA
TTTTATGGGT
, 百拇医药
ATTTTGCCTG
CATGCACAGA
TGCCTGCCTG
TGATAGCTC
3 讨论
AS是一种复杂的遗传性疾病，是多基因、多环境因子相互作用导致的一种渐进性疾病。近几十年来，应用分子生物学和遗传学的研究手段，通过对冠心病动物模型的大量研究，已克隆和分离了一些导致AS和抗AS的基因，并在整体水平上证实了他们的生理功能。但环境因子参与AS的发生发展过程如内皮损伤、脂质沉着、巨嗜细胞及平滑肌细胞形成泡沫细胞(Foam cell)的分子机制尚不清楚。
流行病学研究表明，吸烟是AS发生的危险因素之一，并与高脂血症协同致病。实验室资料显示，烟毒的主要成分烟碱能够减少培养的内皮细胞的总蛋白量，引起动脉的血清脂谱的改变等[3,4]，提示烟碱可能参与AS的病理过程。
, 百拇医药
自1992年mRNA的差异显示技术[2]发明以来，已被广泛用于新基因的克隆和比较同一组织不同发育阶段mRNA差异表达等，借助这种技术，一些新的基因得以发现[5]。我们采用Clonetech公司提供的mRNA差异显示试剂盒优化了引物设计，其随机组合的10个锚定引物和9个Oligo (DT)几乎完全满足整个基因组DNA扩增的需求。实验中，我们找到了60个差异片段，经Northern 印迹证实23条确属差异表达，其余37条为假阳性片段，这个结果与其它实验室报道类似[5,6]。这种假阳性片段的出现，一方面来自实验过程中的技术误差，另一方面源于这种技术本身的局限，如随机引物扩增过程中产生的杂带，高压电流过程的水带等。
对这些经确认的差异表达片段，我们进行了克隆测序，并将序列送基因库比较，发现了11个未报道同源序列的片段，本文报道了其中一个片段的实验结果，寻找全长cDNA的工作仍在进一步进行中。
, 百拇医药 国家863课题
闫道广(1965-),男,河南驻马店人,1996年毕业于第一军医大学,硕士,讲师
参考文献
[1] Gimbrone MA, Cotran RS, Folkman J. Human vascular endothelial cells in culture growth and DNA synthesis[J]. J Cell Biol, 1974, 60:673～78.
[2] Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction: implication for nicotine replacement therapy[J]. Science, 1992, 257:967～71.
, 百拇医药
[3] Benowitz NL, Gourlay SG. Cardiovascular toxicity of nicotine[J]. J Am Coll Cardiol, 1997, 29(7): 1422～31.
[4] Latha MS, Vijaymmal PL, Kurup PA. Effect of nicotine adminis-tration on lipid metabolism in rats[J]. Indian J Med Res, 1993, 98:44～9.
[5] Song Y, Ailenberg M, Silverman M. Cloning of a novel gene in the human kidney homologous to rat munc13s: its potential role in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 1998, 53(6): 1689～95.
[6] Werner JA, Gorogh T, Lippret BM et al. Expression of a novel mRNA in human head and neck squamous cell carcinoma cells[J]. Mol Pathol, 1997, 50(2): 82～6.
1999-06-12, http://www.100md.com
单位：闫道广(第一军医大学生物教研室，广东 广州 510515)；罗深秋(第一军医大学生物教研室，广东 广州 510515)；陈保生(中国医学科学院生物化学教研室，北京， 100000)
关键词：mRNA差异显示；烟碱；差异表达cDNA片段
第一军医大学学报000314 摘要: 目的 通过测定分析烟碱诱导出现的差异表达片段的序列，观察与烟碱相关的动脉粥样硬化的致病基因。方法 提取以烟碱处理培养的胎儿脐静脉内皮细胞的RNA，利用mRNA差异显示技术显示差异表达cDNA片段(EST)，经Northern 印迹证明并测序，经基因库比较查询。结果 发现60条EST，Northern 印迹证实23条cDNA确属差异表达片段，测序发现11条未见报道同源序列的EST。结论 确定了11条差异表达片段的序列，为全长cDNA筛选和克隆打下基础。
, 百拇医药
中图分类号：Q75 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)03-0236-03
Nicotine induced differentially genes expression
YAN Dao-guang1, LUO Shen-qiu1, CHEN Bao-sheng2
1Department of Cell Biology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Department of Biochemistry, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100000, ChinaAbstract: Objective To identify the sequences of cDNA fragments that were differentially expressed between normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and HUVEC stimulated by nicotine. Methods The differential display reverse transcription polymerase chain reaction was used to search for differences between the mRNA expression of HUVEC and HUVEC induced by nicotine. Some differentially expressed cDNA fragments (ESTs) were found, which was further comfirmed by Northern blotting, and then compared with Gene bank. Results Sixty cDNA differentially expressed fragments (ESTs) were displayed, among them, 23 were reconfirmed by Northern blotting. In comparison with Gene bank, 11 novel ESTs were obtained. The article reported the results of one of them, CY31. Conclusion Eleven novel ESTs were ascertained, which provides a basis for our further research.
