FL的生物学作用和临床应用前景
作者：何广胜
单位：何广胜 (中国医学科学院 中国协和医科大学 血液学研究所 血液病医院 天津，300020)
关键词：
临床血液学杂志000320 邵宗鸿 审校
FLT3配体(FLT3 ligand，FL)是一种跨膜蛋白，有膜结合型和可溶型两种。虽然在机体中广泛分布，但其受体FLT3却主要表达于早期的造血干细胞。FL通过与在细胞表面的有酪氨酸激酶活性的受体结合而发挥其造血调节作用。本文对FL的生物学作用及前景作一综述。
l FL的生物学作用
1.1 对造血干、祖细胞的作用
FL主要作用于人CD34+/CD38-、若丹明123dull及对4-氢过氧环磷酰胺有抵抗的造血祖细胞〔1〕。FL单用于造血干、祖细胞仅有弱的促增殖作用，若与其它细胞因子联用可以促进粒巨噬细胞集落形成单位(colony-forming unit-granulo cytemac-
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rophage,CFU-GM)、早期B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)和NK细胞的生长，而对红细胞系及巨核细胞系几乎没有作用〔2〕。 FL还可以动员造血干、祖细胞。单用FL，小鼠的外周血中CFU-GM、粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞集落形成单位明显增高〔3〕。 灵长类中使用FL也取得类似结果〔4〕。移植由FL动员的干细胞至致死性照射后的小鼠中，受体小鼠获得了多种细胞系的长期再生能力〔3〕。FL联合粒细胞集落刺激因子(granulocytey colony-stimulating factor，G-CSF)或粒巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)，与单用FL相比，不仅可以使外周血中集落形成细胞增加，而且在动员动力学上有加速作用〔3，4〕。研究表明，FL促使造血细胞扩增可能是由于FL增加了进入细胞周期的原始造血祖细胞(primitive HPC)〔1〕。
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1.2 对B淋巴细胞的作用
在FL缺陷(FL-/-)的小鼠中发现其骨髓中未成熟B淋巴细胞的数目较正常小鼠(FL+/+)减少了5倍〔5〕，说明FL在早期B淋巴细胞发育中有着重要作用。研究进一步发现〔6〕：单用FL或干细胞因子(stem cell factor，SCF)均可以促进小鼠骨髓中Lin-Sca-1+祖细胞生长，其同时具有向髓细胞系和淋巴细胞系分化的潜能。而FL和白细胞介素-7(interlukine-7,IL-7)联用促使B祖淋巴细胞增殖。这些细胞不表达胞浆u链和膜表面IgM，但CD24、CD43表达阳性，说明产生的细胞位于晚B祖细胞期。SCF与IL-7联用刺激产生的细胞90%为髓系细胞。因此，FL可能促使从干、祖细胞阶段而不是从定向的B组淋巴细胞阶段产生B淋巴细胞〔6〕。FL与IL-7或再加用IL-3可使人胎骨髓中B祖淋巴细胞(CD34+，CD19+)于体外在无基质细胞情况下长期增殖和分化〔9〕。
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1.3 对NK细胞的作用
FL与IL-15联用可增强自身CD34+细胞扩增产出CD3-、CD56+(NK)细胞〔8〕。而FL缺陷小鼠的脾脏细胞缺乏NK细胞活性，即使经poly-IC或IL-15刺激后，仍不能溶解YAC细胞〔5〕。这说明FL对NK细胞的产生有重要调节作用。
1.4 对DC的作用
