p38蛋白激酶不同亚型在RAW264.7细胞中的定位
作者：张琳 姜勇 张璐
单位：张琳(1969-)，女，河南郑州人，1999年毕业于第一军医大学，博士；张琳(第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室，广东 广州 510515)；姜勇(第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室，广东 广州 510515)；张璐(第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室，广东 广州 510515)
关键词：p38蛋白激酶；亚型；定位
第一军医大学学报000301 摘要：目的 探讨p38的4种亚型在细胞中的分布以及对外界刺激的反应。方法 应用激光共聚焦显微镜对RAW264.7单核细胞内的4种亚型进行定位观察。结果 p38a 、p38b 在未受刺激的静息细胞内的荧光强度呈弥散性分布，受脂多糖(LPS)刺激后，细胞核荧光强度明显增强，细胞浆荧光强度降低，提示LPS诱导p38a 和p38b 磷酸化活化后移位入细胞核。p38g 在静息和受LPS刺激后的细胞中均呈散在、弥漫性地分布，提示p38g 刺激后无移位现象。静息时，p38d 弥散地分布于细胞，刺激后细胞核膜部荧光强度增高，提示受刺激后p38d 移位于核膜周围。结论 p38不同亚型在细胞受LPS刺激后移位表现不同，可能与它们在组织和细胞分布的特异性及作用途径有关。
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中图分类号：Q55； R-33 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0193-04
The intracellular localization of p38 mitogen-activated protein kinase isoforms in RAW264.7 cells
ZHANG Lin, JIANG Yong, ZHANG Lu
(Department of Pathophysiology and Key Lab for Shock and Microcirculation of PLA, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To elucidate the specific mechanisms of p38 MAPK signal transduction. Methods Laser scanning confocal microscope was used to investigate the distribution of the 4 isoforms of p38 in RAW264.7 cells. Results p38a and p38b labeled with fluorescence spread all over the cytosol and nuclei in the quiescent RAW264.7 cells, while the fluorescent intensity in the cytosol area decreased and the fluorescent intensity in the nuclear area increased after lipopolysaccharide (LPS) stimulation, which indicates that p38a and p38b moved to the nuclei of RAW264.7 cells on the stimulation of LPS. p38g labeled with fluorescence scattered all over the RAW264.7 cells before and after LPS stimulation, which indicated p38g did not move to the nuclei after LPS stimulation. p38d also distributed in the cytosol in the quiescent RAW cells, and moved to the area around the nuclear membrane. Conclusion The translocations of p38 isoforms after LPS stimulation were different, indicating that different p38 isoforms mediate the signal transduction to specific target by different subcellular localizations.
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Key words: p38 MAPK; isoform; localization
细胞对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)反应引起多种蛋白发生酪氨酸磷酸化。在鉴定这些磷酸化蛋白质的研究中，Han[1, 2]首先发现和克隆了p38 MAPK(Mitogen-activated Protein Kinase)，并进一步证实p38可被细菌成分、致炎因子和物理-化学刺激等激活[3～5]。随后，有学者[6～8]发现和克隆了3个新的p38亚型， 即p38β、p38γ和p38δ。实验[3、5]表明p38家族4种亚型除了序列相似之外，还具有一些共同特征，如4种激酶都包含维持激酶活性所必需的“TGY”双磷酸化基，和其它激酶相比具有较短的磷酸化环状结构等。但进一步实验[4、9]发现，这些同源激酶之间确有一定的差异。p38 和p38β几乎在所有组织表达，而p38γ mRNA主要在骨骼肌表达，p38δ主要在肾和肺组织内表达[6，7，8]，因此对4种亚型在细胞定位的研究将有助于进一步阐明其特异性功能及p38 MAPK信号通路在细胞中特异性传导的分子机制。本研究应用共聚焦激光扫描技术观察了p38蛋白激酶不同亚型在RAW264.7细胞中的分布及其对外界刺激的反应。