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Key Words: mRNA differential display; nicotine; EST
流行病学调查证明，吸烟是动脉粥样硬化(AS)发生发展的环境危险因子，但其致病机制未明。本实验旨在筛选和克隆与烟碱相关的AS致病基因.
1 材料与方法
1.1 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养
烟碱培养HUVEC组：参照Gimbrone等[1]的方法并稍作改进。当内皮细胞培养在24 ml培养瓶中亚融合时弃去培养液，PBS液洗2次，然后用含与吸烟人群平均血清浓度相同烟碱(10-7 mol/L)M199完全培养基继续培养24 h，弃去培养液，–70℃保存备用。同时设无烟碱对照HUVEC组。
1.2 mRNA 差异显示
, 百拇医药
参照Clonetech公司提供的试剂盒说明书和文献[2]的方法并稍加改进。
1.3 EST的序列测定
使用373A DNA测序自动分析仪(美国应用生物公司生产)，Taq酶荧光标记引物循环测序法测序[3]。
1.4 Northern 印迹
1.4.1 探针制备(1)酶切反应：取10 μg质粒DNA ，加入10×EcoR I 缓冲液及50 U EcoR I，双蒸馏水补足反应体积，37℃酶切2 h以上，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。(2)探针回收：WizardTM DNA Clean up Kit(购自美国Promega公司)，待酶切完全后，用1 μl 5 mol/L NaI于60℃溶解凝胶，加入1 ml树脂，室温5 min，然后用套上过滤柱的注射器滤过，去掉洗脱液；加入2 ml 80%的异丙醇洗涤小柱子，取下小柱子套上一个新的1.5 ml反应管，13 000×g 离心20 s，室温5 min，然后加入适量的预热到65%75℃的 TE 缓冲液(pH 7.0)洗脱DNA，12 000×g离心3 min，收集DNA，电泳鉴定并定量，–20℃保存备用。(3)探针标记：按照随机引物标记试剂盒(购自美国Promega公司)说明书进行。
, 百拇医药
1.4.2 预杂交反应 将转RNA的尼龙膜放入杂交袋，加入适量的预杂交液，去气泡并封口，65℃保温3 h；剪开杂交袋，倒出预杂交液，每袋加入适量的预杂交液和标记探针，立即封口，放置65℃保温72 h；用2×SSC(含0.1%SDS)于65℃水浴中洗膜3次，每次30 min，膜干后压片，置–70℃、72 h洗片。
2 结果
2.1 对照组和烟碱组HUVEC mRNA的差异显示
对照组和烟碱组HUVEC的mRNA经反转录cDNA后同时用上游引物和下游引物扩增，产物经PAGE电泳后放射自显影，发现60个差异条带，提示两组HUVEC之间mRNA 的差异，有可能反映了两组间基因表达差异。图1为烟碱组HUVEC其中1个差异带CY31的放射自显影图，箭头所指为CY31。
, 百拇医药
图1 PAGE 放射自显影图
Fig.1 Auto-radiographs of PAGE
CDNA fragments was differentially displayed
2.2 对照组与烟碱组HUVEC差异表达cDNA片段(EST)的克隆
从PAGE切下EST，处理后以同样引物扩增，克隆到pGEM-T Easy中，经转化后，利用互补现象来筛选重组质粒。本实验挑选两个阳性克隆1，2(白色)和一个阴性克隆(蓝色)，pGEM-T Easy载体插入位点两边各有一个EcoR 酶切位点，酶切后行1%凝胶电泳，证明有380 bp左右的cDNA插入片段(图2)。
, 百拇医药
图2 EcoR I酶切后重组质粒(B0、B1、B2)PCR产物的1%凝胶电泳图
Fig.2 1%garose gel electrophoretogram of PCR products
of recombinants plasmids B0, B1, B2 digested by EcoR I
1:λDNA/Hind Ⅲ marker; 2: B0/Ec0R I; 3: B1/ EcoR I;
4: B2/ EcoR I; 5: pBR322/ BstN I marker
2.3 Northern 印迹的结果
, 百拇医药
Northern 印迹结果显示，60条EST中有23条有杂交信号且有差异表达，其余片段没有杂交信号或无差异，认为是假阳性条带，未作进一步研究。CY31的Northern 印迹结果(图3)。
图3 Northern 印迹结果
Fig.3 Northern blotting results
