醛固酮合成酶基因mRNA在肝纤维化大鼠体内的表达
作者：李旭 杨希山 孟莹 吴平生 陈琪 李淑梅 赖文岩
单位：李旭(第一军医大学全军消化病研究所)；杨希山(第一军医大学全军消化病研究所)；孟莹(南方医院呼吸科) 吴平生(心内科) 陈琪(惠侨科, 广东 广州 510515) 李淑梅(心内科) 赖文岩(心内科)
关键词：醛固酮合成酶基因；实验性肝纤维化；原位杂交；逆转录聚合酶链反应
第一军医大学学报000309 摘要：目的 探讨醛固酮合成酶基因CYP11B2在正常与肝纤维化大鼠肝组织中的表达。方法 48只雄性Wistar大鼠，随机分为模型组与对照组。模型组：40% CCl4 油2.5 ml/kg× b.w.皮下注射，每周3次；对照组：橄榄油2.5 ml/kg× b.w.皮下注射。于第4、6、8、10周处死大鼠，光镜下观察肝组织形态学变化。RT-PCR和原位杂交法检测CYP11B2 的表达。结果与结论 原位杂交法及RT-PCR检测显示CYP11B2在纤维化形成时表达增强，提示CYP11B2在纤维化肝脏的储脂细胞中表达增强。
, 百拇医药
中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)03-0219-03
Expression of CYP11B2 mRNA in rat with fibrotic liver
LI Xu 1,YANG Xi-shan 1, MENG Ying 2,WU Ping-sheng 3, CHEN Qi4, LI Shu-mei3, LAI Wen-yan 3
(1Institute of Digestive Diseases of PLA, 2Department of Respiratory Diseases; 3Department of Cardiology, 4Department of Hematology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China.)Abstract: Objective In consideration of the facts that aldosterone synthesis may occur in vascular tissue, brain and liver, and locally produced aldosterone is likely to take an active part in fibrogenesis of the liver, we undertook the present study to identify aldosterone synthase gene-CYP11B2 mRNA expression in normal and fibrotic liver of rats. Methods Forty-eight Wistar rats were randomly divided into 2 groups. In the model group, the rats were injected with 40% CCl4 2.5 ml/ kg× b.w. subcutaneously 3 times a week. The rats in the control group were injected with olive oil only. After 4, 6, 8 and 10 weeks, the animals were sacrificed for morphological examination of the hepatic tissue. By means of RT-PCR and in situ hybridization, the expression of aldosterone synthase gene CYP11B2 mRNA in fibrotic and normal liver were detected. Results and Conclusion In situ hybridization and RT-PCR showed that the expression of CYP11B2 mRNA was up-regulated when fibrogenesis occurred. The expression of CYP11B2 mRNA is up-regulated in fibrotic liver.
, 百拇医药
Key words: CYP11B2 gene; hepatic fibrogenesis; RT-PCR
肾上腺外组织中存在肾素- 血管紧张素系统[1]，如心肌、血管[2]、脑[3]等均可合成醛固酮，心肌及血管合成的醛固酮可以促使心肌及血管纤维化形成[5]。近年来研究[4]表明，肝储脂细胞能表达醛固酮合成酶基因- CYP11B2。由于储脂细胞的激活是肝纤维化的中心环节[6、7]，因此储脂细胞表达CYP11B2在肝纤维化的形成过程中可能起着重要的作用。本研究旨在探讨醛固酮合成酶基因CYP11B2在正常与肝纤维化大鼠肝组织中的表达。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
一步法
, http://www.100md.com
一步法RT-PCR试剂盒(德国宝灵曼公司生产)，CYP11B2及鼠β-actin引物(由上海细胞生物研究所合成)， CYP11B2 cDNA 质粒(日本Michiyo I 先生提供)，GDS-7500型凝胶图象分析系统(英国UVP公司生产)。
1.2 动物模型的建立
48只雄性Wistar大鼠(第一军医大学动物中心提供)随机分为模型组和对照组，每组24只。用40% CCl4 油(CCl4 与橄榄油混合物)与橄榄油按2.5 ml/kg× b.w. 分别对模型组和对照组进行皮下注射，每周3次。
1.3 组织学观察
