EBV-LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定
作者：谭学方 汤郡 张雪雁
单位：谭学方(广州医学院肿瘤研究所分子免疫学研究室，广州 510182)；汤郡(广州医学院肿瘤研究所分子免疫学研究室，广州 510182)；张雪雁(广州医学院肿瘤研究所分子免疫学研究室，广州 510182)
关键词：LMP1；反义基因；表达载体
广州医学院学报000302 摘要 目的：构建EB病毒LMP1反义基因的真核表达载体。方法：通过PCR方法，扩增EBV-LMP1基因的第一外显子片段，使之反向克隆到质粒pcDNA3.1的多克隆位点中。经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和PCR产物的凝胶电泳显示400bp左右的目的基因片段，测序结果显示与已知LMP1基因序列一致。结论：成功构建了LMP1反义基因的真核表达载体。
中图分类号Q786 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0004-03
, 百拇医药
Construction of Recombinant Vector Expressing
Antisense DNA of EB Virus-LMP1
Tan Xuefang,Tang Jun,Zhang Xueyan
(Cancer Research Instiute,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182)
Objective:To construct a EBV-LMP1 antisense gene expressing vector for gene the rapy of NPC. Method:Fragments of the first exon of the LMP1 gene were am plified by PCR and inserted in revers e order into plasmid pcDNA3.1. Result:the intended gene fragment was about 400 b ase pairs as expected shown by electrophoresis of enzyme digested recombinant v e ctor and PCR products with recombinant vector as template. The sequencing result of antisense DNA fragment was in accordance with the known LMP1 gene. Conclusion: A recombinant vector expressing antisen se DNA of EB virus-LMP1 was successfully constructed.
, 百拇医药
Key words Antisense DNA,EB virus-LMP1,Recombinant expressing vector
EB病毒感染与传染性单核细胞增多病、Burkitt淋巴瘤及鼻咽癌等肿瘤的发生密切相关。对EB病毒转化活性的研究表明，EB病毒的LMP1基因是EB病毒永生化基因中唯一能够转化体外培养的人和啮齿类动物细胞使之具有致瘤性的基因[1，2]。通过阻断LMP1基因的表达，有可能阻止鼻咽癌的发生和发展。本研究构建了LMP1反义基因的真核表达载体并进行了序列测定，为进一步的反义治疗研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌种与细胞 pcDNA3.1(由美国GeneBridge生物技术实验室钟平宇博士惠赠；大肠杆菌JM109(本室冻存菌种)；B95-8(广州医学院微生物教研室)
, http://www.100md.com
1.2 酶及主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、Taq酶、T4 DNA连接酶、RNase A、琼脂(B.M.，宝灵曼)；低熔点琼脂糖(FMC)；dNTP、PCR markers、普通琼脂糖、10mg/ml EB(华美生物公司)；胰蛋白胨和酵母提取物(Oxiod);Tris碱(Merk)；其它试剂(均为国产分析纯)。
1.3 引物设计 根据EB病毒LMP1基因第一外显子序列设计上下游引物，在上游引物(5'GCCGAATTCTTTCCTCAACTGCCTTGCTCC3')中引入EcoR Ⅰ位点，下游引物(5'GCAGGATCCAGAGAGCGATGAGCAGGAGGGT3')中引入BamH Ⅰ位点。
1.4 PCR扩增LMP1第一外显子序列 提取B95-8细胞DNA作为模板；建立50μl反应体系：引物(25μmol/L)各1μl，DNA模板2μl，10×buffer 5μl，dNTP(10mM/种)2μl，DDH2O补足体积后混匀。95℃预变性5min后加入Taq酶(5u/μl)0.5μl，扩增30个循环(94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸40s)；然后72℃延伸5min。取5μl PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，观察扩增效果。
, 百拇医药
1.5 LMP1反义基因表达载体的构建 以限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分别对PCR产物和质粒pcDNA3.1进行酶切，经低熔点琼脂糖电泳、琼脂酶消化回收酶切片段；以T4 DNA 连接酶16℃连接过夜；将连接混合物转化感受态大肠杆菌JM109，于37℃含氨苄青霉素的LB平板中倒置培养过夜；同时以未经质粒转化的感受态细菌涂布LB平板培养，作为对照[3]。
1.6 LMP1反义基因表达载体的限制性酶切鉴定及序列测定 筛选数个阳性菌落，微量快速法提取质粒DNA，进行限制性酶切和PCR扩增。委托赛百盛公司对重组载体进行序列测定。
2 结果
2.1 目的基因的扩增 用针对LMP1基因第一外显子序列的一对引物对B95-8细胞DNA进行扩增；扩增产物经凝胶电泳显示为400bp左右的特异性条带，与目的基因的426bp基本相符(图1)。
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2.2 反义基因表达载体构建和鉴定 构建的反义基因表达载体经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，或作为模板进行PCR扩增，均可获得与目的基因一致的清晰条带(图2)。测序结果显示，重组基因的序列与已知LMP1第一外显子序列反向相符(图3，见封三)。
图1 PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳
1:PCR products;2:PCR markers
图2 重组表达载体pcDNA3.1-Antisense LMP1的限制性酶切及PCR扩增鉴定
1.空载体；2.重组载体；3.BamHⅠ和EcoRⅠ