小鼠体内试验表明，FL扩增髓细胞系和淋巴细胞系来源的DC〔9〕。FL可以使骨髓、脾、胸腺、胃肠道淋巴组织及其它组织中功能性的DC数量明显上升〔9〕。这说明FL是使有功能的DC数目绝对地上升，而不是使之发生再分布。FL可能使FL敏感的原始细胞易于发生向祖细胞的最终分化，后者可快速产生成熟DC〔9〕。而SCF、GM-CSF或IL-4并不能扩增小鼠脾脏中的DC〔9〕。FL与其他细胞因子联用促使GM-CSF缺陷小鼠未定向胸腺祖细胞形成DC，无需GM-CSF支持，且抗GM-CSF抗体也不能阻止DC产生〔10〕。而FL缺陷小鼠的DC数目显著减少，从另一方面说明了FL在DC生成中起到的关键作用〔5〕。
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1.5 对恶性血液病细胞的作用
多数急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemin,AML)和部分急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞FLT3表达阳性，但FLT3+细胞并不一定对FL起增殖反应，而这些细胞对其他细胞因子却仍有反应性，说明其并非缺乏一般的增殖能力〔2〕。这一现象原因不明。近来发现17% AML和5%的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中发现有FLT3受体基因近膜区结构域编码序列的内部串联复制(internal tandem duplication,ITD)突变，由MDS转化的AML中15%有此改变，但ALL患者无此类改变〔11，12〕。在以急性早幼粒细胞性白血病患者为对象的研究中，发现FLT/ITD与白血病细胞增高密切相关(P<0.001)〔13〕。FLT/ITD主要出现在MDS的白血病转化和AML的复发过程中，提示FLT/ITD可能促进原始细胞增殖，参与白血病的进展而不是与白血病发生有关〔12，14〕。研究认为FLT/ITD可使FLT近膜区结构域延长，诱发FLT3胞外区构象改变，在无FL情况下发生FLT二聚化并自身磷酸化而获得活性〔14〕。有关FLT/ITD的研究提供了关于白血病的基因不稳定性和异常信号传导的新资料，为设计针对FL信号途径的抗肿瘤新疗法提供了可能。
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2 FL临床应用前景
2.1 造血干、祖细胞动员和体内扩增
FL不仅可使外周血中克隆形成细胞数目明显增加，而且接受FL动员的干细胞的受体小鼠保持有长期的多种细胞系再生能力〔3〕。FL对造血干、祖细胞动员同时，还促使其扩增〔2〕。在干细胞移植中应用FL能减少对大规模骨髓收获或白细胞分离的需要，并使机体耐受多次大剂量化疗。自体来源的造血干、祖细胞移植物中可能含有肿瘤细胞而致复发，而合适的选择性干、祖细胞动员扩增剂可能减少或排除这些肿瘤细胞。FL不仅对FLT3-的恶性血液肿瘤细胞无作用，而且对部分FLT3+的恶性血液肿瘤(如T细胞性ALL)细胞，亦无促增殖作用〔2〕。另外，FL与其它细胞因子有良好的协同作用，可以提高动员速率和集落形成细胞的产量〔3，4〕。近来发现，FL联合血小板生成素支持无基质细胞培养的脐血CD34+细胞可达6个月以上，CD34+CD38-细胞扩增了3000万倍；培养20周时，CFU-Blast和长期培养起始细胞分别扩增30万倍和8.3万倍〔15〕。
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2.2 抗肿瘤作用