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1 材料和方法
1.1 实验仪器
ACAS 570激光扫描共聚焦显微镜 (Laser scanning confocal microscope，LSCM)、35 mm Petri细胞培养皿(美国Meridian Instrument公司生产)；二氧化碳式培养箱(NAPCO2-5420-1，购自美国精密科学公司)，倒置显微镜IMT-2(日本Olympus公司生产)，超净工作台(苏州净化仪器厂生产)。
1.2 实验材料
鼠抗人p38α、p38β、p38γ、p38δ 4种特异性抗体及单核细胞株RAW264.7(由美国The Scripps Research Institute的Han J教授馈赠)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(购自军事医学科学院)，LPS、内皮生长因子(EGF，购自Sigma公司)。
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1.3 细胞培养
用0.25%的胰酶消化对数生长期的单核细胞株RAW264.7，用DMEM完全培养基调节细胞浓度为1×109/L，并接种于含5%小牛血清的DMEM培养液中，在改良的Petri皿中，放入的二氧化碳水套式培养箱(5%CO2)中培养。
1.4 细胞的刺激与抗原抗体反应
实验共分4组：(1)p38α；(2)p38β；(3)p38γ；(4)p38δ。(1)按以下3个步骤进行：(a)单核细胞株RAW264.7用LPS(100 ng/ml)刺激45 min后，用PBS于4℃清洗2遍。用1%多聚甲醛+0.025%戊二醛的固定液固定2 h，PBS漂洗5 min，放入湿盒，滴加稀释的p38α单抗(1∶2 000)，混匀，4℃过夜。PBS振动洗涤10 min，加入FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，于37℃湿盒避光孵育30～60 min，吸出染液，PBS冲洗10 min，Petri皿底留少许缓冲液待测；(b)单核细胞株血清饥饿5 h后用EGF(10 nmol/L)刺激30 min后固定；(C)单核细胞株为不加任何刺激的阴性对照组，其它步骤同(a)。同法处理(2)、(3)、(4)。
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1.5 激光扫描共聚焦显微镜检测
应用ACAS570型激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦激光断层扫描。仪器主要参数：激发光波长488 nm，荧光波长530 nm，孔径=400 μm，X、Y步长=0.2 μm，X/Y 点数=60，样品数=10，Z步长=0.8 μm，激光功率=10～20 MW。
2 结果
2.1 p38α、p38β、p38γ、p38δ蛋白激酶在细胞中分布
用ACAS570上的共聚焦功能(Confocal option)，选择测量区域内的1个细胞做共聚焦荧光断层扫描成像，细胞荧光断层扫描从培养皿的底部向上扫描，每个细胞扫50幅图，均选中间第25幅对比。图1为p38α、p38δ、p38γ、p38δ 4个亚型在RAW细胞静息时共聚焦断层扫描图。由图1所示，上述 4个亚型在细胞中均呈弥散分布，但有一定差别。p38α、p38β不仅在胞浆中大量存在，在核区也存在一定数量，提示基本的细胞功能需要一定基础水平的p38α和p38β的核区激酶活性。由于转录因子是p38蛋白激酶的重要作用目标，因此，p38可能参与了静息状态下细胞正常生理活动相关基因的转录调控。而p38γ和p38δ在静息状态下几乎全部存在于胞浆，核区出现明显的阴影，提示这两种亚型的蛋白激酶与p38α和p38β生理作用底物明显不同。
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图 1 p38的4种亚型在未受外界刺激的RAW细胞内分布
Fig.1 Subcellular localization of p38 isoforms in quiescent RAW cells
2.2 LPS诱导不同p38亚型的移位
对LPS诱导RAW细胞p38α、p38β、p38γ 、p38δ 4种亚型移位情况进行共聚焦断层扫描成像，可见4种亚型在LPS刺激45 min后核区荧光强度表现不同(图2)。p38α、p38β2种亚型在LPS刺激45 min后核区荧光强度显著增强。p38γ刺激前后在细胞中均呈散在性分布；p38δ在LPS刺激45 min后核区荧光强度明显降低，提示p38α、p38β在LPS刺激后移位至细胞核；p38γ在LPS刺激后无明显移位现象；p38δ在LPS刺激后在核区周围集中。上述方法均重复3次。而在EGF刺激的RAW细胞中p38α、p38β、p38γ、p38δ4种亚型的分布与未受刺激的静息细胞相似(图3)。
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图 2 p38的 4种亚型在LPS刺激时的RAW细胞内分布
Fig.2 Subcellular localization of p38 isoforms in RAW cells stimulated with LPS