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双酶切；4.PCR产物；5.PCR markers
3 讨论
鼻咽癌(NPC)是我国南方和东南亚地区常见的亚性肿瘤。EB病毒感染与NPC的发生密切相关。血清流行病学研究表明，NPC患者血清中存在的多种EBV特异性抗体水平远高于健康人和其他肿瘤患者。核酸分子杂交及多聚酶链式反应等检测均表明，各种不同类型的NPC组织中都存在EBV基因。在NPC组织中存在有EBV某些基因的表达产物如EBV核抗原(EBNA1)、潜伏膜蛋白1(LMP1)、LMP2等。
对EBV DNA 转化活性的研究表明，LMP1基因可使体外培养的小鼠成纤维细胞发生转化，使细胞获得在裸鼠体内形成肿瘤的能力，即具有致瘤性[1]。LMP1能诱导多种组织细胞中bcl-2基因的过度表达，后者能阻止细胞凋亡并造成细胞的恶性转化。LMP1在NPC的发生中参与鼻咽上皮细胞的转化[4]；来自NPC活检组织的LMP1基因致瘤能力强；它不仅存在于NPC细胞胞核中，而且可整合于细胞染色体上[5]。这都提示EVB LMP1基因在NPC的发生、发展中起着非常重要的作用。我们认为，通过阻断LMP1基因的表达，就有可能阻止EBV密切相关的NPC的发生和发展，逆转NPC细胞的恶性表型，达到基因治疗的目的。据此，我们设计了针对鼻咽癌细胞中LMP1基因的反义治疗研究策略：构建EBV LMP1基因反义表达载体，导入NPC细胞中表达与LMP1 mRNA互补的反义RNA，通过互补结合阻断LMP1基因的表达。
, 百拇医药
我们通过PCR扩增出了LMP1基因第一外显子序列，借助BamHⅠ和EcoRⅠ两个限制性酶切位点，将PCR产物克隆到真核表达载体pCDNA3.1的多克隆位点中。由于上游引物带有EcoRⅠ，下游引物带有BamHⅠ位点，使得扩增序列的5’端为EcoRⅠ位点，3’端为BamHⅠ位点；而在真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点中，BamHⅠ位点于EcoRⅠ位点的上游；这样在T4 DNA连接酶作用下，扩增序列就反向插入到相同酶切的载体中，形成T7启动子控制下的重组LMP1反义基因。通过限制性酶切鉴定、PCR扩增以及序列测定，证实了重组LMP1反义基因的真核表达载体构建成功，为后续实验奠定了基础。
图3 重组LMP1反义基因测序结果
基金项目：广州市重点科技攻关项目(JB02-97-5-10-01)
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作者简介：谭学方(1971-)，女，硕士。研究方向：肿瘤分子免疫学。
参考文献
[1]Wang D,Lebowitz D,Kieff E. An EBV membrane protein expressed in immortalized lymphocytes transsorms established rodent cells[J]. Cell,1985;43:831～840
[2]Mosialos G,Birkenbach M,Yalamanchili R,et al.The Epstein-Bar virus transforming protein LMP1 engages signaling for the tumor necrosis factor receptor family [J]. Cell,1995;80(3):389～399
, http://www.100md.com
[3]金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南(第二版)[M].科学出版社，1992:16～55
[4]陈宜芳，郭辉玉，汪慧民等.鼻咽癌细胞系SUNE中EBV-LPM1基因对永生化人上皮细胞生长物性的影响[J].中华肿瘤学杂志，1998；20(5)：330～332
[5]Hu LF,Chen F,Zheng X,et al. Clonability and tumorigenicity of human epithelial calls expressing the EBV encoded membrane protein LMP1[J]. Oncogene,1993;8:1575～1583
(收稿：2000-06-05), 百拇医药
单位：谭学方(广州医学院肿瘤研究所分子免疫学研究室，广州 510182)；汤郡(广州医学院肿瘤研究所分子免疫学研究室，广州 510182)；张雪雁(广州医学院肿瘤研究所分子免疫学研究室，广州 510182)
关键词：LMP1；反义基因；表达载体
广州医学院学报000302 摘要 目的：构建EB病毒LMP1反义基因的真核表达载体。方法：通过PCR方法，扩增EBV-LMP1基因的第一外显子片段，使之反向克隆到质粒pcDNA3.1的多克隆位点中。经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和PCR产物的凝胶电泳显示400bp左右的目的基因片段，测序结果显示与已知LMP1基因序列一致。结论：成功构建了LMP1反义基因的真核表达载体。
中图分类号Q786 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0004-03
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Construction of Recombinant Vector Expressing
Antisense DNA of EB Virus-LMP1
Tan Xuefang,Tang Jun,Zhang Xueyan
(Cancer Research Instiute,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182)
Objective:To construct a EBV-LMP1 antisense gene expressing vector for gene the rapy of NPC. Method:Fragments of the first exon of the LMP1 gene were am plified by PCR and inserted in revers e order into plasmid pcDNA3.1. Result:the intended gene fragment was about 400 b ase pairs as expected shown by electrophoresis of enzyme digested recombinant v e ctor and PCR products with recombinant vector as template. The sequencing result of antisense DNA fragment was in accordance with the known LMP1 gene. Conclusion: A recombinant vector expressing antisen se DNA of EB virus-LMP1 was successfully constructed.