体内系统地使用FL可治疗纤维肉瘤〔16〕、乳腺癌〔17〕、白血病〔18〕，用逆转录病毒载体转导乳腺癌细胞表达FL的cDNA也可治疗之〔17〕。体外试验发现FL对肿瘤细胞生长无作用，故FL抗肿瘤活性并非来自其对肿瘤细胞的直接作用〔17〕。给排斥了表达FL的肿瘤细胞的小鼠再次注射来自其父代的肿瘤细胞，大部分小鼠对其仍有抵抗性〔17〕。非选择地移植FL治疗后的小鼠含CD8+或抗-Thy1+的脾细胞，未致敏小鼠获得了抗肿瘤免疫〔16〕。这说明T淋巴细胞在此起抗肿瘤的效应。FL刺激DC产生，DC呈递肿瘤抗原给初始T淋巴细胞，后者接着分化为效应细胞并去除肿瘤。但DC不一定是唯一参与FL抗肿瘤的细胞。有证据表明NK细胞也参与这一作用。FL可抑制严重联合免疫缺陷(Sever combined immunodeficient,SCID)小鼠的肿瘤细胞于静止状态，虽然不能将其排斥。而SCID小鼠是缺乏T淋巴细胞的。在同时缺乏NK细胞和T淋巴细胞的NOD/SCID小鼠中，FL对肿瘤细胞生长毫无作用〔19〕。因此FL可能是通过DC和NK细胞而发挥抗肿瘤作用。GM-CSF仅能扩增髓细胞来源的DC，且数量有限，因此在过继DC细胞免疫治疗中，使用FL优于GM-CSF〔9〕。当然，二者联用效果更佳〔2〕。FL通过增加DC数量还可起到瘤苗免疫佐剂作用〔19〕。
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2.3 基因治疗
逆转录病毒载体转导造血干、祖细胞，需要使基本上处于静止状态的干、祖细胞被激活进行分裂，以获得较高的整合率，同时还要使被转导细胞在受体内保持长期的植入活性。体外培养载体和靶细胞时以人基质细胞支持可达到这一目的，但从临床使用角度来看，获得大量基质细胞尚有困难〔20〕。FL可以部分代替基质细胞发挥这一作用。FL可从以下方面起作用〔2，19，20〕：①FL可能就是基质细胞提供的干、祖细胞活性保持因子之一。②在干、祖细胞阶段，FLT3+细胞处于G0期的数量较FLT3-的少，而同时FL具有促使干、祖细胞进入细胞周期的活性。故FL可提高整合率。③FL可维持被转导细胞克隆形成潜能。④FL可能上调靶细胞上逆转录病毒受体。虽然FL不能完全取代基质细胞增强基因转移的能力，但以可增强基因转移的纤维粘连素与可支持干、祖细胞生存的FL联用，或许能取代基质细胞的作用〔20〕。
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2.4 再生障碍性贫血的治疗
经酶联免疫吸附试验检测，正常人血清FL<100 ng/L。FL主要在干细胞衰竭的患者中升高，如Fanconi贫血、获得性再生障碍性贫血患者的FL可达10 μg/L〔21〕。对此最简单的解释是干、祖细胞增生障碍，缺乏对FL的负性调节〔2〕。FL浓度增高也许是一种造血代偿性反应，用以保护或促使残留干、祖细胞增殖〔21，22〕。当Fanconi贫血和获得性再生障碍性贫血经过成功的脐血或骨髓移植、免疫抑制治疗后，其血清FL又回落到正常健康人水平，复发时FL则再次升高〔21，23〕。FL与骨髓多系造血干、祖细胞衰竭程度呈负相关性，所以血清FL水平也许可以作为骨髓中干细胞活性和含量的一个替代性标志来指导治疗〔2〕。体外试验发现〔22〕，单用FL或与其它细胞因子IL-3、IL-11、G-CSF联用可维持再生障碍性贫血造血祖细胞的克隆形成能力。但换以SCF，其作用仅能维持1周。以药理剂量的FL与免疫抑制剂治疗序贯使用，在骨髓有少量残存功能时，FL则可能会表现出对造血祖细胞的重要支持作用。
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3 目前应用研究
给健康志愿者皮下注射FL，发现耐受良好，不良反应仅有注射部位瘙痒、硬结和淋巴结肿大〔24〕。FL可支持动员CD34+细胞、CFU-GM、红系爆式集落形成单位于外周血中至FL停用后1周，并使循环中DC增加30倍〔24〕。停用FL，上述不良反应和实验室改变消失，未发现有后遗症〔24〕。目前FL联用GM-CSF、G-CSF动员造血祖细胞的Ⅰ、Ⅱ期临床试验和FL对非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌的免疫治疗的Ⅱ期临床试验已经开展〔19，24〕。
邵宗鸿 中国医学科学院 中国协和医科大学 血液学研究所 血液病医院 天津，300020)
参考文献
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收稿：1999-04-22, 百拇医药