图 3 p38的4种亚型在EGF刺激时共聚焦断层扫描图
Fig.3 Subcellular localization of p38 isoforms in
RAW cells treated with endothelial growth factor
3讨论
迄今，在哺乳动物细胞已发现4条MAPK信号传导通路，即细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal regulated protein kinases，ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、p38通路及ERK5通路。它们参与细胞生长、发育、分裂、细胞间的功能同步以及对环境的适应等多种生理过程，并在应激、炎症、细胞恶性转化等病理过程中起重要作用。
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p38通路是最近发现的一条MAPK信号传导通路。这条通路参与炎症、应激等病理生理反应。p38蛋白激酶包括p38α、p38β、 p38γ和 p38δ4种亚型。研究表明，4种亚型之间有一定相似之处，如4种亚型氨基酸序列非常接近，与p38在蛋白质水平分别有74%、60%和60%的相同，和p38的Loop-12环状结构长度相同，都包含Thr-Gly-Tyr双磷酸化基。进一步实验表明，4个同源体在组织分布、上游激酶调节、下游底物作用、对细胞外刺激的反应以及p38特异性抑制剂(FHPI)的抑制作用方面都各有不同的特点[7]。
这些不同亚型之间具有不同的组织和细胞特异性，可能在细胞信号传导的特异性方面起到一定的作用。另外，在同一细胞内可能存在着不同的p38亚型，这些亚型在细胞内定位的差异可能是这条信号通路的特异性传导在不同细胞介导细胞特异性反应的机制之一。
本研究发现，p38α、p38β在未受刺激的静息单核细胞，其荧光强度弥散性分布于胞浆中，胞核区域也有一定的荧光强度分布，提示p38α和p38β蛋白激酶亚型在未激活前散在、弥漫性地分布于细胞中。单核细胞受到LPS刺激后，细胞核p38α、p38β标记荧光强度明显增强，细胞浆荧光强度降低，提示单核细胞在LPS作用下，其p38α、p38β由胞浆移位到胞核。而EGF刺激的单核细胞，情况与静息单核细胞相似，未见明显的p38α、p38β移核现象，说明LPS引起的p38 MAPK入核有一定的特异性。这与以前在其它细胞所观察到的LPS能激活p38，而EGF无明显激活作用相一致。p38γ在静息的单核细胞中均呈散在、弥漫性地分布细胞浆中；在LPS刺激后，RAW细胞荧光分布无明显变化，提示在RAW细胞LPS刺激刺激后p38g 无移位现象。p38δ在静息细胞主要弥散性地分布于胞浆中，LPS刺激后细胞核区周围荧光强度增高，提示p38δ受刺激后移位于核膜区域。有报道认为其它MAPK如 ERK1、JNK1在受到刺激后进入细胞核，然而，至今尚未见有关不同MAPK亚型对同一外源刺激反应带来不同移位效应的报道。目前已阐明受p38通路调控的细胞内靶蛋白主要包括两类：一是位于细胞核区的转录因子，如ATF2、MEF2C、CHOP10等；二是胞浆的蛋白激酶，如MAPKAPK2/3、PRAK等。p38α和p38β在受到LPS刺激后进入细胞核，可能作用于相应的转录因子调控多种炎症反应相关基因的表达。现普遍认为激活的MAPK进入细胞核，激活有关的转录因子，使相关基因表达是MAPK介导细胞反应的重要机制之一。在细胞受到LPS刺激后，其他两种p38亚型与p38α和p38β表现不同。p38γ位于胞浆中，在LPS刺激后无移位现象，这提示p38γ有可能作用于细胞浆中的其他酶类，如MAPKAPK2/3、PRAK等。前期的研究表明，p38可通过磷酸化激活MAPKAPK2/3和PRAK，这些激酶可进一步磷酸化低分子量热休克蛋白HSP27，通过改变肌动蛋白的构成形式而影响细胞骨架结构。目前尚不清楚这些细胞内激酶与不同p38亚型之间的对应关系，而这种关系的建立将为阐明p38通路的生物学功能奠定物质基础。本实验证实4种p38亚型在LPS刺激后移位表现不同，可能与它们在组织和细胞中分布的特异性及作用途径有关，但其具体的分子作用机制尚有待进一步研究。
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国家杰出青年科学基金资助(39925014)、国家自然科学基金重点(39830400)、面上项目(39800074，39870332)、军队杰出人才基金(98J003)和广东省自然科学基金(980207)资助
参考文献
[1] Han J, Lee JD, Tobias PS et al. Endotoxin induces rapid protein tyrosine phosphorylation in 70Z/3 cells expressing CD14[J]. J Biol Chem, 1993, 268: 25009～14.
[2] Han J, Lee JD, Bibbs L et al. A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells[J].Science, 1994, 265: 808～11.
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[3] Davis RJ. MAPKs: new JNK expands the group[J].TIBS, 1994, 19:470～3.
[4] Derijard B, Raingeaud J, Barrett T et al. Independent human MAP kinase signal transduction pathways defined by MEK and MKK isoforms[J]. Science, 1995, 269: 682～5.
