急性髓细胞白血病端粒酶活性及临床意义
作者：赵小英 张行 黄连生 吴东 卢兴国 王世泂
单位：赵小英 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；张行 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；黄连生 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；吴东 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；卢兴国 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；王世泂 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)
关键词：白血病；粒细胞；急性；端粒酶
临床血液学杂志000303 摘要 目的：探讨端粒酶活性在急性髓细胞白血病(AML)发生中的作用。方法：采用端粒重复序列扩增文件酶标法(TRAP-ELISA)，对32例AML和非恶性血液系统疾病骨髓细胞端粒酶活性检测。结果：端粒酶活性在初发AML患者高于非恶性血液系统疾病患者(P<0.01)，AML初发期患者高于完全缓解期患者(P<0.05)，端粒酶活性与体内白血病细胞数之间无显著相关性。结论：端粒酶活性的观察有助于疗效的判断。
, http://www.100md.com
Telomerase activity in acute myeloid leukemia and
its clinical significance
ZHAO Xiao-ying
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
ZHANG Xing
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
, 百拇医药
HUANG Lian-sheng
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
WU Dong
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
LU Xing-guo
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
, 百拇医药
WANG Shi-jiong
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
Abstract Objective:To evaluate the role of telomerase activity in development of acute myeloid leukemia.Methods:The telomerase activity was determined in bone marrow cells from 32 patients of acute myeloid leukemia and non-malignant hematogic disease by TRAP-ELISA.Results:Telomerase activity is higher in AML than in non-malignant hematologic disease (P<0.01) and higher in untreated patients than in complete remissive patient (P<0.05).There is no significant correlation between telomerase activity and total leukemia cells in patient.Conclusion:Detection of telomerase activity might help to predict the thrapeutic effect of AML patients.
, 百拇医药
Key words Leukemia,myelocytic,acute Telomerase
端粒是真核细胞线状DNA末端的一个由TTAGGG重复序列所组成，在保护DNA免受降解有害的重组事件中具重要作用，细胞的每一个分裂周期都导致端粒序列的进行性缩短〔1，2〕。端粒酶是一种核酸蛋白酶，它可以合成端粒的重复序列，并使端粒维持一定的长度，在高等生物细胞中除了精原细胞和少许造血细胞存在端粒酶活性外，其余体细胞的端粒酶均处于失活状态〔3，4〕。新近研究表明，端粒酶活化在细胞癌变中扮演重要角色。本文应用端粒酶重复放大程序TRAP(Telomerase Repeat Amplication Protocol)PCR-ELISA法，对急性髓细胞白血病(AML)端粒酶活性进行检测以探讨其活化的临床意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源
, 百拇医药
共收取32例骨髓液标本，其中白血病13例(AML初发病例7例，AML完全缓解病例6例)，非恶性血液系统疾病19例(缺铁性贫血7例，粒细胞缺乏症1例，原发性血小板减少性紫癜2例，巨幼红细胞性贫血1例，再生障碍性贫血8例)。AML1初发病例WBC 0.8×109～20.2×109/L，血小板计数27×109～196×109/L，血红蛋白42～106 g/L，外周血白血病细胞数(白细胞总数×幼稚细胞%)3.20×109～175.74×109/L。
1.2 试剂
Telomerase PCR ELISA 检测试剂盒(Boehri-nger Manheim CO.Cat NO 1854666)。
1.3 标本制备
, 百拇医药
