哮喘患者痰中嗜酸细胞及其阳离子蛋白检测的意义
作者：张丹 杨振峰
单位：(广州第一军医大学珠江医院呼吸科 510282)
关键词：哮喘；诊断；嗜酸细胞；代谢；阳离子蛋白；代谢；痰液检测
河北医科大学学报000338
中图号 R562.25▲
哮喘是多种炎性细胞、介质共同参与的慢性气道炎症，检测细胞因子、炎症介质最直接、可靠的方法是获取炎症发生局部的体液、组织，如支气管粘膜活检、支气管肺胞灌洗液及痰液的检测，能直接、特异地反映局部炎症，其中痰液检测是1项简单易行、准确率较高、不受病情限制及安全的非侵入性手段。参与哮喘发病的多种炎症细胞、介质及细胞因子都可从痰中检出。本文就目前国内外关于哮喘患者痰中嗜酸细胞(esosinophil,EOS)及其阳离子蛋白(eosinphilic cationic protein,ECP)的含量与临床意义的研究进展综述如下。
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1 痰液的收集
哮喘患者痰液收集可分为自发痰和诱导痰两种，痰液均来自较大的气道。停服支气管扩张剂6 d，让患者自发地将痰咳至1个无菌容器中，即得到自发痰。诱导痰则先吸入沙丁胺醇(喘乐宁)，以抑制诱导过程中可能发生的气道收缩，用高渗盐水雾化吸入，逐渐调整增大吸入盐水的浓度(3 %、4 %和5 %)每次7 min，每个吸入浓度后均应测FEV1以保证安全，同时要求患者用水漱口并咽下，用鼻呼吸，以降低唾液和鼻后滴液的污染，尽力将痰咳至容器内。
诱导痰与自发痰相比，二者在痰重、总细胞计数、非鳞状细胞比例和类胰蛋白酶水平等方面相近，但自发痰中细胞活力低，而诱导痰中活性细胞比例高，鳞状细胞污染少，可以代表深部流体段(fluid-phase)的痰液[1]。诱导痰收集后应进行处理，以减少唾液(99 %为鳞状细胞[2])污染，提高ECP水平。处理方法常有：①咳痰之前先将唾液(稀薄部分)吐弃，再将痰(粘稠部分)吐入无菌容器内[3]；②磷酸缓冲盐(phosphate buffer salt,PBS)处理痰；或③用二巯基苏糖醇(dithiothreitol,DTT)处理。DTT通过除去巯基修饰物中保护巯基的集团，达到细胞分离。DTT可能会降低细胞成活力，但与PBS处理比较，总细胞计数和ECP水平较高，分化细胞比例、IL-5、IL-8等相近，所以DTT处理诱导痰可以有效分离细胞，使ECP水平增高，而且不影响其它介质的检测[4]。
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2 哮喘患者痰中EOS、ECP变化
EOS是哮喘中的主要炎性细胞，EOS激活时释放多种蛋白，这些蛋白的生物学功能及其在不同组织中的质量浓度反映了EOS在疾病中的组织学和临床表现中的作用，其中主要是ECP。放射免疫分析法可以检测ECP在不同组织体液,如血清、痰、支气管肺胞灌洗液(BALF)和鼻灌洗液等中的水平。
2.1 EOS、ECP水平与哮喘的临床表现关系
