染料木素对成骨肉瘤细胞株SaOS2增殖和分化功能的影响
作者：李万根 庄万江 张彤
单位：李万根(广州医学院第二附属医院内分泌科，广州 510260)；庄万江(广州医学院第二附属医院内分泌科，广州 510260)；张彤(广州医学院第一附属医院内分泌科，广州 510120)
关键词：染料木素；成骨细胞；增殖；分化
广州医学院学报000303
摘要 目的：染料木素是大豆中含量最丰富的异黄酮之一，被认为可以预防绝经后骨质疏松。本研究从骨的合成代谢的角度探讨染料木素影响骨代谢的机理。方法：用不同浓度的染料木素干预人成骨肉瘤细胞株SaOS2,观察对其增殖和分化功能的影响。用美蓝染色后测定细胞的吸光度的方法反映细胞增殖情况，用硷性磷酸酶活性反映细胞的分化程度。结果：低浓度10-10～10-8mol/L的染料木素有促进细胞增殖的作用(P<0.01或0.05)，但是在此浓度范围内染料木素抑制经蛋白校正的硷性磷酸酶的活性(P<0.01或0.05)，从整体上讲(不用蛋白校正)，染料木素对硷性磷酸酶的活性无影响(F=1.643,P>0.05)。结论：染料木素对骨的合成代谢无影响，其对骨质疏松的预防作用可能是通过其他的机制。
, 百拇医药
中图分类号 R738.1 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0007-03
Effects of Genistein on the Proliferation and
Differentiation of Osteoblast Cell Line SaOS2
Li Wangen,Zhuang Wanjiang,Zhang Tong
(Department of Internal Medicine,The Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510260)
Objective:To investigate the effects of genistein (GEN) on the proliferation and differentiation of osteoblast in vitro.Methods：Osteoblast Cells line SaOS2 wa s cultinated for 24 hours and followed by adding 10-10～10-6 M GEN. After another 24 hours cells were stained with Methyline blue and the absorbance representing cell numbers was measured.Alkaline phosphatase( ALP) activity was also measured to reflect the cell differentiation.Results:At the concentration of 10-10～10-8M, GEN significantly enhanced cell proliferation compared with the control(P<0.01 or P<0.05 ).However,within the same concentration,it remarkably decreased ALP activity corrected by protein.(P<0.01 or P<0.05 ).As a whole,GEN di d not affect the production of ALP in the culture system.Conclusion:GEN does no t affect anabolic metabolism of bones.
, 百拇医药
Key words Genistein;Osteoblast;Proliferation;Differentiation
绝经后骨质疏松是由于雌激素缺乏所致，但是并非所有的绝经后女性都罹患骨质疏松。东方妇女绝经后骨质疏松的发病率明显低于西方妇女，这被认为与前者喜食豆制品有关[1]。动物实验已经证明大豆蛋白成分可以预防绝经后骨质疏松的发生[2]，并推测与其中的异黄酮类物质有关[3]。为探讨其作用机理，我们观察了大豆中含量最丰富的异黄酮之一—染料木素(genistein,GEN)在体外对成骨细胞的增殖和分化功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
成骨肉瘤细胞株SaOS2,购自美国ATCC；无酚红MEM，染料木素和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；24孔和96孔细胞培养板为丹麦NUC公司产品。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 试剂的配制 染料木素用无水乙醇配成0.01mol/L的贮存液备用，存放于-20℃冰箱。
1.2.2 细胞增殖的测定 SaOS2细胞用含10%的MEM培养于5% CO2-95%空气、饱和湿度的37℃环境，MEM中加有5mmol/L的HEPES。将SaOS2细胞按每孔1×104接种于96孔培养板，10%FBS的MEM培养，12h后吸去培养液，换以含0.1%BSA的MEM，24h后加入新鲜含0.1%BSA的MEM。同时加入染料木素，最终浓度为10-10～10-6mol/L，每个浓度设6个平行孔。以无水乙醇作对照，最终浓度为0.1%。24h后，美蓝法测定细胞的增殖[4]，简述如下：倾去培养液，0.15mol/L NaCl洗3次，10%中性福尔马林固定60min，1%美蓝染色30min，0.01mol/L硼酸缓冲液洗3次，加入1∶1(V/V)的乙醇-0.01mol/L盐酸混合液，30min后在655nm处测吸光度值。
, http://www.100md.com