于第4、6、8、10周处死大鼠，取材，甲醛固定，常规石蜡切片，VG染色，光镜下观察。
1.4 总RNA提取
, http://www.100md.com
取第4、8和10周模型组及对照组各6只大鼠的肝组织，- 70℃液氮保存。于液氮中研磨成粉末状，用GTC溶液(6 mol/L异硫氰酸胍、5 mmol/L柠檬酸钠、0.5%十二烷基N甲基甘氨酸钠、0.1mol/L β-巯基乙醇)提取肝组织总RNA。酚、氯仿抽提、纯化。于紫外分光光度计260 nm波长测RNA含量。
1.5 RT-PCR检测
取1μg总RNA按一步法行RT-PCR扩增。
CYP11B2的 PCR引物序列为：5’-ACCATGGATGTCCAGCAA-3’和 5’-GAGAGCTGCCGAGTCTGA-3’[8]，位于CYP11B2基因位点657～954 bp之间，与CYP11B1不发生交叉反应。鼠β-actin作为内参照，其引物序列为：5’-TTTCTGGCAAGTTAGGTTTTGTCAA-3’和 5’-CCTAGCACCATGAAGATCAA -3’[9]，基因片段长度为227 bp。50℃逆转录30 min。PCR 参数设置：92℃变性，2 min×1循环。92℃变性，30 s；56℃退火，30 s；68℃延伸，2 min×10循环。92℃变性，30 s；56℃退火，30 s；68℃延伸，每次循环比上一次循环多5 s×25循环。68℃延伸，7 min×1循环。取 1 μg总RNA模板同法逆转录扩增鼠β-actin。取8 μl PCR产物，2%琼脂糖电泳(图1，从左至右依次为Lane 1～9)。凝胶图象分析系统检测DNA信号灰度。CYP11B2与β-actin灰度之比值表示CYP11B2 mRNA相对水平。
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图1 肝组织CYP11B2及β-actin RT-PCR电泳图
Fig.1 The result of RT-PCR products indicating the expression
of CYP11B2 (297 bp) and β-actin (227 bp) in the liver
Lane 1: β-actin model group (week 4); Lane 9: CYP11B2 model group (week 4);
Lane 2：β-actin model group (week 8); Lane 8: CYP11B2 model group (week 8);
Lane 3：β-actin model group (week 10); Lane 7: CYP11B2 model group (week 10);
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Lane 4：β-actin control group；Lane 6: CYP11B2 control group; Lane 5: Maker
1.6 原位杂交
取第6周模型组及对照组各6只Wistar大鼠的肝组织标本，4%多聚甲醛经血管灌注固定，OCT包埋，冰冻切片，厚度为10 μm。原位杂交前，切片经0.1 mol/L PBS、0.3% TritonX-100、0.1 mol/L 甘氨酸振荡洗涤；2 mg/L PK 37℃孵育30 min，4%多聚甲醛后固定；再用PBS、0.25%乙酸酐/0.1 mol/L 三乙醇氨处理10 min。地高辛标记的探针(2 ng/μl)加入杂交液中，42℃杂交24 h。振荡洗涤后，加抗体(1:500)，4℃反应20 h，用0.05 mol/L PBS、TSM1、TSM2 各洗 20 min ；加入NBT/BCIP避光显色5 h。终止反应，伊红复染，中性树胶封片[10]。未加探针的杂交液作为阴性对照，在高倍镜下随机取7个视野，计算每个视野的平均阳性细胞数。
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1.7 统计学处理
结果以
±s表示，应用SPSS软件包进行方差分析，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 组织学观察
肝组织常规石蜡切片，VG染色，光镜下观察。4周末可见汇管区及中央静脉周围胶原纤维明显增生，尚未形成纤维分隔。6周后可见多数纤维分隔，形成假小叶。
2.2 RT-PCR检测
第4、8和10周的模型组大鼠CYP11B2 mRNA的表达水平均高于对照组(P<0.05)；第4周的模型组大鼠CYP11B2 mRNA的表达水平低于第8、10周(P<0.05)，第8周与第10周相比无显著性差异(P>0.05)(图2)。
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图2 CYP11B2表达的相对水平(n=6)
Fig.2 Expression of CYP11B2 mRNA in different group
Expression of CYP11B2 mRNA in the model groups were significantly higher
than that in the control group (P<0.01). The levels of CYP11B2 mRNA
in the model groups (at 8, 10 week) were higher than that in the model group
(week 4)(P <0.01). There is no significant difference
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between the group after 8 weeks and 10 weeks (P>0.05).
