广东汉族人低分子量多肽基因的检测
作者：黄庆晖 陈盛强 刘利东 邓维意
单位：黄庆晖(广州医学院第一附属医院神经内科，广州 510120)；陈盛强(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)；刘利东(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)；邓维意(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)
关键词：低分子量多肽基因；广东汉族人；多态性
广州医学院学报000309
提要 目的：了解广东汉族人LMP基因的分布特点。方法：应用聚合酶链反应技术对正常人低分子量多肽基因LMP2和LMP3进行扩增以cfoⅠ进行限制性酶切图谱分析。结果：广东汉族人的LMP2和LMP7的基因频率分别是LMP2*A 0.3232、LMP2* B 0.6768、LMP7*A 0.4174、LMP7*B 0.5826。结论：广东汉族人LMP基因的分布与与其它地区人群的分布有不同。
, 百拇医药
中图分类号 R392.2 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0029-04
Detection of Low Molecular Weight Peptides
Gene in the Hans in Guangdong.
Huang Qinghui
(Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College.Guangzhou,510120)
Chen Shengqing Liu Lidong Deng Weiyi
(Research Institute of Neuroscience,Guangzhou Medical College,Guangzhou,510182)
, http://www.100md.com
Objective: To identify the distribution feature of LMP gene in the Hans in Guangdong Province. Method:LMP2 and LMP7 genes from normal individuals were amplified with PCR and their restricted enzyme digested maps analysis were done with cfoI. Results:It was shown that the gene frequency of LMP2 and LMP7 was as follewed: LMP2*A 0.3232,LMP2 *B 0.6768,LMP7*A 0.4174,LMP7*B 0.5826. Condusion:The LMP gene's distribution in the Hans in Guangdong Province is different from those in other areas.
, http://www.100md.com
Key words Low molecular weight peptides gene;The Hans in Guangdong Province;Polymorphism.
低分子量多肽(low molecular weight peptide,LMP)[1、2]作为加工抗原蛋白酶体的亚基，其基因定位于人第六对染色体短臂上的MHC区域上，LMP与HLA-Ⅰ类和Ⅱ类基因一样具有多态性，检测这种多态性对某些疾病的遗传易感性、民族源流的考察、法医学鉴定、器官移植组织配型及免疫调控的研究有重要意义。不同地区不同种族不同人群的LMP均有不同。为了解广东汉族人LMP基因的分布特点，我们采用PCR-RFLP方法检测LMP，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 正常人100例其中男55例，女45例，平均年龄40岁。标本采自广州医学院教职工。
, 百拇医药
1.2 DNA提取 取外周静脉血清0.5ml,2%EDTA抗凝，裂解红细胞，白细胞沉淀用500μl PCR buffer,加蛋白酶K 3μl(10mg/μl),55℃水浴1h，96℃10min灭活，取5μl作PCR模板。
1.3 PCR扩增及产物酶切
1.3.1 LMP基因检测 用Maksymowych[3]等设计的引物特异扩增LMP2基因第2外显子140bp片段，引物为上游5’-GAACTCCAGAGCTTCATA-3’，下游5’-GTGAACCGAGTGTTTGAC-3’，PCR体系40μl，条件为94℃预变性10min，94℃30s，58℃30s，72℃45s，30个循环，72℃延伸5min，应用Glenn等设计的引物特异扩增LMP7基因含第6内含子在内的774bp片段，引物为上游5’-TCTACTACGTGGATGAACATGG-3’，下游5’-TTGATTGGCTTCCCGGTACTG-3’。PCR条件为94℃预变性10min，94℃30s，60℃30s，72℃45s，30个循环，72℃循环延伸5min。PCR产物40μl，3MNaHCO4μl,无水乙醇100μl，-20℃沉淀过夜，12000r/min离心5min，70%乙醇洗2次，晾干，20μl灭菌双蒸水溶解，20μl酶切体系依此加入10μl PCR纯化产出物、Buffer 2μl、BSA 1μl、cof I 5μl,用水补足20μl，37℃水浴过夜，3%琼脂糖100V电泳。
, 百拇医药
1.3.2 LMP基因多肽性分析