1.2.3 细胞分化功能的测定 将细胞按1×105孔接种于24孔培养板，每2天换液1次，6天后换以含0.1%BSA和MEM。24h后加入新鲜含0.1%BSA的MEM，同时加入染料木素，最终浓度为10-10～10-6mol/L，每个浓度设4个平行孔。以无水乙醇作对照，最终浓度为0.1%。48h后倾去培养液，刮下细胞，离心去上清后加入裂解液(0.1mol/L Tris-HCl,1mmol/L MgCl2,0,15mol/L NaCL,1% TritonX-100),超声粉碎1min，14000r/min低温离心10min，取上清测定ALP，ALP用细胞蛋白含量校正，细胞蛋白含量测定用考马斯亮蓝法，ALP测定用磷酸萘酚法。
1.3 统计
用SPSS软件进行单因素方差分析，两两比较用最小显著差法。
2 结果
, 百拇医药
与对照相比，较低(10-10～10-8mol/L)浓度的GEN 有显著促进细胞增殖的作用(P分别小于0.01、0.05和0.05)，但是在此浓度范围内抑制经蛋白校正的ALP的活性(P分别小于0.01、0.05和0.05)，而从整体上讲，GEN对ALP的活性(不用蛋白校正)无影响(F=1.643,P>0.05)。如表1。
表1 GEN对SaOS2细胞的增殖，单位蛋白ALP活性和总ALP活性的影响(
±s)
对照
10-10
10-9
10-8
, http://www.100md.com
10-7
10-6
例 数
4
4
4
4
4
4
吸光度
0.78±0.20
1.21±0.26*
, http://www.100md.com 1.04±0.07**
1.06±0.07**
0.84±0.05
0.74±0.08
校正ALPμ mol/min/mg protein
7.03±1.26
3.56±0.68*
5.33±0.92**
5.30±1.19**
6.08±0.54
, http://www.100md.com
6.52±1.09
未校正ALP
μ mol/min
4872.77±
978.99
3750.62±
229.19
5104.97±
1191.91
5040.88±
800.05
4645.65±
, 百拇医药
442.41
4378.18±
708.57
与对照相比，*P<0.01,**P<0.05
3 讨论
SaOS2细胞是公认的具有成骨细胞特征的的细胞株，用无酚红的MEM是因为酚红具有微弱的雌激素样活性[5]，用牛血清白蛋白代替胎牛血清可以排除胎牛血清中的雌激素对实验结果的干扰。
异黄酮主要存在于植物中，因为具有雌激素样作用而被称为植物雌激素，以大豆中含量最为丰富。GEN是雌激素活性最强的异黄酮之一，动物实验已经证明其可以预防去卵巢大鼠的骨量减少[3]，但是作用机理并不清楚。成骨细胞和破骨细胞表面有雌激素受体，而GEN可以与雌激素受体结合，其结合力为雌二醇的150分之一[6]，这为GEN影响骨代谢提供了结构基础。Blair发现GEN可以抑制体外培养的鸟破骨细胞的活性[7]；而动物实验发现，GEN可以使骨形成增加但是对骨吸收无影响[8]。这与雌激素的骨保护作用不同，后者目前认为主要是抑制骨吸收。Yamagchi在体外培养老龄大鼠的股骨干骺端组织，发现GEN可以促进ALP增加[9]，不过因为干骺端组织含有多种细胞，所以不能明确其究竟是直接作用于成骨细胞和/或破骨细胞。GEN对细胞的作用也可能是间接的，如它可以抑制去卵巢引起的肿瘤坏死因子的增高[8]。
, http://www.100md.com
与上述结果不尽相同，我们用单一成分的成骨细胞SaOS2观察发现，虽然GEN可以促进成骨细胞的增殖，但是却抑制其分化功能。从其对成骨细胞最终的成骨效果指标之一(ALP总量)来看，GEN对其并无影响。由此我们认为，GEN或者大豆蛋白预防绝经后骨质疏松的发生不是通过直接影响骨的合成代谢。而可能是通过其它的途径，例如抑制破骨细胞的活性等，具体的机制有待进一步的研究阐明。
作者简介：李万根,(1966-)男，博士，讲师
研究方向：骨质疏松
参考文献
[1]Report of a WHO study group.Assessment of fracture and its application to screening for postmenopausal osteoporosis[R].Geneva.switzerland.WHO technical report Series 843,1994:11～3
, http://www.100md.com
[2]Arjmandi BH,Birnbaum R,Goyal NV,et al.Bone-sparing effect of soy protein in ovarian hormone-deficient rats is related to its isoflavine content[J].Am J Clin Nutr, 1998;68(suppl):1364s～8s
[3]Anderson JJ,Ambrose WW,Garner SC,et al.Orally dosed Genistein from soy and prevention of cancellous bone lose in two ovariectomized rat models[J].J Nutr, 1995;125:199s
[4]Oliver MH,Harrison NK,Bishop JE,et al.A rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwell plates:application for assessment of growth factors[J].J Cell Sci, 1989;92:513～8
, http://www.100md.com