许多研究表明哮喘患者诱导痰中EOS 计数和ECP水平显著增高。Spanevello等检测了53例稳定期哮喘患者痰中EOS质量浓度为(12.2±12.9) %，ECP水平为(827±491) mg/L，与鼻炎(0.4±0.8 %，127±82 mg/L)和正常对照组(0.4±0.7 %，157±203 mg/L)相比均升高[5]。Pizzichini等将9例哮喘患者同20例对照(其中正常受试者10例，非阻塞性有吸烟史的支气管炎者10例)进行了统计学检验，结果痰中EOS比例为5.2 %对0.3 %，P<0.001，ECP水平升高，1 040.0 mg/L对455.3 mg/L，P=0.001[6]。痰中ECP水平与EOS计数具有一定的相关性，r=0.45。同时，EOS计数和ECP水平与平均每周总的症状得分呈显著正相关(r分别为0.52和0.48)，与平均PEFR呈负相关(r分别为-0.50和-0.65)。这些结果表明气道内EOS的活化可以反映哮喘的症状和气道阻塞[7]。哮喘患者在发作期最大峰值流速明显降低，Sugiyama等发现最大峰值流速的变化值与痰中EOS、ECP水平的变化值一致[8]。痰中EOS、ECP水平与PEFR的平均值及呼气流速和PC20呈负相关[7，9]，痰中ECP与FEV1%呈显著负相关[10]。
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Fahy及其同事对8例哮喘气雾性刺激前后诱导痰中的成分进行了检测和分析，发现诱导痰中EOS平均质量分数在过敏原刺激后4 h由0.5 %升至12 %(P<0.05)，并持续至24 h。而ECP水平在刺激后4 h也由39.8 mg/L升至151.3 mg/L，(P<0.05)且在24 h更高[11]。Fujimoto等还发现痰中ECP水平随哮喘程度加重而显著升高，而EOS仅在重症哮喘升高明显，在轻、中度哮喘无明显差异[7]。有报道，哮喘有症状患者痰中ECP比无症状患者高。ECP为EOS活化产物，较EOS指标更为敏感、准确地反映哮喘的严重程度，痰中ECP水平可作为评估哮喘严重程度和监控气道炎症的1项有意义指标[7，12]。
然而Pizzichizzi应用在接受操作特征性(reception-operation character,ROC)曲线上定点数据的方法检测实验的灵敏度和特异度时，比较了各种指标的曲线下面积，发现痰中ECP的曲线下面积尽管大于血EOS和血清ECP的曲线下面积，但此差异不显著(P≥0.1)，可能为偶然结果，痰中EOS计数则比血清EOS计数更准确[6]。痰液检测早在40年前已有介绍，但只是在最近5年才开始发展。大多数学者研究显示哮喘患者痰中EOS、ECP改变与哮喘的临床表现(包括症状出现、肺功能改变、严重等级)是一致的，但此类实验的重复率还不充分，研究例数不够多，少数结果依然存在争议。目前对哮喘进行诊断、评估的指标很多，据统计，在已确诊的哮喘患者，组织胺激发试验的敏感度为48 %，PEF测定为65 %，痰中ECP敏感度为74 %，血清ECP为78 %，认为可通过改进痰检测来提高哮喘监控指标的敏感性[13]。
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2.2 在疾病鉴别诊断中的应用
诊断哮喘的同时需要与慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)等均可引起气道阻塞和肺功能改变的疾病进行鉴别诊断。以往通过临床表现及肺功变化的可逆性来鉴别，其客观性不够完善。既然多种体液中ECP水平在哮喘发作时显著升高，那么在其他类型肺部疾病中是否也有同样变化呢?