将骨髓穿刺针中的剩余骨髓液洗脱于500 μl无菌生理盐水中，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1 ml 预冷的去离子水，混匀，充分破坏红细胞，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1 ml无菌生理盐水恢复等渗，再离心，条件同上。弃上清液后加入端粒酶裂解液10～20 μl，充分混匀，置4 ℃冰箱1～2 h后离心(12 000 r/min)15 min，吸取上清液，保存于-30 ℃冰箱，并测蛋白含量。
1.4 端粒酶活性检测
采用端粒酶PCR-ELISA药盒。方法如下：取骨髓细胞提取液1～5 μl(蛋白含量50 ng)加入25 μl TRAP PCR 扩增液，用无菌DEPC水补足至体积50 μl混匀；均匀后将反应管置于PCR扩增仪(perkin Eliner 480型)上进行扩增，循环参数为25 ℃30 min，90 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，经历引物延伸、扩增及变性、退火和延长延伸，共循环30个周期，最后72 ℃继续延伸10 min；取出上述PCR产物5 μl加变性液20 μl，混匀并置室温10 min；加入杂交液225 μl，混匀后取出100 μl包被于抗地高辛的酶标板中，室温作用2 h；加入过氧化物酶并与TMB底物显色作用30 min后终止反应；用酶标仪测定在波长450 nm的吸光度(A)值。
, 百拇医药
1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
将PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并用银染色法分析PCR产物。端粒酶活性阳性标本呈现6个核苷酸长的重复片断产物，显影成多条带的梯形图。
每次检测以端粒酶阳性细胞K526细胞为阳性对照。阴性对照反应液中不加骨髓细胞悬液。
2 结果
阳性对照K526细胞显示有较高的端粒酶活性，平均A值为0.982，且PCR产物电泳可见银染结果阳性。阴性对照未显示端粒酶活性。
7例初发AML中均可测得端粒酶活性，A值为0.038～0.849，均值0.318。其中5例电泳银染结果阳性。6例AML完全缓解期患者端粒酶活性(A值)为0.00～0.122，均值0.035，其中2例电泳银染结果阳性。非恶性血液系统疾病也均不同程度地测到端粒酶活性，A值为0.001～0.471，均值0.071，其中6例显示电泳银染结果阳性。
, 百拇医药
各组间端粒酶活性A值经t检验，初发AML与完全缓解期AML两组间t值为2.30，P<0.05差异有显著意义，初发AML与非恶性血液系统疾病两组间t值为3.061，P<0.01，差异有极显著意义。完全缓解期组与非恶性血液系统疾病组间 t值为0.635，P>0.05，无显著性差异。
初发白血病患者端粒酶表达水平与外周血白细胞总数和白血病细胞数的相关系数分别为0.2722和0.1589，均为P>0.05，示无显著相关性。
3 讨论
本实验结果显示在32例急性白血病和非恶性血液系统疾病中，除1例未显示端粒酶活性外，余病例均有不同程度的端粒酶活性表达。Counter等〔4〕研究也显示在正常人外周血、脐血和骨髓中也有低水平的端粒酶活性，并认为血液细胞是迄今为止成人体细胞中唯一表达端粒酶活性的细胞，这些阳性细胞的生物学意义和特征尚未明了，在细胞培养中发现最原始的骨髓细胞中存在有端粒DNA的丢失，提示端粒酶阳性细胞可能属于具有分化潜能的造血细胞〔3，5〕。
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端粒酶的活性可能与肿瘤的某些生物学行为有关，由于端粒酶的活化使端粒长度维持一种动态平衡，细胞得以无限制增殖下去，因此导致了肿瘤的发生。在急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病和骨髓异常增生综合征后期的病程中均存在有端粒酶活性的激活而引起端粒酶活性的升高〔4〕。我们的结果也提示在AML患者中该酶活性明显高于非恶性血液系统疾病患者，虽未发现AML患者端粒酶活性与其体内的白细胞总数和白血病细胞数之间有显著相关性，但在完全缓解患者中端粒酶活性明显低于初发患者且与非恶性血液病患者间无显著性差异，提示检测端粒酶活性在观察疾病疗效中具有一定的价值。
在我们的研究中也发现1例造血功能极度低下的患者存在有端粒酶活性的高表达，A值达0.471，目前尚未找到合理的解释。
参考文献
1，Blackburm E H.Structure and function of telomeres. Nature ,1991,3,50:569～573
, http://www.100md.com
2，Harley C B,Vaziri H, Counter C M,et al.The telomere hypothesis of cellular ageing.EXP Gerontol,1992,27:375～382
3，Chadenean C,Hayk, Hirte H W,et al.Telomerase activity associated with acquisition of malignancy in human colorectal cancer.Cancer Res,1995,55:2533～2536
4，Counter C M,Cupta J.Harley C B,et al.Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies.Blood,1995,85:2315～2320
5，Vaziri H, Schachter F, Uchida I,et al.Loss of teiomeric DNA during aging of normal and trisomy 21 human lymphocytes. Am J Hum Genet,1993,52:661～667
收稿：1999-06-18
修回：1999-12-16, 百拇医药