[5] Lee JC, Young PR. Role of CSBP/p38/RK stress response kinase in LPS and cytokine signaling mechanisms[J]. J Leukoc Biol, 1996, 59: 152～7.
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[8] Jiang Y, Gram H, Zhao M et al.Characterization of the structure and function of the fourth member of p38 group MAP kinases- p38d [J]. J Biol Chem, 1997, 272(48):30122～8.
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[10] Zhou G, Bao ZQ, Dixon JE. Components of a new human protein kinase signal transduction pathway[J]. J Biol Chem, 1995, 270:12665～9.
1999-12-21, 百拇医药
单位：张琳(1969-)，女，河南郑州人，1999年毕业于第一军医大学，博士；张琳(第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室，广东 广州 510515)；姜勇(第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室，广东 广州 510515)；张璐(第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室，广东 广州 510515)
关键词：p38蛋白激酶；亚型；定位
第一军医大学学报000301 摘要：目的 探讨p38的4种亚型在细胞中的分布以及对外界刺激的反应。方法 应用激光共聚焦显微镜对RAW264.7单核细胞内的4种亚型进行定位观察。结果 p38a 、p38b 在未受刺激的静息细胞内的荧光强度呈弥散性分布，受脂多糖(LPS)刺激后，细胞核荧光强度明显增强，细胞浆荧光强度降低，提示LPS诱导p38a 和p38b 磷酸化活化后移位入细胞核。p38g 在静息和受LPS刺激后的细胞中均呈散在、弥漫性地分布，提示p38g 刺激后无移位现象。静息时，p38d 弥散地分布于细胞，刺激后细胞核膜部荧光强度增高，提示受刺激后p38d 移位于核膜周围。结论 p38不同亚型在细胞受LPS刺激后移位表现不同，可能与它们在组织和细胞分布的特异性及作用途径有关。
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中图分类号：Q55； R-33 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0193-04
The intracellular localization of p38 mitogen-activated protein kinase isoforms in RAW264.7 cells
ZHANG Lin, JIANG Yong, ZHANG Lu
(Department of Pathophysiology and Key Lab for Shock and Microcirculation of PLA, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To elucidate the specific mechanisms of p38 MAPK signal transduction. Methods Laser scanning confocal microscope was used to investigate the distribution of the 4 isoforms of p38 in RAW264.7 cells. Results p38a and p38b labeled with fluorescence spread all over the cytosol and nuclei in the quiescent RAW264.7 cells, while the fluorescent intensity in the cytosol area decreased and the fluorescent intensity in the nuclear area increased after lipopolysaccharide (LPS) stimulation, which indicates that p38a and p38b moved to the nuclei of RAW264.7 cells on the stimulation of LPS. p38g labeled with fluorescence scattered all over the RAW264.7 cells before and after LPS stimulation, which indicated p38g did not move to the nuclei after LPS stimulation. p38d also distributed in the cytosol in the quiescent RAW cells, and moved to the area around the nuclear membrane. Conclusion The translocations of p38 isoforms after LPS stimulation were different, indicating that different p38 isoforms mediate the signal transduction to specific target by different subcellular localizations.