[5]Berthis Y,Katzenellenbogen JA,Katzenllenbogen BS.Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen:implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1986;83：2496～509
[6]Peterson DN,Tkalcevic GT,Koza-Taylor PH,et al.Identification of estrogen receptor beta 2,a functional variant of estrogen receptor beta expressed in normal rat tissues[J].Endocrinology, 1998;139(3):1082～92
, 百拇医药 [7]Blair HC,Jordan SE,Peterson TG,et al.Variable effects of tyrosine kinase inhibitors on avian osteoclastic activity and reduction of bone loss in ovariectomized rats[J].J Cell Biochem,1996;61(4):629～37
[8]Fanti P,Monier FMC,Geng Z,et al.The phytoestrogen genistein reduces bone loss in short-term ovariectomized rats[J].Osteoporosis Int,1998;8(3):274～81
[9]Yamachuchi M,Gao YH.Anabolic effect of genistein and genistin on bone metabolism in the femoral-metaphyseal tissues of elderly rats:the genistein effect is enhanced by zinc[J].Mol Cell Biochem,1998;178(1～2)：377～82
(收稿：2000-01-17), http://www.100md.com
单位：李万根(广州医学院第二附属医院内分泌科，广州 510260)；庄万江(广州医学院第二附属医院内分泌科，广州 510260)；张彤(广州医学院第一附属医院内分泌科，广州 510120)
关键词：染料木素；成骨细胞；增殖；分化
广州医学院学报000303
摘要 目的：染料木素是大豆中含量最丰富的异黄酮之一，被认为可以预防绝经后骨质疏松。本研究从骨的合成代谢的角度探讨染料木素影响骨代谢的机理。方法：用不同浓度的染料木素干预人成骨肉瘤细胞株SaOS2,观察对其增殖和分化功能的影响。用美蓝染色后测定细胞的吸光度的方法反映细胞增殖情况，用硷性磷酸酶活性反映细胞的分化程度。结果：低浓度10-10～10-8mol/L的染料木素有促进细胞增殖的作用(P<0.01或0.05)，但是在此浓度范围内染料木素抑制经蛋白校正的硷性磷酸酶的活性(P<0.01或0.05)，从整体上讲(不用蛋白校正)，染料木素对硷性磷酸酶的活性无影响(F=1.643,P>0.05)。结论：染料木素对骨的合成代谢无影响，其对骨质疏松的预防作用可能是通过其他的机制。
, 百拇医药
中图分类号 R738.1 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0007-03
Effects of Genistein on the Proliferation and
Differentiation of Osteoblast Cell Line SaOS2
Li Wangen,Zhuang Wanjiang,Zhang Tong
(Department of Internal Medicine,The Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510260)
Objective:To investigate the effects of genistein (GEN) on the proliferation and differentiation of osteoblast in vitro.Methods：Osteoblast Cells line SaOS2 wa s cultinated for 24 hours and followed by adding 10-10～10-6 M GEN. After another 24 hours cells were stained with Methyline blue and the absorbance representing cell numbers was measured.Alkaline phosphatase( ALP) activity was also measured to reflect the cell differentiation.Results:At the concentration of 10-10～10-8M, GEN significantly enhanced cell proliferation compared with the control(P<0.01 or P<0.05 ).However,within the same concentration,it remarkably decreased ALP activity corrected by protein.(P<0.01 or P<0.05 ).As a whole,GEN di d not affect the production of ALP in the culture system.Conclusion:GEN does no t affect anabolic metabolism of bones.
