从6例血友病患者分离的TT病毒基因克隆及序列测定
作者：张庶民 Anders Widell 庄辉 李河民 张华远 祁自柏
单位：张庶民 李河民 张华远 祁自柏(中国药品生物制品检定所)；庄辉(北京医科大学)；Anders Widell(瑞典马尔默总医院)
关键词：输血传播病毒；基因型；血友病
中华微生物学和免疫学杂志000313 【 摘要 】 目的 了解血友病人的输血传播病毒(TTV)基因型及其在个体内存在状况。 方法 对6例血友病人血清中分离的TTV进行基因克隆，从每例病人的标本随机选多个克隆进行测序，比较其核苷酸和氨基酸序列。 结果 除1例病人的5个克隆TTV DNA序列基本相同外，其余病人所测的TTV DNA克隆序列均不完全相同。根据同源性分析，该6例病人的TTV DNA主要可分为3组：G1a、G1b和G2基因型。 结论 同一病人可混合感染不同TTV毒株。
Cloning and sequencing of transfusion transmitted
, http://www.100md.com
viruses(TTV) isolated from 6 patients
with hemophilia
ZHANG Shumin*, Anders Widell, ZHUANG Hui, et al.*National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P.R.China
【 Abstract 】 Objective To study genotypes and status TTV existence in patients with hemophilia. Method TTV DNA isolated from sera of 6 hemophilic patients by polymerase chain reaction(PCR) were cloned using TA easy vector. 3-5 clones selected from each patient randomly were sequenced, and then compared with TTV DNA sequences in GenBank. Results Five of 6 patients have different sequences of TTV DNA clones, and only one patient has the same genotype of the virus. All the clones obtained from 6 patients can be divided into 3 groups:G1a,G1b and G2. Conclusion Mixed infection of different TTV strains was found in patients with hemophilia.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Transfusion transmitted virus; Genotype; Hemophilia
TTV为3.7kb无包膜的单链DNA病毒，于1997年发现，最初曾认为与 非甲～庚型肝炎有关〔1, 2〕。初步的研究显示，TTV分布极为广泛，尤其是多次受血的人群，其TTV感染率较高。为了解血友病患者感染TTV的基因型及其在个体内的存在状况，我们对6例血友病患者血清中分离的TTV进行了基因克隆和测序，现将结果报告如下。
材料与方法
标本：6例血友病人血清标本(A、B、C、D、E、F)由瑞典马尔默总医院微生物学系提供。
材料来源：DNA提取试剂盒购自德国QIAgen公司。Topo-TA克隆试剂盒购自Invitrogen公司。Taq酶为PE公司产品。
, 百拇医药
引物及PCR扩增条件：引物参照TTV序列设计。P1(1900～1923)：5′-ACAGACAGAGGAGAAGG CAACATG； P2(2185～2164)：5′-CTGGCATTTTACCATTTCCAAA； P3(1915～1938)：5′-GGCAACATGCTTTGGATAGACTGG。其中P1、P2为外引物，P2、P3为内引物。
第一次与第二次循环条件相同：94℃ 5min后，开始循环，94℃ 1min 30s，60℃，1min 30s，72℃，1min 40s，35个循环后，72℃延伸5min，PCR扩增产物用4%凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
克隆及测序：PCR扩增产物经1%低熔点琼脂糖电泳，切下目的带，用QIAgen试剂盒纯化目的DNA。根据TA克隆质粒试剂盒说明，将纯化DNA直接克隆入TA质粒中，分别用PCR直接检测和提取DNA后EcoRI酶切筛选阳性克隆。
, 百拇医药
阳性菌株接种于LB-氨苄(100μg/ml)培养基中，37℃培养过夜。用QIAgen试剂盒提取质粒DNA后，用M13(reverse)CAGGAAACAGCTATGAC和M13(forward)GTAAAACGACGGCCAG进行双向测序(ABI 373全自动测序仪)。
序列分析和比较：用Sequence Navigator和Factura分析测定序列，序列比较用Mult Alin和Blast软件完成。
图2 TTV克隆氨基酸序列比较
Fig 2. Comparison of the sequence of TTV aminoacid
结果
1. TTV检测：应用套式PCR对6例血友病人进行检测，扩增片段约270bp(1915bp～2185bp)。扩增产物经检测与目的片段的相对分子质量相符，6例血友病人均为TTV DNA阳性。
, 百拇医药
2.克隆及测序：6例病人均采用TA质粒克隆，每个病人随机选择数个克隆进行测序，并比较核苷酸和氨基酸序列，结果发现除C病人的5个克隆序列基本相同外，其余病人所测克隆均有不同(见图1、2)，提示同一病人存在不同病毒株的混合感染。
图1 TTV克隆核苷酸序列比较
Fig 1. Comparison of the sequcnce of the TTV clones