2.3 原位杂交结果
第6周的模型组每高倍镜视野的平均阳性细胞数为4.2，对照组正常大鼠每高倍镜视野的平均阳性细胞数为0.5，有显著性差异(P<0.05)。由此可见，肝纤维化形成时，CYP11B2 mRNA的表达增强。
3 讨论
现已证明醛固酮是胶原合成和有丝分裂的强刺激剂之一，可促进心肌及血管周围纤维化的形成[5]。Structher[11]认为其刺激强度相当于血管紧张素。
研究表明[12]，肾上腺外组织中存在两种基因编码醛固酮合成酶。一种是P45011β(CYP11B1)，它负责醛固酮合成早期阶段的酶的编码；另一种是P450 aldo(CYP11B2)，它编码醛固酮合成后期阶段的关键酶。新近发现[4]，肝脏储脂细胞能表达CYP11B2。本研究RT-PCR及原位杂交结果显示，纤维化形成时CYP11B2 mRNA表达上调。由于储脂细胞是参与肝纤维化形成的最重要的细胞类型之一，它的激活与转化是纤维化形成的中心环节和必要条件[6、7]。因此，CYP11B2在肝储脂细胞中表达上调提示肝储脂细胞合成醛固酮对肝纤维化形成可能具有促进作用。本研究对于拓展肝纤维化机制的研究具有重要意义，为肝纤维化的防治提供了一条新的途径。
, http://www.100md.com
郑萍(1973-)，四川成都人，1995年毕业于华西医科大学，本科，药师
参考文献
[1] Takeda R, Miyamori I. Endocrine and auto-paracrine factors in the pathogenesis of primary hypertension[J]. Hypertens Res, 1995, 18(3): 171～9.
[2] Takeda R, Hatakeyama H, Takeda Y et al. Aldosterone biosynthesis and action in vascular cells[J]. Steroids，1995, 60 (1):120～4.
[3] Hatakeyama H, Miyamori I, Fujita T et al. Vascular aldosterone: biosynthesis and a link to angiotensin induced hypertrophy of vascularsmooth muscle cells[J]. J Bio Chem, 1994, 269(39):24316～20.
, 百拇医药
[4] 吴平生，粱欣伟，戴 云等.肾上腺外组织合成醛固酮[J].中华心血管病杂志，1998, 26(2)：139～41.
[5] Brilla CG, Weber KT. Mineralocorticoid excess, dietary sodium, and myocardial fibrosis[J]. J Lab Clin Med, 1992, 120:893～901.
[6] Minato Y, Hasumura Y, Takeuchi J. The role of fat-storing cells in Disse space fibrogenesis in alcoholic liver disease[J]. Hepatology, 1983, 3:559～66.
[7] Okanoue T, Burbige EJ, French SW. The role of the Ito cell in perivenular and intralobular fibrosis in alcoholic hepatitis[J]. Arch Pathol Lab Med, 1983, 107:459～63.
, 百拇医药
[8] Oaks MK, Raff H. Differentiation of the expression of aldosterone synthase and 11b - hydroxylase mRNA in the rat adrenal cortex by reverse transcriptase polymerase chain reaction[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 1995, 54:193～9.
[9] Nishimura J, Chen X, Jahan X et al. cAMP induces up-regulation of ETA receptor mRNA and increases responsiveness to endothelin-1 of rat aortic smooth muscle cells in primary culture[J]. Biochem Biophy Res Commun, 1992, 188:719～26.
, http://www.100md.com
[10] Yabu M, Senda T, Nonaka Y et al. Localization of the gene transcripts of 11β-hydroxylase and aldosterone synthase in the rat adrenal cortex by in situ hybridization[J]. Histochemistry, 1991, 96: 391～4.
[11] Struthers AD. Aldosterone escape during angiotensin converting enzyme inhibitor therapy in chronic heart failure[J]. J card Fail, 1996, 2(1):47～54.
[12] Gomez Sanchez EP, Zhou M, Gomez Sanchez CE. Mineralocorticoids, salt and high blood pressure[J]. Steroids, 1996, 61: (4):184～8.