LMP2基因扩增产物为LMP2基因第2外显子中140bp片段，1等位基因第98位是A，2等位基因第98位A为G代替，限制性内切酶CfoI识别序列为GCGC，将B等位基因切成98和42两个片段，LMP7B等位基因(位于第6内含子)依据同理可被限制酶CfoI切成两个片段。
1.4 将所得结果与文献报道[3、4、7]的其他地区、种族人群LMP基因分布特点进行比较。
1.5 统计方法 表型频率和基因频率采用基因计数法计算，正常人群进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律的检验，人群之间的比较采用χ2检验。
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 经PCR扩增后、LMP2均产生140bp带、LMP7均产生774bp带。
2.2 重复性实验，10份标本，每份重复5次PCR扩增，均产生同样结果。
2.3 广东汉族人LMP表型及基因频率见表1。
表1 广东汉族人LMP表型及基因频率 表型
观察数
预期数
χ2
基因频率%
n
%
, 百拇医药
n
LMP2A/A
8
8.08
10.34
0.5295
LMP2*A 32.32
LMP2A/B
48
48.48
43.31
0.5013
, 百拇医药
LMP2*B 67.68
LMP2B/B
43
43.43
45.34
0.1207
df=1
∑χ21.1515
LMP7A/A
22
21.34
, 百拇医药
17.94
0.9188
LMP7*B 41.74
LMP7A/B
53
51.48
50.09
0.1616
LMP7*B 58.26
LMP7B/B
28
, 百拇医药
27.18
34.96
1.3856
df=1
∑χ21.1515
从上表可看出，LMP2A/A纯合子、LMP2A/A纯合子、LMP2A/B杂合子 、LMP7A/A纯合子、LMP7A/A纯合子、LMP7A/B杂合子表型的观察数与预期数比较，没有显著的差异，说明其表型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，也说明这一广东汉族人LMP的检测结果具有代表性。2.4 广东汉族人LMP2基因及基因频率分析及与其它地区人群的比较见表2。
, 百拇医药
2.5 广东汉族人LMP7基因及基因频率分析及与其它地区人群的比较见表3。
表2 广东汉族人LMP2基因及基因频率分析及其它地区人群的比较
中国(广东)
中国(北京)
加拿大
美国
Genotype
N=99
N=45
N=163
N=192
, 百拇医药
Frequency
LMP2A/A
8
2
9
12
LMP2A/B
48
19
65
76
LMP2B/B
, http://www.100md.com
43
24
89
104
Gene
N=198
N=90
N=326
N=384
frequency
LMP2*A
64(32.32)
, http://www.100md.com
23(25.5)
83(25.4)
100(26.04)
LMP2*B
134(67.68)
67(74.5)
243(74.5)
284(73.95)
表3 广东汉族人LMP7基因及基因频率
分析及其它地区人群的比较
中国(广东)
, http://www.100md.com
美国
Genotype
Frequency
LMP7A/A
22
41
LMP7A/B
53
83
LMP7B/B
28
62
, 百拇医药
Gene
N=206
N=396
Frequency
LMP7*A
97(41.74)
165(44.32)
LMP7*B
109(58.26)
207(55.67)
3 讨论
, 百拇医药
HLA是人类第6号染色体上一组高度多态性的基因群，在免疫系统尤其是免疫识别及其遗传控制中起极重要作用，LMP基因是位于Ⅱ区的一个基因组[2]。它有2个基因位点LMP2及LMP7，它们是构成一种多功能蛋白酶的两个活性单位，可以将蛋白质水解成8～15个氨基酸的小肽。已有研究证明，这种蛋白酶参与MHC-Ⅰ类分子所呈递抗原的加工过程[5]，LMP2和LMP7的同种异型的变化可能导致蛋白酶水解特性的改变，而且LMP基因受IFN诱导后表达产物增加，蛋白酶酶解底物特异性因之发生变化[6]，因此检测LMP基因的多态性对某些疾病的发生、发展有重要意义。国外已有学者研究某些自身免疫性疾病与LMP基因存在相关[4]。
本研究进行了广东汉族人群与其他种族人群LMP的基因频率、基因型频率的比较。与白种人群的研究结果相比，广东汉族正常人群的LMP2*A、LMP7*B等位基因频率高于白种正常人群，LMP2*B、LMP7*A等位基因频率低于白种正常人群；广东汉族正常人群的LMP2基因频率与北京汉族正常人群的LMP基因频率[7]比较，广东汉族正常人群的LMP2*A等位基因频率高于北京正常人群，LMP2*B等位基因频率低于北京正常人群，说明中国汉族人LMP的分布南北有不同变化。
, 百拇医药
作者简介：黄庆晖，男，(1968，8-)，硕士，住院医师。研究方向：免疫与神经系统疾病
参考文献
[1]Van Endert PM,Lopez MT,Putel SD,et al.Genomic polymorphism,recombination and linkaqe disequilibrium in human major histocopactibility complex-en-coded anrigen-processing genes[J].Proc Natl A Sci USA,1992;89:11594～11597
[2]Kelly A,Powis SH,Glynne R,et al.Second proteasome related gene in the human MHC classⅡregion[J].Nature,1991;353:667～668