, 百拇医药
Key words Genistein;Osteoblast;Proliferation;Differentiation
绝经后骨质疏松是由于雌激素缺乏所致，但是并非所有的绝经后女性都罹患骨质疏松。东方妇女绝经后骨质疏松的发病率明显低于西方妇女，这被认为与前者喜食豆制品有关[1]。动物实验已经证明大豆蛋白成分可以预防绝经后骨质疏松的发生[2]，并推测与其中的异黄酮类物质有关[3]。为探讨其作用机理，我们观察了大豆中含量最丰富的异黄酮之一—染料木素(genistein,GEN)在体外对成骨细胞的增殖和分化功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
成骨肉瘤细胞株SaOS2,购自美国ATCC；无酚红MEM，染料木素和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；24孔和96孔细胞培养板为丹麦NUC公司产品。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 试剂的配制 染料木素用无水乙醇配成0.01mol/L的贮存液备用，存放于-20℃冰箱。
1.2.2 细胞增殖的测定 SaOS2细胞用含10%的MEM培养于5% CO2-95%空气、饱和湿度的37℃环境，MEM中加有5mmol/L的HEPES。将SaOS2细胞按每孔1×104接种于96孔培养板，10%FBS的MEM培养，12h后吸去培养液，换以含0.1%BSA的MEM，24h后加入新鲜含0.1%BSA的MEM。同时加入染料木素，最终浓度为10-10～10-6mol/L，每个浓度设6个平行孔。以无水乙醇作对照，最终浓度为0.1%。24h后，美蓝法测定细胞的增殖[4]，简述如下：倾去培养液，0.15mol/L NaCl洗3次，10%中性福尔马林固定60min，1%美蓝染色30min，0.01mol/L硼酸缓冲液洗3次，加入1∶1(V/V)的乙醇-0.01mol/L盐酸混合液，30min后在655nm处测吸光度值。
, http://www.100md.com
1.2.3 细胞分化功能的测定 将细胞按1×105孔接种于24孔培养板，每2天换液1次，6天后换以含0.1%BSA和MEM。24h后加入新鲜含0.1%BSA的MEM，同时加入染料木素，最终浓度为10-10～10-6mol/L，每个浓度设4个平行孔。以无水乙醇作对照，最终浓度为0.1%。48h后倾去培养液，刮下细胞，离心去上清后加入裂解液(0.1mol/L Tris-HCl,1mmol/L MgCl2,0,15mol/L NaCL,1% TritonX-100),超声粉碎1min，14000r/min低温离心10min，取上清测定ALP，ALP用细胞蛋白含量校正，细胞蛋白含量测定用考马斯亮蓝法，ALP测定用磷酸萘酚法。
1.3 统计
用SPSS软件进行单因素方差分析，两两比较用最小显著差法。
2 结果
, 百拇医药
与对照相比，较低(10-10～10-8mol/L)浓度的GEN 有显著促进细胞增殖的作用(P分别小于0.01、0.05和0.05)，但是在此浓度范围内抑制经蛋白校正的ALP的活性(P分别小于0.01、0.05和0.05)，而从整体上讲，GEN对ALP的活性(不用蛋白校正)无影响(F=1.643,P>0.05)。如表1。
表1 GEN对SaOS2细胞的增殖，单位蛋白ALP活性和总ALP活性的影响(
±s)对照
10-10
10-9
10-8
, http://www.100md.com
10-7
10-6
例 数
4
4
4
4
4
4
吸光度
0.78±0.20
1.21±0.26*
, http://www.100md.com 1.04±0.07**
1.06±0.07**
0.84±0.05
0.74±0.08
校正ALPμ mol/min/mg protein
7.03±1.26
3.56±0.68*
5.33±0.92**
5.30±1.19**
6.08±0.54
, http://www.100md.com
6.52±1.09
未校正ALP
μ mol/min
4872.77±
978.99
3750.62±
229.19
5104.97±
1191.91
5040.88±
800.05
4645.65±
, 百拇医药
442.41
4378.18±
708.57
与对照相比，*P<0.01,**P<0.05
3 讨论
SaOS2细胞是公认的具有成骨细胞特征的的细胞株，用无酚红的MEM是因为酚红具有微弱的雌激素样活性[5]，用牛血清白蛋白代替胎牛血清可以排除胎牛血清中的雌激素对实验结果的干扰。
异黄酮主要存在于植物中，因为具有雌激素样作用而被称为植物雌激素，以大豆中含量最为丰富。GEN是雌激素活性最强的异黄酮之一，动物实验已经证明其可以预防去卵巢大鼠的骨量减少[3]，但是作用机理并不清楚。成骨细胞和破骨细胞表面有雌激素受体，而GEN可以与雌激素受体结合，其结合力为雌二醇的150分之一[6]，这为GEN影响骨代谢提供了结构基础。Blair发现GEN可以抑制体外培养的鸟破骨细胞的活性[7]；而动物实验发现，GEN可以使骨形成增加但是对骨吸收无影响[8]。这与雌激素的骨保护作用不同，后者目前认为主要是抑制骨吸收。Yamagchi在体外培养老龄大鼠的股骨干骺端组织，发现GEN可以促进ALP增加[9]，不过因为干骺端组织含有多种细胞，所以不能明确其究竟是直接作用于成骨细胞和/或破骨细胞。GEN对细胞的作用也可能是间接的，如它可以抑制去卵巢引起的肿瘤坏死因子的增高[8]。