1999-11-15, 百拇医药
单位：李旭(第一军医大学全军消化病研究所)；杨希山(第一军医大学全军消化病研究所)；孟莹(南方医院呼吸科) 吴平生(心内科) 陈琪(惠侨科, 广东 广州 510515) 李淑梅(心内科) 赖文岩(心内科)
关键词：醛固酮合成酶基因；实验性肝纤维化；原位杂交；逆转录聚合酶链反应
第一军医大学学报000309 摘要：目的 探讨醛固酮合成酶基因CYP11B2在正常与肝纤维化大鼠肝组织中的表达。方法 48只雄性Wistar大鼠，随机分为模型组与对照组。模型组：40% CCl4 油2.5 ml/kg× b.w.皮下注射，每周3次；对照组：橄榄油2.5 ml/kg× b.w.皮下注射。于第4、6、8、10周处死大鼠，光镜下观察肝组织形态学变化。RT-PCR和原位杂交法检测CYP11B2 的表达。结果与结论 原位杂交法及RT-PCR检测显示CYP11B2在纤维化形成时表达增强，提示CYP11B2在纤维化肝脏的储脂细胞中表达增强。
, 百拇医药
中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)03-0219-03
Expression of CYP11B2 mRNA in rat with fibrotic liver
LI Xu 1,YANG Xi-shan 1, MENG Ying 2,WU Ping-sheng 3, CHEN Qi4, LI Shu-mei3, LAI Wen-yan 3
(1Institute of Digestive Diseases of PLA, 2Department of Respiratory Diseases; 3Department of Cardiology, 4Department of Hematology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China.)Abstract: Objective In consideration of the facts that aldosterone synthesis may occur in vascular tissue, brain and liver, and locally produced aldosterone is likely to take an active part in fibrogenesis of the liver, we undertook the present study to identify aldosterone synthase gene-CYP11B2 mRNA expression in normal and fibrotic liver of rats. Methods Forty-eight Wistar rats were randomly divided into 2 groups. In the model group, the rats were injected with 40% CCl4 2.5 ml/ kg× b.w. subcutaneously 3 times a week. The rats in the control group were injected with olive oil only. After 4, 6, 8 and 10 weeks, the animals were sacrificed for morphological examination of the hepatic tissue. By means of RT-PCR and in situ hybridization, the expression of aldosterone synthase gene CYP11B2 mRNA in fibrotic and normal liver were detected. Results and Conclusion In situ hybridization and RT-PCR showed that the expression of CYP11B2 mRNA was up-regulated when fibrogenesis occurred. The expression of CYP11B2 mRNA is up-regulated in fibrotic liver.
, 百拇医药
Key words: CYP11B2 gene; hepatic fibrogenesis; RT-PCR
肾上腺外组织中存在肾素- 血管紧张素系统[1]，如心肌、血管[2]、脑[3]等均可合成醛固酮，心肌及血管合成的醛固酮可以促使心肌及血管纤维化形成[5]。近年来研究[4]表明，肝储脂细胞能表达醛固酮合成酶基因- CYP11B2。由于储脂细胞的激活是肝纤维化的中心环节[6、7]，因此储脂细胞表达CYP11B2在肝纤维化的形成过程中可能起着重要的作用。本研究旨在探讨醛固酮合成酶基因CYP11B2在正常与肝纤维化大鼠肝组织中的表达。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
一步法
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一步法RT-PCR试剂盒(德国宝灵曼公司生产)，CYP11B2及鼠β-actin引物(由上海细胞生物研究所合成)， CYP11B2 cDNA 质粒(日本Michiyo I 先生提供)，GDS-7500型凝胶图象分析系统(英国UVP公司生产)。
1.2 动物模型的建立
48只雄性Wistar大鼠(第一军医大学动物中心提供)随机分为模型组和对照组，每组24只。用40% CCl4 油(CCl4 与橄榄油混合物)与橄榄油按2.5 ml/kg× b.w. 分别对模型组和对照组进行皮下注射，每周3次。
1.3 组织学观察