, http://www.100md.com
[3]Maksymowych WP,Suarez-Almuzor M,Choa CT,et al.Polymorphism in the LMP2 gene influences susceptibility to extraspinal disease in HLA-B27 positive individuals with ankylosing spondylitis[J].Ann Rheum Dis,1995;54(4):321～324
[4]Enn.YD,Muir A,Macluren NK,et al.Association of LMP2 and LMP7 genes with in the major histocompatibility complex with Insulin-dependent diabetes mellitus:population and family studies[J].Am J Hum Genet,1995;56(2):528～534
, http://www.100md.com
[5]Rock KL.Gramm C,R othstein L,et al.Inhibiters of the proteasome block the degradation of cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class Ⅰ molecules[J].Cell, 1994;77(5):761～771
[6]Driscoll J,Brown MG,Finley D,et al.MHC-linked LMP gene products specially atler peptidase activities of the proteasome[J].Nature,1993;365:262～264
[7]丁海明，吕厚山，蒋东方等.低分子量多肽基因多态性与强直性脊柱炎表性的关系[J].中华医学遗传杂志，1999；16(4)：242～245
(收稿：2000-05-23), http://www.100md.com
单位：黄庆晖(广州医学院第一附属医院神经内科，广州 510120)；陈盛强(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)；刘利东(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)；邓维意(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)
关键词：低分子量多肽基因；广东汉族人；多态性
广州医学院学报000309
提要 目的：了解广东汉族人LMP基因的分布特点。方法：应用聚合酶链反应技术对正常人低分子量多肽基因LMP2和LMP3进行扩增以cfoⅠ进行限制性酶切图谱分析。结果：广东汉族人的LMP2和LMP7的基因频率分别是LMP2*A 0.3232、LMP2* B 0.6768、LMP7*A 0.4174、LMP7*B 0.5826。结论：广东汉族人LMP基因的分布与与其它地区人群的分布有不同。
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中图分类号 R392.2 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0029-04
Detection of Low Molecular Weight Peptides
Gene in the Hans in Guangdong.
Huang Qinghui
(Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College.Guangzhou,510120)
Chen Shengqing Liu Lidong Deng Weiyi
(Research Institute of Neuroscience,Guangzhou Medical College,Guangzhou,510182)
, http://www.100md.com
Objective: To identify the distribution feature of LMP gene in the Hans in Guangdong Province. Method:LMP2 and LMP7 genes from normal individuals were amplified with PCR and their restricted enzyme digested maps analysis were done with cfoI. Results:It was shown that the gene frequency of LMP2 and LMP7 was as follewed: LMP2*A 0.3232,LMP2 *B 0.6768,LMP7*A 0.4174,LMP7*B 0.5826. Condusion:The LMP gene's distribution in the Hans in Guangdong Province is different from those in other areas.
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Key words Low molecular weight peptides gene;The Hans in Guangdong Province;Polymorphism.