单位：何广胜 (中国医学科学院 中国协和医科大学 血液学研究所 血液病医院 天津，300020)
关键词：
临床血液学杂志000320 邵宗鸿 审校
FLT3配体(FLT3 ligand，FL)是一种跨膜蛋白，有膜结合型和可溶型两种。虽然在机体中广泛分布，但其受体FLT3却主要表达于早期的造血干细胞。FL通过与在细胞表面的有酪氨酸激酶活性的受体结合而发挥其造血调节作用。本文对FL的生物学作用及前景作一综述。
l FL的生物学作用
1.1 对造血干、祖细胞的作用
FL主要作用于人CD34+/CD38-、若丹明123dull及对4-氢过氧环磷酰胺有抵抗的造血祖细胞〔1〕。FL单用于造血干、祖细胞仅有弱的促增殖作用，若与其它细胞因子联用可以促进粒巨噬细胞集落形成单位(colony-forming unit-granulo cytemac-
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rophage,CFU-GM)、早期B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)和NK细胞的生长，而对红细胞系及巨核细胞系几乎没有作用〔2〕。 FL还可以动员造血干、祖细胞。单用FL，小鼠的外周血中CFU-GM、粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞集落形成单位明显增高〔3〕。 灵长类中使用FL也取得类似结果〔4〕。移植由FL动员的干细胞至致死性照射后的小鼠中，受体小鼠获得了多种细胞系的长期再生能力〔3〕。FL联合粒细胞集落刺激因子(granulocytey colony-stimulating factor，G-CSF)或粒巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)，与单用FL相比，不仅可以使外周血中集落形成细胞增加，而且在动员动力学上有加速作用〔3，4〕。研究表明，FL促使造血细胞扩增可能是由于FL增加了进入细胞周期的原始造血祖细胞(primitive HPC)〔1〕。
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1.2 对B淋巴细胞的作用
在FL缺陷(FL-/-)的小鼠中发现其骨髓中未成熟B淋巴细胞的数目较正常小鼠(FL+/+)减少了5倍〔5〕，说明FL在早期B淋巴细胞发育中有着重要作用。研究进一步发现〔6〕：单用FL或干细胞因子(stem cell factor，SCF)均可以促进小鼠骨髓中Lin-Sca-1+祖细胞生长，其同时具有向髓细胞系和淋巴细胞系分化的潜能。而FL和白细胞介素-7(interlukine-7,IL-7)联用促使B祖淋巴细胞增殖。这些细胞不表达胞浆u链和膜表面IgM，但CD24、CD43表达阳性，说明产生的细胞位于晚B祖细胞期。SCF与IL-7联用刺激产生的细胞90%为髓系细胞。因此，FL可能促使从干、祖细胞阶段而不是从定向的B组淋巴细胞阶段产生B淋巴细胞〔6〕。FL与IL-7或再加用IL-3可使人胎骨髓中B祖淋巴细胞(CD34+，CD19+)于体外在无基质细胞情况下长期增殖和分化〔9〕。
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1.3 对NK细胞的作用
FL与IL-15联用可增强自身CD34+细胞扩增产出CD3-、CD56+(NK)细胞〔8〕。而FL缺陷小鼠的脾脏细胞缺乏NK细胞活性，即使经poly-IC或IL-15刺激后，仍不能溶解YAC细胞〔5〕。这说明FL对NK细胞的产生有重要调节作用。
1.4 对DC的作用