根据所测序列的同源性分析，从该6例血友病人血清中分离的TTV主要可分为3组：即Gla、Glb和G2(见图3)。对比中国株(AF079173)和日本株(AB008394)相应位置序列，发现中国株(AF079173)与日本株(AB008394)的同源性最高，F-3株序列与中国株和日本株同源性较高，但与其它TTV基因组的同源性较低。
, 百拇医药
随机选择C-3和A-4株序列与GenBank中TTV序列比较，发现C-3与英国(AF072749)和巴西(AF081078)株同源性最高；A-4与德国株(AF060547)和另一日本株JaBD21同源性最高(见图3)。
图3 TTV基因序列分析
Fig 3. Geno typing of the sequence of TTV clones讨论
TT病毒主要经血传播。Simmonds等〔3〕报道，在血友病人中TTV感染率较高。本研究检测的6例血友病人，TTV DNA均为阳性。通过对此6例血友病人TTV DNA克隆、测序及氨基酸和核苷酸序列比较，发现6例病人中有5例为不同TTV毒株混合感染。在HCV的研究中发现，其混合感染以一种病毒株为主的形式存在，其它毒株处于次要地位。本研究对每例病人测定5个克隆的序列结果未显示以一种病毒株为主的现象。如果这种混合感染现象是暂时的，则说明混合感染可能与病人多次受血有关。但是，如果这种现象长期存在，则提示可能有不同株病毒共存的现象。
, 百拇医药
Tanaka 等〔4〕将世界各地克隆的93株TT病毒的ORF1(1939nt～2149nt)进行比较后，将TTV主要分为6型，即G1、G2、G3、G4、G5和G6，并建立了RFLP分型方法。本研究所克隆的病毒序列包含此段序列，经比较，发现所测序列主要由3种不同类型基因组成。根据Tanaka 等的分型，可分别归于G1a,G1b和G2型。一例序列(F-3)与中国和日本株具有较大的同源性，说明G1、G2型可能在世界范围内广泛存在〔4〕。
参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in post-transfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 24(1):92-97.
, 百拇医药
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research, 1998, 10:1-16.
3 Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products. Lancet, 1998, 352:191-195.
4 Tanaka Y, Mizokami M, Orito E, et al. New genotypes of TT virus (TTV) and a genotyping assay based on restriction fragment length polymorphism. FEBS letters, 1998, 437:201-206.
(收稿日期：1999-02-12), http://www.100md.com
单位：张庶民 李河民 张华远 祁自柏(中国药品生物制品检定所)；庄辉(北京医科大学)；Anders Widell(瑞典马尔默总医院)
关键词：输血传播病毒；基因型；血友病
中华微生物学和免疫学杂志000313 【 摘要 】 目的 了解血友病人的输血传播病毒(TTV)基因型及其在个体内存在状况。 方法 对6例血友病人血清中分离的TTV进行基因克隆，从每例病人的标本随机选多个克隆进行测序，比较其核苷酸和氨基酸序列。 结果 除1例病人的5个克隆TTV DNA序列基本相同外，其余病人所测的TTV DNA克隆序列均不完全相同。根据同源性分析，该6例病人的TTV DNA主要可分为3组：G1a、G1b和G2基因型。 结论 同一病人可混合感染不同TTV毒株。
Cloning and sequencing of transfusion transmitted
, http://www.100md.com
viruses(TTV) isolated from 6 patients
with hemophilia
ZHANG Shumin*, Anders Widell, ZHUANG Hui, et al.*National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P.R.China
【 Abstract 】 Objective To study genotypes and status TTV existence in patients with hemophilia. Method TTV DNA isolated from sera of 6 hemophilic patients by polymerase chain reaction(PCR) were cloned using TA easy vector. 3-5 clones selected from each patient randomly were sequenced, and then compared with TTV DNA sequences in GenBank. Results Five of 6 patients have different sequences of TTV DNA clones, and only one patient has the same genotype of the virus. All the clones obtained from 6 patients can be divided into 3 groups:G1a,G1b and G2. Conclusion Mixed infection of different TTV strains was found in patients with hemophilia.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Transfusion transmitted virus; Genotype; Hemophilia