低分子量多肽(low molecular weight peptide,LMP)[1、2]作为加工抗原蛋白酶体的亚基，其基因定位于人第六对染色体短臂上的MHC区域上，LMP与HLA-Ⅰ类和Ⅱ类基因一样具有多态性，检测这种多态性对某些疾病的遗传易感性、民族源流的考察、法医学鉴定、器官移植组织配型及免疫调控的研究有重要意义。不同地区不同种族不同人群的LMP均有不同。为了解广东汉族人LMP基因的分布特点，我们采用PCR-RFLP方法检测LMP，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 正常人100例其中男55例，女45例，平均年龄40岁。标本采自广州医学院教职工。
, 百拇医药
1.2 DNA提取 取外周静脉血清0.5ml,2%EDTA抗凝，裂解红细胞，白细胞沉淀用500μl PCR buffer,加蛋白酶K 3μl(10mg/μl),55℃水浴1h，96℃10min灭活，取5μl作PCR模板。
1.3 PCR扩增及产物酶切
1.3.1 LMP基因检测 用Maksymowych[3]等设计的引物特异扩增LMP2基因第2外显子140bp片段，引物为上游5’-GAACTCCAGAGCTTCATA-3’，下游5’-GTGAACCGAGTGTTTGAC-3’，PCR体系40μl，条件为94℃预变性10min，94℃30s，58℃30s，72℃45s，30个循环，72℃延伸5min，应用Glenn等设计的引物特异扩增LMP7基因含第6内含子在内的774bp片段，引物为上游5’-TCTACTACGTGGATGAACATGG-3’，下游5’-TTGATTGGCTTCCCGGTACTG-3’。PCR条件为94℃预变性10min，94℃30s，60℃30s，72℃45s，30个循环，72℃循环延伸5min。PCR产物40μl，3MNaHCO4μl,无水乙醇100μl，-20℃沉淀过夜，12000r/min离心5min，70%乙醇洗2次，晾干，20μl灭菌双蒸水溶解，20μl酶切体系依此加入10μl PCR纯化产出物、Buffer 2μl、BSA 1μl、cof I 5μl,用水补足20μl，37℃水浴过夜，3%琼脂糖100V电泳。
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1.3.2 LMP基因多肽性分析
LMP2基因扩增产物为LMP2基因第2外显子中140bp片段，1等位基因第98位是A，2等位基因第98位A为G代替，限制性内切酶CfoI识别序列为GCGC，将B等位基因切成98和42两个片段，LMP7B等位基因(位于第6内含子)依据同理可被限制酶CfoI切成两个片段。
1.4 将所得结果与文献报道[3、4、7]的其他地区、种族人群LMP基因分布特点进行比较。
1.5 统计方法 表型频率和基因频率采用基因计数法计算，正常人群进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律的检验，人群之间的比较采用χ2检验。
2 结果
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2.1 经PCR扩增后、LMP2均产生140bp带、LMP7均产生774bp带。
2.2 重复性实验，10份标本，每份重复5次PCR扩增，均产生同样结果。
2.3 广东汉族人LMP表型及基因频率见表1。
表1 广东汉族人LMP表型及基因频率 表型
观察数
预期数
χ2
基因频率%
n
%
, 百拇医药
n
LMP2A/A
8
8.08
10.34
0.5295
LMP2*A 32.32
LMP2A/B
48
48.48
43.31
0.5013
, 百拇医药
LMP2*B 67.68
LMP2B/B
43
43.43
45.34
0.1207
df=1
∑χ21.1515
LMP7A/A
22
21.34
, 百拇医药
17.94
0.9188
LMP7*B 41.74
LMP7A/B
53
51.48
50.09
0.1616
LMP7*B 58.26
LMP7B/B
28
, 百拇医药
27.18
34.96
1.3856
df=1
∑χ21.1515
从上表可看出，LMP2A/A纯合子、LMP2A/A纯合子、LMP2A/B杂合子 、LMP7A/A纯合子、LMP7A/A纯合子、LMP7A/B杂合子表型的观察数与预期数比较，没有显著的差异，说明其表型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，也说明这一广东汉族人LMP的检测结果具有代表性。2.4 广东汉族人LMP2基因及基因频率分析及与其它地区人群的比较见表2。
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2.5 广东汉族人LMP7基因及基因频率分析及与其它地区人群的比较见表3。
表2 广东汉族人LMP2基因及基因频率分析及其它地区人群的比较
中国(广东)
中国(北京)
加拿大
美国
Genotype
N=99
N=45
N=163
N=192
, 百拇医药
Frequency
LMP2A/A
8
2
9
12
LMP2A/B
48
19
65
76
LMP2B/B
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43
24
89
104
Gene
N=198
N=90
N=326
N=384
frequency