, http://www.100md.com
与上述结果不尽相同，我们用单一成分的成骨细胞SaOS2观察发现，虽然GEN可以促进成骨细胞的增殖，但是却抑制其分化功能。从其对成骨细胞最终的成骨效果指标之一(ALP总量)来看，GEN对其并无影响。由此我们认为，GEN或者大豆蛋白预防绝经后骨质疏松的发生不是通过直接影响骨的合成代谢。而可能是通过其它的途径，例如抑制破骨细胞的活性等，具体的机制有待进一步的研究阐明。
作者简介：李万根,(1966-)男，博士，讲师
研究方向：骨质疏松
参考文献
[1]Report of a WHO study group.Assessment of fracture and its application to screening for postmenopausal osteoporosis[R].Geneva.switzerland.WHO technical report Series 843,1994:11～3
, http://www.100md.com
[2]Arjmandi BH,Birnbaum R,Goyal NV,et al.Bone-sparing effect of soy protein in ovarian hormone-deficient rats is related to its isoflavine content[J].Am J Clin Nutr, 1998;68(suppl):1364s～8s
[3]Anderson JJ,Ambrose WW,Garner SC,et al.Orally dosed Genistein from soy and prevention of cancellous bone lose in two ovariectomized rat models[J].J Nutr, 1995;125:199s
[4]Oliver MH,Harrison NK,Bishop JE,et al.A rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwell plates:application for assessment of growth factors[J].J Cell Sci, 1989;92:513～8
, http://www.100md.com
[5]Berthis Y,Katzenellenbogen JA,Katzenllenbogen BS.Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen:implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1986;83：2496～509
[6]Peterson DN,Tkalcevic GT,Koza-Taylor PH,et al.Identification of estrogen receptor beta 2,a functional variant of estrogen receptor beta expressed in normal rat tissues[J].Endocrinology, 1998;139(3):1082～92
, 百拇医药 [7]Blair HC,Jordan SE,Peterson TG,et al.Variable effects of tyrosine kinase inhibitors on avian osteoclastic activity and reduction of bone loss in ovariectomized rats[J].J Cell Biochem,1996;61(4):629～37
[8]Fanti P,Monier FMC,Geng Z,et al.The phytoestrogen genistein reduces bone loss in short-term ovariectomized rats[J].Osteoporosis Int,1998;8(3):274～81
[9]Yamachuchi M,Gao YH.Anabolic effect of genistein and genistin on bone metabolism in the femoral-metaphyseal tissues of elderly rats:the genistein effect is enhanced by zinc[J].Mol Cell Biochem,1998;178(1～2)：377～82
(收稿：2000-01-17), http://www.100md.com