2.4 EST阳性克隆的序列测定结果
测序后将克隆序列与基因序列进行序列比较，发现11条未报道同源序列的EST，其中的CY31的序列如下。
GGTCTATCAC
CGACTTTCAG
, 百拇医药
TAAAAACATA
GCTTACAGAG
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AGCTCTGAAT
CAGAGGAGTA
AATGAAATGG
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, 百拇医药
TATTTTGTAC
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3 讨论
AS是一种复杂的遗传性疾病，是多基因、多环境因子相互作用导致的一种渐进性疾病。近几十年来，应用分子生物学和遗传学的研究手段，通过对冠心病动物模型的大量研究，已克隆和分离了一些导致AS和抗AS的基因，并在整体水平上证实了他们的生理功能。但环境因子参与AS的发生发展过程如内皮损伤、脂质沉着、巨嗜细胞及平滑肌细胞形成泡沫细胞(Foam cell)的分子机制尚不清楚。
流行病学研究表明，吸烟是AS发生的危险因素之一，并与高脂血症协同致病。实验室资料显示，烟毒的主要成分烟碱能够减少培养的内皮细胞的总蛋白量，引起动脉的血清脂谱的改变等[3,4]，提示烟碱可能参与AS的病理过程。
, 百拇医药
自1992年mRNA的差异显示技术[2]发明以来，已被广泛用于新基因的克隆和比较同一组织不同发育阶段mRNA差异表达等，借助这种技术，一些新的基因得以发现[5]。我们采用Clonetech公司提供的mRNA差异显示试剂盒优化了引物设计，其随机组合的10个锚定引物和9个Oligo (DT)几乎完全满足整个基因组DNA扩增的需求。实验中，我们找到了60个差异片段，经Northern 印迹证实23条确属差异表达，其余37条为假阳性片段，这个结果与其它实验室报道类似[5,6]。这种假阳性片段的出现，一方面来自实验过程中的技术误差，另一方面源于这种技术本身的局限，如随机引物扩增过程中产生的杂带，高压电流过程的水带等。
对这些经确认的差异表达片段，我们进行了克隆测序，并将序列送基因库比较，发现了11个未报道同源序列的片段，本文报道了其中一个片段的实验结果，寻找全长cDNA的工作仍在进一步进行中。
, 百拇医药 国家863课题
闫道广(1965-),男,河南驻马店人,1996年毕业于第一军医大学,硕士,讲师
参考文献
[1] Gimbrone MA, Cotran RS, Folkman J. Human vascular endothelial cells in culture growth and DNA synthesis[J]. J Cell Biol, 1974, 60:673～78.
[2] Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction: implication for nicotine replacement therapy[J]. Science, 1992, 257:967～71.
, 百拇医药
[3] Benowitz NL, Gourlay SG. Cardiovascular toxicity of nicotine[J]. J Am Coll Cardiol, 1997, 29(7): 1422～31.
[4] Latha MS, Vijaymmal PL, Kurup PA. Effect of nicotine adminis-tration on lipid metabolism in rats[J]. Indian J Med Res, 1993, 98:44～9.
[5] Song Y, Ailenberg M, Silverman M. Cloning of a novel gene in the human kidney homologous to rat munc13s: its potential role in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 1998, 53(6): 1689～95.
[6] Werner JA, Gorogh T, Lippret BM et al. Expression of a novel mRNA in human head and neck squamous cell carcinoma cells[J]. Mol Pathol, 1997, 50(2): 82～6.
1999-06-12, http://www.100md.com