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Key words: p38 MAPK; isoform; localization
细胞对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)反应引起多种蛋白发生酪氨酸磷酸化。在鉴定这些磷酸化蛋白质的研究中，Han[1, 2]首先发现和克隆了p38 MAPK(Mitogen-activated Protein Kinase)，并进一步证实p38可被细菌成分、致炎因子和物理-化学刺激等激活[3～5]。随后，有学者[6～8]发现和克隆了3个新的p38亚型， 即p38β、p38γ和p38δ。实验[3、5]表明p38家族4种亚型除了序列相似之外，还具有一些共同特征，如4种激酶都包含维持激酶活性所必需的“TGY”双磷酸化基，和其它激酶相比具有较短的磷酸化环状结构等。但进一步实验[4、9]发现，这些同源激酶之间确有一定的差异。p38 和p38β几乎在所有组织表达，而p38γ mRNA主要在骨骼肌表达，p38δ主要在肾和肺组织内表达[6，7，8]，因此对4种亚型在细胞定位的研究将有助于进一步阐明其特异性功能及p38 MAPK信号通路在细胞中特异性传导的分子机制。本研究应用共聚焦激光扫描技术观察了p38蛋白激酶不同亚型在RAW264.7细胞中的分布及其对外界刺激的反应。
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1 材料和方法
1.1 实验仪器
ACAS 570激光扫描共聚焦显微镜 (Laser scanning confocal microscope，LSCM)、35 mm Petri细胞培养皿(美国Meridian Instrument公司生产)；二氧化碳式培养箱(NAPCO2-5420-1，购自美国精密科学公司)，倒置显微镜IMT-2(日本Olympus公司生产)，超净工作台(苏州净化仪器厂生产)。
1.2 实验材料
鼠抗人p38α、p38β、p38γ、p38δ 4种特异性抗体及单核细胞株RAW264.7(由美国The Scripps Research Institute的Han J教授馈赠)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(购自军事医学科学院)，LPS、内皮生长因子(EGF，购自Sigma公司)。
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1.3 细胞培养
用0.25%的胰酶消化对数生长期的单核细胞株RAW264.7，用DMEM完全培养基调节细胞浓度为1×109/L，并接种于含5%小牛血清的DMEM培养液中，在改良的Petri皿中，放入的二氧化碳水套式培养箱(5%CO2)中培养。
1.4 细胞的刺激与抗原抗体反应
实验共分4组：(1)p38α；(2)p38β；(3)p38γ；(4)p38δ。(1)按以下3个步骤进行：(a)单核细胞株RAW264.7用LPS(100 ng/ml)刺激45 min后，用PBS于4℃清洗2遍。用1%多聚甲醛+0.025%戊二醛的固定液固定2 h，PBS漂洗5 min，放入湿盒，滴加稀释的p38α单抗(1∶2 000)，混匀，4℃过夜。PBS振动洗涤10 min，加入FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，于37℃湿盒避光孵育30～60 min，吸出染液，PBS冲洗10 min，Petri皿底留少许缓冲液待测；(b)单核细胞株血清饥饿5 h后用EGF(10 nmol/L)刺激30 min后固定；(C)单核细胞株为不加任何刺激的阴性对照组，其它步骤同(a)。同法处理(2)、(3)、(4)。
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1.5 激光扫描共聚焦显微镜检测
应用ACAS570型激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦激光断层扫描。仪器主要参数：激发光波长488 nm，荧光波长530 nm，孔径=400 μm，X、Y步长=0.2 μm，X/Y 点数=60，样品数=10，Z步长=0.8 μm，激光功率=10～20 MW。
2 结果
2.1 p38α、p38β、p38γ、p38δ蛋白激酶在细胞中分布
用ACAS570上的共聚焦功能(Confocal option)，选择测量区域内的1个细胞做共聚焦荧光断层扫描成像，细胞荧光断层扫描从培养皿的底部向上扫描，每个细胞扫50幅图，均选中间第25幅对比。图1为p38α、p38δ、p38γ、p38δ 4个亚型在RAW细胞静息时共聚焦断层扫描图。由图1所示，上述 4个亚型在细胞中均呈弥散分布，但有一定差别。p38α、p38β不仅在胞浆中大量存在，在核区也存在一定数量，提示基本的细胞功能需要一定基础水平的p38α和p38β的核区激酶活性。由于转录因子是p38蛋白激酶的重要作用目标，因此，p38可能参与了静息状态下细胞正常生理活动相关基因的转录调控。而p38γ和p38δ在静息状态下几乎全部存在于胞浆，核区出现明显的阴影，提示这两种亚型的蛋白激酶与p38α和p38β生理作用底物明显不同。
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图 1 p38的4种亚型在未受外界刺激的RAW细胞内分布
Fig.1 Subcellular localization of p38 isoforms in quiescent RAW cells
2.2 LPS诱导不同p38亚型的移位