前已述及，哮喘患者痰中EOS、ECP明显高于慢性支气管炎患者[9]Virchow及其同事在对7例支气管哮喘与7例慢性支气管炎患者的对比中发现，痰中ECP在哮喘者痰中为(893.4±346.2) mg/L，在慢性支气管炎者痰中为(30.0±8.5) mg/L，P=0.002，并且哮喘患者痰中ECP与气道梗阻的程度呈正相关，r＝0.76，P=0.05，而慢性支气管炎患者此相关性不显著，r=0.24，P=>0.05[14]。
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Motofima等报道，哮喘患者血清ECP明显高于COPD患者，血清ECP与FEV1%呈明显负相关，与痰中ECP也显著相关，可以作为鉴别诊断指标之一[15]。但仍有争议，通常认为COPD为中性粒细胞浸润，哮喘以EOS浸润为主，但实验发现二者痰中ECP均升高[16]，有报道哮喘患者痰中ECP水平为(984.5±1245.5) mg/L，COPD患者为(417.5±36.5) mg/L，两种患者间无显著差别，不能用作哮喘与COPD的鉴别诊断依据[17]。
2.3 疗效评定
糖皮质激素是哮喘治疗中首选的抗炎药物。Claman等对24例哮喘患者用强的松治疗并以安慰剂作对照，发现治疗组痰中EOS质量浓度由(14.1±5.0) %降至(1.8±0.8) %，而对照组无明显改变，由(10.3±4.9) %至(11.1±4.0) %，P=0.002。ECP在治疗组由(324±131) mg/L降至(144±84) mg/L，在对照组由(173±50) mg/L至(188±47) mg/L，前者ECP显著降低，P=0.002[18]。有报道，用强的松治疗后，哮喘的症状、FEV1、血清EOS和ECP在第1个24 h内即有改善，而痰中EOS和ECP直到48 h后才改善，痰液指标恢复晚，提示应用痰液检测EOS和ECP可作为评价治疗效果的1个动态指标[10]，但也有报道，痰液或血清中ECP与PC20以及痰中ECP与FEV1之间的相关性较弱[19]。
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3 痰检测与血清学、BALF检测比较
Sorva等对小儿哮喘患者进行了痰ECP和血清ECP的比较[20]，发现痰和血清中ECP水平较正常受试者高，但痰中ECP的差异更显著，治疗后临床改善伴有痰ECP下降，而血清ECP无变化，认为在诊断和检测哮喘时，痰ECP比血清ECP更敏感。Pizzichini在10例哮喘患者中检测血清中ECP升高，P＝0.08,痰中ECP水平也高,P=0.001[6]。而Tanimoto发现，血中ECP与痰ECP在哮喘儿童中均升高，但彼此之间无相关性，痰ECP水平在哮喘发作早期即明显升高，在3 d后才开始下降[21]。
支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)和支气管粘膜活检，可以直接观察到支气管粘膜损伤和局部浸润的炎性细胞及其产物。痰中EOS、ECP与BALF中测定值存在相关性，但前者非鳞状细胞数目和ECP水平比后者更高，P=0.0001。由于痰检为非侵入性手段，比BALF更简单安全，而且收集的样本更集中、更丰富，具有可重复性等优点[22，23]，现已广泛用于气道炎症的检测。
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痰液检测刚刚起步，尚处于研究探索阶段，并存在一些争议。如诱导痰的机理尚不完全清楚，痰检指标是否具有很好的疾病代表性，能否在鉴别诊断中成为依据之一；哮喘长期用药是临床问题之一，痰中ECP在治疗后恢复期各阶段的检测是否有显著意义等，还有待更深入的试验研究。当前对哮喘的研究处于多因子、多技术、多机制的洪流之中，痰液检测有望得到进一步的改善并广泛用于临床。■
参考文献
[1]Pizzichini MM,Popov TA,Efthimiadis A,et al.Spontaneous and induced sputum to measure indices of airway inflammation in asthma. Am J Respir Crit Care Med, 1996,154(4):866
[2]Fahy JV,Liu J,Wong H,et al.Cellular and biochemial analysis of induced sputum from asthma and from healthy subjects. Am Rev Respir Dis,1993,147(5):1126
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[3]Gershman NH,Wong HH,Liu JT,et al.Comparison of two methods of collecting induced sputum in asthmatic subjects.Eur Respir J, 1996,9(12):1448