TTV为3.7kb无包膜的单链DNA病毒，于1997年发现，最初曾认为与 非甲～庚型肝炎有关〔1, 2〕。初步的研究显示，TTV分布极为广泛，尤其是多次受血的人群，其TTV感染率较高。为了解血友病患者感染TTV的基因型及其在个体内的存在状况，我们对6例血友病患者血清中分离的TTV进行了基因克隆和测序，现将结果报告如下。
材料与方法
标本：6例血友病人血清标本(A、B、C、D、E、F)由瑞典马尔默总医院微生物学系提供。
材料来源：DNA提取试剂盒购自德国QIAgen公司。Topo-TA克隆试剂盒购自Invitrogen公司。Taq酶为PE公司产品。
, 百拇医药
引物及PCR扩增条件：引物参照TTV序列设计。P1(1900～1923)：5′-ACAGACAGAGGAGAAGG CAACATG； P2(2185～2164)：5′-CTGGCATTTTACCATTTCCAAA； P3(1915～1938)：5′-GGCAACATGCTTTGGATAGACTGG。其中P1、P2为外引物，P2、P3为内引物。
第一次与第二次循环条件相同：94℃ 5min后，开始循环，94℃ 1min 30s，60℃，1min 30s，72℃，1min 40s，35个循环后，72℃延伸5min，PCR扩增产物用4%凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
克隆及测序：PCR扩增产物经1%低熔点琼脂糖电泳，切下目的带，用QIAgen试剂盒纯化目的DNA。根据TA克隆质粒试剂盒说明，将纯化DNA直接克隆入TA质粒中，分别用PCR直接检测和提取DNA后EcoRI酶切筛选阳性克隆。
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阳性菌株接种于LB-氨苄(100μg/ml)培养基中，37℃培养过夜。用QIAgen试剂盒提取质粒DNA后，用M13(reverse)CAGGAAACAGCTATGAC和M13(forward)GTAAAACGACGGCCAG进行双向测序(ABI 373全自动测序仪)。
序列分析和比较：用Sequence Navigator和Factura分析测定序列，序列比较用Mult Alin和Blast软件完成。
图2 TTV克隆氨基酸序列比较
Fig 2. Comparison of the sequence of TTV aminoacid
结果
1. TTV检测：应用套式PCR对6例血友病人进行检测，扩增片段约270bp(1915bp～2185bp)。扩增产物经检测与目的片段的相对分子质量相符，6例血友病人均为TTV DNA阳性。
, 百拇医药
2.克隆及测序：6例病人均采用TA质粒克隆，每个病人随机选择数个克隆进行测序，并比较核苷酸和氨基酸序列，结果发现除C病人的5个克隆序列基本相同外，其余病人所测克隆均有不同(见图1、2)，提示同一病人存在不同病毒株的混合感染。
图1 TTV克隆核苷酸序列比较
Fig 1. Comparison of the sequcnce of the TTV clones
根据所测序列的同源性分析，从该6例血友病人血清中分离的TTV主要可分为3组：即Gla、Glb和G2(见图3)。对比中国株(AF079173)和日本株(AB008394)相应位置序列，发现中国株(AF079173)与日本株(AB008394)的同源性最高，F-3株序列与中国株和日本株同源性较高，但与其它TTV基因组的同源性较低。
, 百拇医药
随机选择C-3和A-4株序列与GenBank中TTV序列比较，发现C-3与英国(AF072749)和巴西(AF081078)株同源性最高；A-4与德国株(AF060547)和另一日本株JaBD21同源性最高(见图3)。
图3 TTV基因序列分析
Fig 3. Geno typing of the sequence of TTV clones讨论
TT病毒主要经血传播。Simmonds等〔3〕报道，在血友病人中TTV感染率较高。本研究检测的6例血友病人，TTV DNA均为阳性。通过对此6例血友病人TTV DNA克隆、测序及氨基酸和核苷酸序列比较，发现6例病人中有5例为不同TTV毒株混合感染。在HCV的研究中发现，其混合感染以一种病毒株为主的形式存在，其它毒株处于次要地位。本研究对每例病人测定5个克隆的序列结果未显示以一种病毒株为主的现象。如果这种混合感染现象是暂时的，则说明混合感染可能与病人多次受血有关。但是，如果这种现象长期存在，则提示可能有不同株病毒共存的现象。
, 百拇医药
Tanaka 等〔4〕将世界各地克隆的93株TT病毒的ORF1(1939nt～2149nt)进行比较后，将TTV主要分为6型，即G1、G2、G3、G4、G5和G6，并建立了RFLP分型方法。本研究所克隆的病毒序列包含此段序列，经比较，发现所测序列主要由3种不同类型基因组成。根据Tanaka 等的分型，可分别归于G1a,G1b和G2型。一例序列(F-3)与中国和日本株具有较大的同源性，说明G1、G2型可能在世界范围内广泛存在〔4〕。
参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in post-transfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 24(1):92-97.
, 百拇医药
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research, 1998, 10:1-16.
3 Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products. Lancet, 1998, 352:191-195.
4 Tanaka Y, Mizokami M, Orito E, et al. New genotypes of TT virus (TTV) and a genotyping assay based on restriction fragment length polymorphism. FEBS letters, 1998, 437:201-206.
(收稿日期：1999-02-12), http://www.100md.com