于第4、6、8、10周处死大鼠，取材，甲醛固定，常规石蜡切片，VG染色，光镜下观察。
1.4 总RNA提取
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取第4、8和10周模型组及对照组各6只大鼠的肝组织，- 70℃液氮保存。于液氮中研磨成粉末状，用GTC溶液(6 mol/L异硫氰酸胍、5 mmol/L柠檬酸钠、0.5%十二烷基N甲基甘氨酸钠、0.1mol/L β-巯基乙醇)提取肝组织总RNA。酚、氯仿抽提、纯化。于紫外分光光度计260 nm波长测RNA含量。
1.5 RT-PCR检测
取1μg总RNA按一步法行RT-PCR扩增。
CYP11B2的 PCR引物序列为：5’-ACCATGGATGTCCAGCAA-3’和 5’-GAGAGCTGCCGAGTCTGA-3’[8]，位于CYP11B2基因位点657～954 bp之间，与CYP11B1不发生交叉反应。鼠β-actin作为内参照，其引物序列为：5’-TTTCTGGCAAGTTAGGTTTTGTCAA-3’和 5’-CCTAGCACCATGAAGATCAA -3’[9]，基因片段长度为227 bp。50℃逆转录30 min。PCR 参数设置：92℃变性，2 min×1循环。92℃变性，30 s；56℃退火，30 s；68℃延伸，2 min×10循环。92℃变性，30 s；56℃退火，30 s；68℃延伸，每次循环比上一次循环多5 s×25循环。68℃延伸，7 min×1循环。取 1 μg总RNA模板同法逆转录扩增鼠β-actin。取8 μl PCR产物，2%琼脂糖电泳(图1，从左至右依次为Lane 1～9)。凝胶图象分析系统检测DNA信号灰度。CYP11B2与β-actin灰度之比值表示CYP11B2 mRNA相对水平。
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图1 肝组织CYP11B2及β-actin RT-PCR电泳图
Fig.1 The result of RT-PCR products indicating the expression
of CYP11B2 (297 bp) and β-actin (227 bp) in the liver
Lane 1: β-actin model group (week 4); Lane 9: CYP11B2 model group (week 4);
Lane 2：β-actin model group (week 8); Lane 8: CYP11B2 model group (week 8);
Lane 3：β-actin model group (week 10); Lane 7: CYP11B2 model group (week 10);
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Lane 4：β-actin control group；Lane 6: CYP11B2 control group; Lane 5: Maker
1.6 原位杂交
取第6周模型组及对照组各6只Wistar大鼠的肝组织标本，4%多聚甲醛经血管灌注固定，OCT包埋，冰冻切片，厚度为10 μm。原位杂交前，切片经0.1 mol/L PBS、0.3% TritonX-100、0.1 mol/L 甘氨酸振荡洗涤；2 mg/L PK 37℃孵育30 min，4%多聚甲醛后固定；再用PBS、0.25%乙酸酐/0.1 mol/L 三乙醇氨处理10 min。地高辛标记的探针(2 ng/μl)加入杂交液中，42℃杂交24 h。振荡洗涤后，加抗体(1:500)，4℃反应20 h，用0.05 mol/L PBS、TSM1、TSM2 各洗 20 min ；加入NBT/BCIP避光显色5 h。终止反应，伊红复染，中性树胶封片[10]。未加探针的杂交液作为阴性对照，在高倍镜下随机取7个视野，计算每个视野的平均阳性细胞数。
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1.7 统计学处理
结果以
±s表示，应用SPSS软件包进行方差分析，P<0.05为有统计学意义。2 结果
2.1 组织学观察
肝组织常规石蜡切片，VG染色，光镜下观察。4周末可见汇管区及中央静脉周围胶原纤维明显增生，尚未形成纤维分隔。6周后可见多数纤维分隔，形成假小叶。
2.2 RT-PCR检测
第4、8和10周的模型组大鼠CYP11B2 mRNA的表达水平均高于对照组(P<0.05)；第4周的模型组大鼠CYP11B2 mRNA的表达水平低于第8、10周(P<0.05)，第8周与第10周相比无显著性差异(P>0.05)(图2)。
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图2 CYP11B2表达的相对水平(n=6)
Fig.2 Expression of CYP11B2 mRNA in different group
Expression of CYP11B2 mRNA in the model groups were significantly higher
than that in the control group (P<0.01). The levels of CYP11B2 mRNA
in the model groups (at 8, 10 week) were higher than that in the model group
(week 4)(P <0.01). There is no significant difference
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between the group after 8 weeks and 10 weeks (P>0.05).