[4]Efthimiadis A,Pizzichini MM,Pizzichini E,et al.Induced sputum cell and fluid-phase indices of inflammation:comparison of treatment with dithiothreitol vs phosphate-buffered saline.Eur Respir J,1997,10(6):1336
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[6]Pizzichini E,Pizzichini MM,Efthimiadis A,et al.Measuring airway inflammation in asthma:eosinophils and eosinphilic cationic protein in induced sputum compared with peripheral blood.J Allergy Clin Immunol,1997,99(4):539
[7]Fujimoto K,Kubo K,Matsuzawa Y,et al.Eosinophil cationic protein levels in induced sputum correlate with the severity of bronchial asthma.Chest,1997,112(5):1241
[8]Sugiyama K,Fukushima Y,Fukuda T,et al.Histopathological changes and hyperresponsiveness in asthmatic airway:relationship to peak experatory flow.Nippon Rinsho,1996,54(11):2944
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[9]Pizzichini E, Pizzichini MM,Efthimiadis A,et al.Indices of airway inflammation in induced sputum:reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. Am J Respir Crit Care Med, 1996,154(2):308
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[22]Mita S, Matsuura T,Adachi M,et al.Methods of evaluating airway inflammation. Nippon-Rinsho, 1996,54(11):2898
[23]Fahy JV,Wong H,Liu J,et al.Comparison of samples collected by sputum induction and bronchoscopy from asthmatic and healthy subjects. Am J Rispir Crit Care Med, 1995,152(1):53
收稿日期：1998-07-14, http://www.100md.com
单位：(广州第一军医大学珠江医院呼吸科 510282)
关键词：哮喘；诊断；嗜酸细胞；代谢；阳离子蛋白；代谢；痰液检测
河北医科大学学报000338
中图号 R562.25▲
哮喘是多种炎性细胞、介质共同参与的慢性气道炎症，检测细胞因子、炎症介质最直接、可靠的方法是获取炎症发生局部的体液、组织，如支气管粘膜活检、支气管肺胞灌洗液及痰液的检测，能直接、特异地反映局部炎症，其中痰液检测是1项简单易行、准确率较高、不受病情限制及安全的非侵入性手段。参与哮喘发病的多种炎症细胞、介质及细胞因子都可从痰中检出。本文就目前国内外关于哮喘患者痰中嗜酸细胞(esosinophil,EOS)及其阳离子蛋白(eosinphilic cationic protein,ECP)的含量与临床意义的研究进展综述如下。
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1 痰液的收集
哮喘患者痰液收集可分为自发痰和诱导痰两种，痰液均来自较大的气道。停服支气管扩张剂6 d，让患者自发地将痰咳至1个无菌容器中，即得到自发痰。诱导痰则先吸入沙丁胺醇(喘乐宁)，以抑制诱导过程中可能发生的气道收缩，用高渗盐水雾化吸入，逐渐调整增大吸入盐水的浓度(3 %、4 %和5 %)每次7 min，每个吸入浓度后均应测FEV1以保证安全，同时要求患者用水漱口并咽下，用鼻呼吸，以降低唾液和鼻后滴液的污染，尽力将痰咳至容器内。