单位：赵小英 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；张行 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；黄连生 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；吴东 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；卢兴国 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)；王世泂 (浙江大学医学院附属第二医院血液科 杭州，310009)
关键词：白血病；粒细胞；急性；端粒酶
临床血液学杂志000303 摘要 目的：探讨端粒酶活性在急性髓细胞白血病(AML)发生中的作用。方法：采用端粒重复序列扩增文件酶标法(TRAP-ELISA)，对32例AML和非恶性血液系统疾病骨髓细胞端粒酶活性检测。结果：端粒酶活性在初发AML患者高于非恶性血液系统疾病患者(P<0.01)，AML初发期患者高于完全缓解期患者(P<0.05)，端粒酶活性与体内白血病细胞数之间无显著相关性。结论：端粒酶活性的观察有助于疗效的判断。
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Telomerase activity in acute myeloid leukemia and
its clinical significance
ZHAO Xiao-ying
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
ZHANG Xing
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
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HUANG Lian-sheng
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
WU Dong
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
LU Xing-guo
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
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WANG Shi-jiong
(Department of Hematology,2 nd Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009)
Abstract Objective:To evaluate the role of telomerase activity in development of acute myeloid leukemia.Methods:The telomerase activity was determined in bone marrow cells from 32 patients of acute myeloid leukemia and non-malignant hematogic disease by TRAP-ELISA.Results:Telomerase activity is higher in AML than in non-malignant hematologic disease (P<0.01) and higher in untreated patients than in complete remissive patient (P<0.05).There is no significant correlation between telomerase activity and total leukemia cells in patient.Conclusion:Detection of telomerase activity might help to predict the thrapeutic effect of AML patients.
, 百拇医药
Key words Leukemia,myelocytic,acute Telomerase
端粒是真核细胞线状DNA末端的一个由TTAGGG重复序列所组成，在保护DNA免受降解有害的重组事件中具重要作用，细胞的每一个分裂周期都导致端粒序列的进行性缩短〔1，2〕。端粒酶是一种核酸蛋白酶，它可以合成端粒的重复序列，并使端粒维持一定的长度，在高等生物细胞中除了精原细胞和少许造血细胞存在端粒酶活性外，其余体细胞的端粒酶均处于失活状态〔3，4〕。新近研究表明，端粒酶活化在细胞癌变中扮演重要角色。本文应用端粒酶重复放大程序TRAP(Telomerase Repeat Amplication Protocol)PCR-ELISA法，对急性髓细胞白血病(AML)端粒酶活性进行检测以探讨其活化的临床意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源
, 百拇医药
共收取32例骨髓液标本，其中白血病13例(AML初发病例7例，AML完全缓解病例6例)，非恶性血液系统疾病19例(缺铁性贫血7例，粒细胞缺乏症1例，原发性血小板减少性紫癜2例，巨幼红细胞性贫血1例，再生障碍性贫血8例)。AML1初发病例WBC 0.8×109～20.2×109/L，血小板计数27×109～196×109/L，血红蛋白42～106 g/L，外周血白血病细胞数(白细胞总数×幼稚细胞%)3.20×109～175.74×109/L。
1.2 试剂
Telomerase PCR ELISA 检测试剂盒(Boehri-nger Manheim CO.Cat NO 1854666)。
1.3 标本制备
, 百拇医药