小鼠体内试验表明，FL扩增髓细胞系和淋巴细胞系来源的DC〔9〕。FL可以使骨髓、脾、胸腺、胃肠道淋巴组织及其它组织中功能性的DC数量明显上升〔9〕。这说明FL是使有功能的DC数目绝对地上升，而不是使之发生再分布。FL可能使FL敏感的原始细胞易于发生向祖细胞的最终分化，后者可快速产生成熟DC〔9〕。而SCF、GM-CSF或IL-4并不能扩增小鼠脾脏中的DC〔9〕。FL与其他细胞因子联用促使GM-CSF缺陷小鼠未定向胸腺祖细胞形成DC，无需GM-CSF支持，且抗GM-CSF抗体也不能阻止DC产生〔10〕。而FL缺陷小鼠的DC数目显著减少，从另一方面说明了FL在DC生成中起到的关键作用〔5〕。
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1.5 对恶性血液病细胞的作用
多数急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemin,AML)和部分急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞FLT3表达阳性，但FLT3+细胞并不一定对FL起增殖反应，而这些细胞对其他细胞因子却仍有反应性，说明其并非缺乏一般的增殖能力〔2〕。这一现象原因不明。近来发现17% AML和5%的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中发现有FLT3受体基因近膜区结构域编码序列的内部串联复制(internal tandem duplication,ITD)突变，由MDS转化的AML中15%有此改变，但ALL患者无此类改变〔11，12〕。在以急性早幼粒细胞性白血病患者为对象的研究中，发现FLT/ITD与白血病细胞增高密切相关(P<0.001)〔13〕。FLT/ITD主要出现在MDS的白血病转化和AML的复发过程中，提示FLT/ITD可能促进原始细胞增殖，参与白血病的进展而不是与白血病发生有关〔12，14〕。研究认为FLT/ITD可使FLT近膜区结构域延长，诱发FLT3胞外区构象改变，在无FL情况下发生FLT二聚化并自身磷酸化而获得活性〔14〕。有关FLT/ITD的研究提供了关于白血病的基因不稳定性和异常信号传导的新资料，为设计针对FL信号途径的抗肿瘤新疗法提供了可能。
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2 FL临床应用前景
2.1 造血干、祖细胞动员和体内扩增
FL不仅可使外周血中克隆形成细胞数目明显增加，而且接受FL动员的干细胞的受体小鼠保持有长期的多种细胞系再生能力〔3〕。FL对造血干、祖细胞动员同时，还促使其扩增〔2〕。在干细胞移植中应用FL能减少对大规模骨髓收获或白细胞分离的需要，并使机体耐受多次大剂量化疗。自体来源的造血干、祖细胞移植物中可能含有肿瘤细胞而致复发，而合适的选择性干、祖细胞动员扩增剂可能减少或排除这些肿瘤细胞。FL不仅对FLT3-的恶性血液肿瘤细胞无作用，而且对部分FLT3+的恶性血液肿瘤(如T细胞性ALL)细胞，亦无促增殖作用〔2〕。另外，FL与其它细胞因子有良好的协同作用，可以提高动员速率和集落形成细胞的产量〔3，4〕。近来发现，FL联合血小板生成素支持无基质细胞培养的脐血CD34+细胞可达6个月以上，CD34+CD38-细胞扩增了3000万倍；培养20周时，CFU-Blast和长期培养起始细胞分别扩增30万倍和8.3万倍〔15〕。
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2.2 抗肿瘤作用
体内系统地使用FL可治疗纤维肉瘤〔16〕、乳腺癌〔17〕、白血病〔18〕，用逆转录病毒载体转导乳腺癌细胞表达FL的cDNA也可治疗之〔17〕。体外试验发现FL对肿瘤细胞生长无作用，故FL抗肿瘤活性并非来自其对肿瘤细胞的直接作用〔17〕。给排斥了表达FL的肿瘤细胞的小鼠再次注射来自其父代的肿瘤细胞，大部分小鼠对其仍有抵抗性〔17〕。非选择地移植FL治疗后的小鼠含CD8+或抗-Thy1+的脾细胞，未致敏小鼠获得了抗肿瘤免疫〔16〕。这说明T淋巴细胞在此起抗肿瘤的效应。FL刺激DC产生，DC呈递肿瘤抗原给初始T淋巴细胞，后者接着分化为效应细胞并去除肿瘤。