诱导痰与自发痰相比，二者在痰重、总细胞计数、非鳞状细胞比例和类胰蛋白酶水平等方面相近，但自发痰中细胞活力低，而诱导痰中活性细胞比例高，鳞状细胞污染少，可以代表深部流体段(fluid-phase)的痰液[1]。诱导痰收集后应进行处理，以减少唾液(99 %为鳞状细胞[2])污染，提高ECP水平。处理方法常有：①咳痰之前先将唾液(稀薄部分)吐弃，再将痰(粘稠部分)吐入无菌容器内[3]；②磷酸缓冲盐(phosphate buffer salt,PBS)处理痰；或③用二巯基苏糖醇(dithiothreitol,DTT)处理。DTT通过除去巯基修饰物中保护巯基的集团，达到细胞分离。DTT可能会降低细胞成活力，但与PBS处理比较，总细胞计数和ECP水平较高，分化细胞比例、IL-5、IL-8等相近，所以DTT处理诱导痰可以有效分离细胞，使ECP水平增高，而且不影响其它介质的检测[4]。
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2 哮喘患者痰中EOS、ECP变化
EOS是哮喘中的主要炎性细胞，EOS激活时释放多种蛋白，这些蛋白的生物学功能及其在不同组织中的质量浓度反映了EOS在疾病中的组织学和临床表现中的作用，其中主要是ECP。放射免疫分析法可以检测ECP在不同组织体液,如血清、痰、支气管肺胞灌洗液(BALF)和鼻灌洗液等中的水平。
2.1 EOS、ECP水平与哮喘的临床表现关系
许多研究表明哮喘患者诱导痰中EOS 计数和ECP水平显著增高。Spanevello等检测了53例稳定期哮喘患者痰中EOS质量浓度为(12.2±12.9) %，ECP水平为(827±491) mg/L，与鼻炎(0.4±0.8 %，127±82 mg/L)和正常对照组(0.4±0.7 %，157±203 mg/L)相比均升高[5]。Pizzichini等将9例哮喘患者同20例对照(其中正常受试者10例，非阻塞性有吸烟史的支气管炎者10例)进行了统计学检验，结果痰中EOS比例为5.2 %对0.3 %，P<0.001，ECP水平升高，1 040.0 mg/L对455.3 mg/L，P=0.001[6]。痰中ECP水平与EOS计数具有一定的相关性，r=0.45。同时，EOS计数和ECP水平与平均每周总的症状得分呈显著正相关(r分别为0.52和0.48)，与平均PEFR呈负相关(r分别为-0.50和-0.65)。这些结果表明气道内EOS的活化可以反映哮喘的症状和气道阻塞[7]。哮喘患者在发作期最大峰值流速明显降低，Sugiyama等发现最大峰值流速的变化值与痰中EOS、ECP水平的变化值一致[8]。痰中EOS、ECP水平与PEFR的平均值及呼气流速和PC20呈负相关[7，9]，痰中ECP与FEV1%呈显著负相关[10]。
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Fahy及其同事对8例哮喘气雾性刺激前后诱导痰中的成分进行了检测和分析，发现诱导痰中EOS平均质量分数在过敏原刺激后4 h由0.5 %升至12 %(P<0.05)，并持续至24 h。而ECP水平在刺激后4 h也由39.8 mg/L升至151.3 mg/L，(P<0.05)且在24 h更高[11]。Fujimoto等还发现痰中ECP水平随哮喘程度加重而显著升高，而EOS仅在重症哮喘升高明显，在轻、中度哮喘无明显差异[7]。有报道，哮喘有症状患者痰中ECP比无症状患者高。ECP为EOS活化产物，较EOS指标更为敏感、准确地反映哮喘的严重程度，痰中ECP水平可作为评估哮喘严重程度和监控气道炎症的1项有意义指标[7，12]。
然而Pizzichizzi应用在接受操作特征性(reception-operation character,ROC)曲线上定点数据的方法检测实验的灵敏度和特异度时，比较了各种指标的曲线下面积，发现痰中ECP的曲线下面积尽管大于血EOS和血清ECP的曲线下面积，但此差异不显著(P≥0.1)，可能为偶然结果，痰中EOS计数则比血清EOS计数更准确[6]。痰液检测早在40年前已有介绍，但只是在最近5年才开始发展。大多数学者研究显示哮喘患者痰中EOS、ECP改变与哮喘的临床表现(包括症状出现、肺功能改变、严重等级)是一致的，但此类实验的重复率还不充分，研究例数不够多，少数结果依然存在争议。目前对哮喘进行诊断、评估的指标很多，据统计，在已确诊的哮喘患者，组织胺激发试验的敏感度为48 %，PEF测定为65 %，痰中ECP敏感度为74 %，血清ECP为78 %，认为可通过改进痰检测来提高哮喘监控指标的敏感性[13]。
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2.2 在疾病鉴别诊断中的应用
诊断哮喘的同时需要与慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)等均可引起气道阻塞和肺功能改变的疾病进行鉴别诊断。以往通过临床表现及肺功变化的可逆性来鉴别，其客观性不够完善。既然多种体液中ECP水平在哮喘发作时显著升高，那么在其他类型肺部疾病中是否也有同样变化呢?