对LPS诱导RAW细胞p38α、p38β、p38γ 、p38δ 4种亚型移位情况进行共聚焦断层扫描成像，可见4种亚型在LPS刺激45 min后核区荧光强度表现不同(图2)。p38α、p38β2种亚型在LPS刺激45 min后核区荧光强度显著增强。p38γ刺激前后在细胞中均呈散在性分布；p38δ在LPS刺激45 min后核区荧光强度明显降低，提示p38α、p38β在LPS刺激后移位至细胞核；p38γ在LPS刺激后无明显移位现象；p38δ在LPS刺激后在核区周围集中。上述方法均重复3次。而在EGF刺激的RAW细胞中p38α、p38β、p38γ、p38δ4种亚型的分布与未受刺激的静息细胞相似(图3)。
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图 2 p38的 4种亚型在LPS刺激时的RAW细胞内分布
Fig.2 Subcellular localization of p38 isoforms in RAW cells stimulated with LPS
图 3 p38的4种亚型在EGF刺激时共聚焦断层扫描图
Fig.3 Subcellular localization of p38 isoforms in
RAW cells treated with endothelial growth factor
3讨论
迄今，在哺乳动物细胞已发现4条MAPK信号传导通路，即细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal regulated protein kinases，ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、p38通路及ERK5通路。它们参与细胞生长、发育、分裂、细胞间的功能同步以及对环境的适应等多种生理过程，并在应激、炎症、细胞恶性转化等病理过程中起重要作用。
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p38通路是最近发现的一条MAPK信号传导通路。这条通路参与炎症、应激等病理生理反应。p38蛋白激酶包括p38α、p38β、 p38γ和 p38δ4种亚型。研究表明，4种亚型之间有一定相似之处，如4种亚型氨基酸序列非常接近，与p38在蛋白质水平分别有74%、60%和60%的相同，和p38的Loop-12环状结构长度相同，都包含Thr-Gly-Tyr双磷酸化基。进一步实验表明，4个同源体在组织分布、上游激酶调节、下游底物作用、对细胞外刺激的反应以及p38特异性抑制剂(FHPI)的抑制作用方面都各有不同的特点[7]。
这些不同亚型之间具有不同的组织和细胞特异性，可能在细胞信号传导的特异性方面起到一定的作用。另外，在同一细胞内可能存在着不同的p38亚型，这些亚型在细胞内定位的差异可能是这条信号通路的特异性传导在不同细胞介导细胞特异性反应的机制之一。
本研究发现，p38α、p38β在未受刺激的静息单核细胞，其荧光强度弥散性分布于胞浆中，胞核区域也有一定的荧光强度分布，提示p38α和p38β蛋白激酶亚型在未激活前散在、弥漫性地分布于细胞中。单核细胞受到LPS刺激后，细胞核p38α、p38β标记荧光强度明显增强，细胞浆荧光强度降低，提示单核细胞在LPS作用下，其p38α、p38β由胞浆移位到胞核。而EGF刺激的单核细胞，情况与静息单核细胞相似，未见明显的p38α、p38β移核现象，说明LPS引起的p38 MAPK入核有一定的特异性。这与以前在其它细胞所观察到的LPS能激活p38，而EGF无明显激活作用相一致。p38γ在静息的单核细胞中均呈散在、弥漫性地分布细胞浆中；在LPS刺激后，RAW细胞荧光分布无明显变化，提示在RAW细胞LPS刺激刺激后p38g 无移位现象。p38δ在静息细胞主要弥散性地分布于胞浆中，LPS刺激后细胞核区周围荧光强度增高，提示p38δ受刺激后移位于核膜区域。有报道认为其它MAPK如 ERK1、JNK1在受到刺激后进入细胞核，然而，至今尚未见有关不同MAPK亚型对同一外源刺激反应带来不同移位效应的报道。目前已阐明受p38通路调控的细胞内靶蛋白主要包括两类：一是位于细胞核区的转录因子，如ATF2、MEF2C、CHOP10等；二是胞浆的蛋白激酶，如MAPKAPK2/3、PRAK等。p38α和p38β在受到LPS刺激后进入细胞核，可能作用于相应的转录因子调控多种炎症反应相关基因的表达。现普遍认为激活的MAPK进入细胞核，激活有关的转录因子，使相关基因表达是MAPK介导细胞反应的重要机制之一。在细胞受到LPS刺激后，其他两种p38亚型与p38α和p38β表现不同。p38γ位于胞浆中，在LPS刺激后无移位现象，这提示p38γ有可能作用于细胞浆中的其他酶类，如MAPKAPK2/3、PRAK等。前期的研究表明，p38可通过磷酸化激活MAPKAPK2/3和PRAK，这些激酶可进一步磷酸化低分子量热休克蛋白HSP27，通过改变肌动蛋白的构成形式而影响细胞骨架结构。目前尚不清楚这些细胞内激酶与不同p38亚型之间的对应关系，而这种关系的建立将为阐明p38通路的生物学功能奠定物质基础。本实验证实4种p38亚型在LPS刺激后移位表现不同，可能与它们在组织和细胞中分布的特异性及作用途径有关，但其具体的分子作用机制尚有待进一步研究。
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国家杰出青年科学基金资助(39925014)、国家自然科学基金重点(39830400)、面上项目(39800074，39870332)、军队杰出人才基金(98J003)和广东省自然科学基金(980207)资助
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