LMP2*A
64(32.32)
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23(25.5)
83(25.4)
100(26.04)
LMP2*B
134(67.68)
67(74.5)
243(74.5)
284(73.95)
表3 广东汉族人LMP7基因及基因频率
分析及其它地区人群的比较
中国(广东)
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美国
Genotype
Frequency
LMP7A/A
22
41
LMP7A/B
53
83
LMP7B/B
28
62
, 百拇医药
Gene
N=206
N=396
Frequency
LMP7*A
97(41.74)
165(44.32)
LMP7*B
109(58.26)
207(55.67)
3 讨论
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HLA是人类第6号染色体上一组高度多态性的基因群，在免疫系统尤其是免疫识别及其遗传控制中起极重要作用，LMP基因是位于Ⅱ区的一个基因组[2]。它有2个基因位点LMP2及LMP7，它们是构成一种多功能蛋白酶的两个活性单位，可以将蛋白质水解成8～15个氨基酸的小肽。已有研究证明，这种蛋白酶参与MHC-Ⅰ类分子所呈递抗原的加工过程[5]，LMP2和LMP7的同种异型的变化可能导致蛋白酶水解特性的改变，而且LMP基因受IFN诱导后表达产物增加，蛋白酶酶解底物特异性因之发生变化[6]，因此检测LMP基因的多态性对某些疾病的发生、发展有重要意义。国外已有学者研究某些自身免疫性疾病与LMP基因存在相关[4]。
本研究进行了广东汉族人群与其他种族人群LMP的基因频率、基因型频率的比较。与白种人群的研究结果相比，广东汉族正常人群的LMP2*A、LMP7*B等位基因频率高于白种正常人群，LMP2*B、LMP7*A等位基因频率低于白种正常人群；广东汉族正常人群的LMP2基因频率与北京汉族正常人群的LMP基因频率[7]比较，广东汉族正常人群的LMP2*A等位基因频率高于北京正常人群，LMP2*B等位基因频率低于北京正常人群，说明中国汉族人LMP的分布南北有不同变化。
, 百拇医药
作者简介：黄庆晖，男，(1968，8-)，硕士，住院医师。研究方向：免疫与神经系统疾病
参考文献
[1]Van Endert PM,Lopez MT,Putel SD,et al.Genomic polymorphism,recombination and linkaqe disequilibrium in human major histocopactibility complex-en-coded anrigen-processing genes[J].Proc Natl A Sci USA,1992;89:11594～11597
[2]Kelly A,Powis SH,Glynne R,et al.Second proteasome related gene in the human MHC classⅡregion[J].Nature,1991;353:667～668
, http://www.100md.com
[3]Maksymowych WP,Suarez-Almuzor M,Choa CT,et al.Polymorphism in the LMP2 gene influences susceptibility to extraspinal disease in HLA-B27 positive individuals with ankylosing spondylitis[J].Ann Rheum Dis,1995;54(4):321～324
[4]Enn.YD,Muir A,Macluren NK,et al.Association of LMP2 and LMP7 genes with in the major histocompatibility complex with Insulin-dependent diabetes mellitus:population and family studies[J].Am J Hum Genet,1995;56(2):528～534
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[5]Rock KL.Gramm C,R othstein L,et al.Inhibiters of the proteasome block the degradation of cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class Ⅰ molecules[J].Cell, 1994;77(5):761～771
[6]Driscoll J,Brown MG,Finley D,et al.MHC-linked LMP gene products specially atler peptidase activities of the proteasome[J].Nature,1993;365:262～264
[7]丁海明，吕厚山，蒋东方等.低分子量多肽基因多态性与强直性脊柱炎表性的关系[J].中华医学遗传杂志，1999；16(4)：242～245
(收稿：2000-05-23), http://www.100md.com