前已述及，哮喘患者痰中EOS、ECP明显高于慢性支气管炎患者[9]Virchow及其同事在对7例支气管哮喘与7例慢性支气管炎患者的对比中发现，痰中ECP在哮喘者痰中为(893.4±346.2) mg/L，在慢性支气管炎者痰中为(30.0±8.5) mg/L，P=0.002，并且哮喘患者痰中ECP与气道梗阻的程度呈正相关，r＝0.76，P=0.05，而慢性支气管炎患者此相关性不显著，r=0.24，P=>0.05[14]。
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Motofima等报道，哮喘患者血清ECP明显高于COPD患者，血清ECP与FEV1%呈明显负相关，与痰中ECP也显著相关，可以作为鉴别诊断指标之一[15]。但仍有争议，通常认为COPD为中性粒细胞浸润，哮喘以EOS浸润为主，但实验发现二者痰中ECP均升高[16]，有报道哮喘患者痰中ECP水平为(984.5±1245.5) mg/L，COPD患者为(417.5±36.5) mg/L，两种患者间无显著差别，不能用作哮喘与COPD的鉴别诊断依据[17]。
2.3 疗效评定
糖皮质激素是哮喘治疗中首选的抗炎药物。Claman等对24例哮喘患者用强的松治疗并以安慰剂作对照，发现治疗组痰中EOS质量浓度由(14.1±5.0) %降至(1.8±0.8) %，而对照组无明显改变，由(10.3±4.9) %至(11.1±4.0) %，P=0.002。ECP在治疗组由(324±131) mg/L降至(144±84) mg/L，在对照组由(173±50) mg/L至(188±47) mg/L，前者ECP显著降低，P=0.002[18]。有报道，用强的松治疗后，哮喘的症状、FEV1、血清EOS和ECP在第1个24 h内即有改善，而痰中EOS和ECP直到48 h后才改善，痰液指标恢复晚，提示应用痰液检测EOS和ECP可作为评价治疗效果的1个动态指标[10]，但也有报道，痰液或血清中ECP与PC20以及痰中ECP与FEV1之间的相关性较弱[19]。
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3 痰检测与血清学、BALF检测比较
Sorva等对小儿哮喘患者进行了痰ECP和血清ECP的比较[20]，发现痰和血清中ECP水平较正常受试者高，但痰中ECP的差异更显著，治疗后临床改善伴有痰ECP下降，而血清ECP无变化，认为在诊断和检测哮喘时，痰ECP比血清ECP更敏感。Pizzichini在10例哮喘患者中检测血清中ECP升高，P＝0.08,痰中ECP水平也高,P=0.001[6]。而Tanimoto发现，血中ECP与痰ECP在哮喘儿童中均升高，但彼此之间无相关性，痰ECP水平在哮喘发作早期即明显升高，在3 d后才开始下降[21]。
支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)和支气管粘膜活检，可以直接观察到支气管粘膜损伤和局部浸润的炎性细胞及其产物。痰中EOS、ECP与BALF中测定值存在相关性，但前者非鳞状细胞数目和ECP水平比后者更高，P=0.0001。由于痰检为非侵入性手段，比BALF更简单安全，而且收集的样本更集中、更丰富，具有可重复性等优点[22，23]，现已广泛用于气道炎症的检测。
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痰液检测刚刚起步，尚处于研究探索阶段，并存在一些争议。如诱导痰的机理尚不完全清楚，痰检指标是否具有很好的疾病代表性，能否在鉴别诊断中成为依据之一；哮喘长期用药是临床问题之一，痰中ECP在治疗后恢复期各阶段的检测是否有显著意义等，还有待更深入的试验研究。当前对哮喘的研究处于多因子、多技术、多机制的洪流之中，痰液检测有望得到进一步的改善并广泛用于临床。■
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收稿日期：1998-07-14, http://www.100md.com