将骨髓穿刺针中的剩余骨髓液洗脱于500 μl无菌生理盐水中，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1 ml 预冷的去离子水，混匀，充分破坏红细胞，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1 ml无菌生理盐水恢复等渗，再离心，条件同上。弃上清液后加入端粒酶裂解液10～20 μl，充分混匀，置4 ℃冰箱1～2 h后离心(12 000 r/min)15 min，吸取上清液，保存于-30 ℃冰箱，并测蛋白含量。
1.4 端粒酶活性检测
采用端粒酶PCR-ELISA药盒。方法如下：取骨髓细胞提取液1～5 μl(蛋白含量50 ng)加入25 μl TRAP PCR 扩增液，用无菌DEPC水补足至体积50 μl混匀；均匀后将反应管置于PCR扩增仪(perkin Eliner 480型)上进行扩增，循环参数为25 ℃30 min，90 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，经历引物延伸、扩增及变性、退火和延长延伸，共循环30个周期，最后72 ℃继续延伸10 min；取出上述PCR产物5 μl加变性液20 μl，混匀并置室温10 min；加入杂交液225 μl，混匀后取出100 μl包被于抗地高辛的酶标板中，室温作用2 h；加入过氧化物酶并与TMB底物显色作用30 min后终止反应；用酶标仪测定在波长450 nm的吸光度(A)值。
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1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
将PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并用银染色法分析PCR产物。端粒酶活性阳性标本呈现6个核苷酸长的重复片断产物，显影成多条带的梯形图。
每次检测以端粒酶阳性细胞K526细胞为阳性对照。阴性对照反应液中不加骨髓细胞悬液。
2 结果
阳性对照K526细胞显示有较高的端粒酶活性，平均A值为0.982，且PCR产物电泳可见银染结果阳性。阴性对照未显示端粒酶活性。
7例初发AML中均可测得端粒酶活性，A值为0.038～0.849，均值0.318。其中5例电泳银染结果阳性。6例AML完全缓解期患者端粒酶活性(A值)为0.00～0.122，均值0.035，其中2例电泳银染结果阳性。非恶性血液系统疾病也均不同程度地测到端粒酶活性，A值为0.001～0.471，均值0.071，其中6例显示电泳银染结果阳性。
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各组间端粒酶活性A值经t检验，初发AML与完全缓解期AML两组间t值为2.30，P<0.05差异有显著意义，初发AML与非恶性血液系统疾病两组间t值为3.061，P<0.01，差异有极显著意义。完全缓解期组与非恶性血液系统疾病组间 t值为0.635，P>0.05，无显著性差异。
初发白血病患者端粒酶表达水平与外周血白细胞总数和白血病细胞数的相关系数分别为0.2722和0.1589，均为P>0.05，示无显著相关性。
3 讨论
本实验结果显示在32例急性白血病和非恶性血液系统疾病中，除1例未显示端粒酶活性外，余病例均有不同程度的端粒酶活性表达。Counter等〔4〕研究也显示在正常人外周血、脐血和骨髓中也有低水平的端粒酶活性，并认为血液细胞是迄今为止成人体细胞中唯一表达端粒酶活性的细胞，这些阳性细胞的生物学意义和特征尚未明了，在细胞培养中发现最原始的骨髓细胞中存在有端粒DNA的丢失，提示端粒酶阳性细胞可能属于具有分化潜能的造血细胞〔3，5〕。
, http://www.100md.com
端粒酶的活性可能与肿瘤的某些生物学行为有关，由于端粒酶的活化使端粒长度维持一种动态平衡，细胞得以无限制增殖下去，因此导致了肿瘤的发生。在急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病和骨髓异常增生综合征后期的病程中均存在有端粒酶活性的激活而引起端粒酶活性的升高〔4〕。我们的结果也提示在AML患者中该酶活性明显高于非恶性血液系统疾病患者，虽未发现AML患者端粒酶活性与其体内的白细胞总数和白血病细胞数之间有显著相关性，但在完全缓解患者中端粒酶活性明显低于初发患者且与非恶性血液病患者间无显著性差异，提示检测端粒酶活性在观察疾病疗效中具有一定的价值。
在我们的研究中也发现1例造血功能极度低下的患者存在有端粒酶活性的高表达，A值达0.471，目前尚未找到合理的解释。
参考文献
1，Blackburm E H.Structure and function of telomeres. Nature ,1991,3,50:569～573
, http://www.100md.com
2，Harley C B,Vaziri H, Counter C M,et al.The telomere hypothesis of cellular ageing.EXP Gerontol,1992,27:375～382
3，Chadenean C,Hayk, Hirte H W,et al.Telomerase activity associated with acquisition of malignancy in human colorectal cancer.Cancer Res,1995,55:2533～2536
4，Counter C M,Cupta J.Harley C B,et al.Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies.Blood,1995,85:2315～2320
5，Vaziri H, Schachter F, Uchida I,et al.Loss of teiomeric DNA during aging of normal and trisomy 21 human lymphocytes. Am J Hum Genet,1993,52:661～667
收稿：1999-06-18
修回：1999-12-16, 百拇医药