2.3 原位杂交结果
第6周的模型组每高倍镜视野的平均阳性细胞数为4.2，对照组正常大鼠每高倍镜视野的平均阳性细胞数为0.5，有显著性差异(P<0.05)。由此可见，肝纤维化形成时，CYP11B2 mRNA的表达增强。
3 讨论
现已证明醛固酮是胶原合成和有丝分裂的强刺激剂之一，可促进心肌及血管周围纤维化的形成[5]。Structher[11]认为其刺激强度相当于血管紧张素。
研究表明[12]，肾上腺外组织中存在两种基因编码醛固酮合成酶。一种是P45011β(CYP11B1)，它负责醛固酮合成早期阶段的酶的编码；另一种是P450 aldo(CYP11B2)，它编码醛固酮合成后期阶段的关键酶。新近发现[4]，肝脏储脂细胞能表达CYP11B2。本研究RT-PCR及原位杂交结果显示，纤维化形成时CYP11B2 mRNA表达上调。由于储脂细胞是参与肝纤维化形成的最重要的细胞类型之一，它的激活与转化是纤维化形成的中心环节和必要条件[6、7]。因此，CYP11B2在肝储脂细胞中表达上调提示肝储脂细胞合成醛固酮对肝纤维化形成可能具有促进作用。本研究对于拓展肝纤维化机制的研究具有重要意义，为肝纤维化的防治提供了一条新的途径。
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郑萍(1973-)，四川成都人，1995年毕业于华西医科大学，本科，药师
参考文献
[1] Takeda R, Miyamori I. Endocrine and auto-paracrine factors in the pathogenesis of primary hypertension[J]. Hypertens Res, 1995, 18(3): 171～9.
[2] Takeda R, Hatakeyama H, Takeda Y et al. Aldosterone biosynthesis and action in vascular cells[J]. Steroids，1995, 60 (1):120～4.
[3] Hatakeyama H, Miyamori I, Fujita T et al. Vascular aldosterone: biosynthesis and a link to angiotensin induced hypertrophy of vascularsmooth muscle cells[J]. J Bio Chem, 1994, 269(39):24316～20.
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[4] 吴平生，粱欣伟，戴 云等.肾上腺外组织合成醛固酮[J].中华心血管病杂志，1998, 26(2)：139～41.
[5] Brilla CG, Weber KT. Mineralocorticoid excess, dietary sodium, and myocardial fibrosis[J]. J Lab Clin Med, 1992, 120:893～901.
[6] Minato Y, Hasumura Y, Takeuchi J. The role of fat-storing cells in Disse space fibrogenesis in alcoholic liver disease[J]. Hepatology, 1983, 3:559～66.
[7] Okanoue T, Burbige EJ, French SW. The role of the Ito cell in perivenular and intralobular fibrosis in alcoholic hepatitis[J]. Arch Pathol Lab Med, 1983, 107:459～63.
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[8] Oaks MK, Raff H. Differentiation of the expression of aldosterone synthase and 11b - hydroxylase mRNA in the rat adrenal cortex by reverse transcriptase polymerase chain reaction[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 1995, 54:193～9.
[9] Nishimura J, Chen X, Jahan X et al. cAMP induces up-regulation of ETA receptor mRNA and increases responsiveness to endothelin-1 of rat aortic smooth muscle cells in primary culture[J]. Biochem Biophy Res Commun, 1992, 188:719～26.
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[10] Yabu M, Senda T, Nonaka Y et al. Localization of the gene transcripts of 11β-hydroxylase and aldosterone synthase in the rat adrenal cortex by in situ hybridization[J]. Histochemistry, 1991, 96: 391～4.
[11] Struthers AD. Aldosterone escape during angiotensin converting enzyme inhibitor therapy in chronic heart failure[J]. J card Fail, 1996, 2(1):47～54.
[12] Gomez Sanchez EP, Zhou M, Gomez Sanchez CE. Mineralocorticoids, salt and high blood pressure[J]. Steroids, 1996, 61: (4):184～8.
1999-11-15, 百拇医药
参见：首页 > 医疗版 > 疾病专题 > 内分泌科 > 肾上腺疾病 > 原发性醛固酮增多症