但DC不一定是唯一参与FL抗肿瘤的细胞。有证据表明NK细胞也参与这一作用。FL可抑制严重联合免疫缺陷(Sever combined immunodeficient,SCID)小鼠的肿瘤细胞于静止状态，虽然不能将其排斥。而SCID小鼠是缺乏T淋巴细胞的。在同时缺乏NK细胞和T淋巴细胞的NOD/SCID小鼠中，FL对肿瘤细胞生长毫无作用〔19〕。因此FL可能是通过DC和NK细胞而发挥抗肿瘤作用。GM-CSF仅能扩增髓细胞来源的DC，且数量有限，因此在过继DC细胞免疫治疗中，使用FL优于GM-CSF〔9〕。当然，二者联用效果更佳〔2〕。FL通过增加DC数量还可起到瘤苗免疫佐剂作用〔19〕。
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2.3 基因治疗
逆转录病毒载体转导造血干、祖细胞，需要使基本上处于静止状态的干、祖细胞被激活进行分裂，以获得较高的整合率，同时还要使被转导细胞在受体内保持长期的植入活性。体外培养载体和靶细胞时以人基质细胞支持可达到这一目的，但从临床使用角度来看，获得大量基质细胞尚有困难〔20〕。FL可以部分代替基质细胞发挥这一作用。FL可从以下方面起作用〔2，19，20〕：①FL可能就是基质细胞提供的干、祖细胞活性保持因子之一。②在干、祖细胞阶段，FLT3+细胞处于G0期的数量较FLT3-的少，而同时FL具有促使干、祖细胞进入细胞周期的活性。故FL可提高整合率。③FL可维持被转导细胞克隆形成潜能。④FL可能上调靶细胞上逆转录病毒受体。虽然FL不能完全取代基质细胞增强基因转移的能力，但以可增强基因转移的纤维粘连素与可支持干、祖细胞生存的FL联用，或许能取代基质细胞的作用〔20〕。
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2.4 再生障碍性贫血的治疗
经酶联免疫吸附试验检测，正常人血清FL<100 ng/L。FL主要在干细胞衰竭的患者中升高，如Fanconi贫血、获得性再生障碍性贫血患者的FL可达10 μg/L〔21〕。对此最简单的解释是干、祖细胞增生障碍，缺乏对FL的负性调节〔2〕。FL浓度增高也许是一种造血代偿性反应，用以保护或促使残留干、祖细胞增殖〔21，22〕。当Fanconi贫血和获得性再生障碍性贫血经过成功的脐血或骨髓移植、免疫抑制治疗后，其血清FL又回落到正常健康人水平，复发时FL则再次升高〔21，23〕。FL与骨髓多系造血干、祖细胞衰竭程度呈负相关性，所以血清FL水平也许可以作为骨髓中干细胞活性和含量的一个替代性标志来指导治疗〔2〕。体外试验发现〔22〕，单用FL或与其它细胞因子IL-3、IL-11、G-CSF联用可维持再生障碍性贫血造血祖细胞的克隆形成能力。但换以SCF，其作用仅能维持1周。以药理剂量的FL与免疫抑制剂治疗序贯使用，在骨髓有少量残存功能时，FL则可能会表现出对造血祖细胞的重要支持作用。
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3 目前应用研究
给健康志愿者皮下注射FL，发现耐受良好，不良反应仅有注射部位瘙痒、硬结和淋巴结肿大〔24〕。FL可支持动员CD34+细胞、CFU-GM、红系爆式集落形成单位于外周血中至FL停用后1周，并使循环中DC增加30倍〔24〕。停用FL，上述不良反应和实验室改变消失，未发现有后遗症〔24〕。目前FL联用GM-CSF、G-CSF动员造血祖细胞的Ⅰ、Ⅱ期临床试验和FL对非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌的免疫治疗的Ⅱ期临床试验已经开展〔19，24〕。
邵宗鸿 中国医学科学院 中国协和医科大学 血液学研究所 血液病医院 天津，300020)
参考文献
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收稿：1999-04-22, 百拇医药