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Key words Antisense DNA,EB virus-LMP1,Recombinant expressing vector
EB病毒感染与传染性单核细胞增多病、Burkitt淋巴瘤及鼻咽癌等肿瘤的发生密切相关。对EB病毒转化活性的研究表明，EB病毒的LMP1基因是EB病毒永生化基因中唯一能够转化体外培养的人和啮齿类动物细胞使之具有致瘤性的基因[1，2]。通过阻断LMP1基因的表达，有可能阻止鼻咽癌的发生和发展。本研究构建了LMP1反义基因的真核表达载体并进行了序列测定，为进一步的反义治疗研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌种与细胞 pcDNA3.1(由美国GeneBridge生物技术实验室钟平宇博士惠赠；大肠杆菌JM109(本室冻存菌种)；B95-8(广州医学院微生物教研室)
, http://www.100md.com
1.2 酶及主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、Taq酶、T4 DNA连接酶、RNase A、琼脂(B.M.，宝灵曼)；低熔点琼脂糖(FMC)；dNTP、PCR markers、普通琼脂糖、10mg/ml EB(华美生物公司)；胰蛋白胨和酵母提取物(Oxiod);Tris碱(Merk)；其它试剂(均为国产分析纯)。
1.3 引物设计 根据EB病毒LMP1基因第一外显子序列设计上下游引物，在上游引物(5'GCCGAATTCTTTCCTCAACTGCCTTGCTCC3')中引入EcoR Ⅰ位点，下游引物(5'GCAGGATCCAGAGAGCGATGAGCAGGAGGGT3')中引入BamH Ⅰ位点。
1.4 PCR扩增LMP1第一外显子序列 提取B95-8细胞DNA作为模板；建立50μl反应体系：引物(25μmol/L)各1μl，DNA模板2μl，10×buffer 5μl，dNTP(10mM/种)2μl，DDH2O补足体积后混匀。95℃预变性5min后加入Taq酶(5u/μl)0.5μl，扩增30个循环(94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸40s)；然后72℃延伸5min。取5μl PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，观察扩增效果。
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1.5 LMP1反义基因表达载体的构建 以限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分别对PCR产物和质粒pcDNA3.1进行酶切，经低熔点琼脂糖电泳、琼脂酶消化回收酶切片段；以T4 DNA 连接酶16℃连接过夜；将连接混合物转化感受态大肠杆菌JM109，于37℃含氨苄青霉素的LB平板中倒置培养过夜；同时以未经质粒转化的感受态细菌涂布LB平板培养，作为对照[3]。
1.6 LMP1反义基因表达载体的限制性酶切鉴定及序列测定 筛选数个阳性菌落，微量快速法提取质粒DNA，进行限制性酶切和PCR扩增。委托赛百盛公司对重组载体进行序列测定。
2 结果
2.1 目的基因的扩增 用针对LMP1基因第一外显子序列的一对引物对B95-8细胞DNA进行扩增；扩增产物经凝胶电泳显示为400bp左右的特异性条带，与目的基因的426bp基本相符(图1)。
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2.2 反义基因表达载体构建和鉴定 构建的反义基因表达载体经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，或作为模板进行PCR扩增，均可获得与目的基因一致的清晰条带(图2)。测序结果显示，重组基因的序列与已知LMP1第一外显子序列反向相符(图3，见封三)。
图1 PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳
1:PCR products;2:PCR markers
图2 重组表达载体pcDNA3.1-Antisense LMP1的限制性酶切及PCR扩增鉴定
1.空载体；2.重组载体；3.BamHⅠ和EcoRⅠ
, http://www.100md.com
双酶切；4.PCR产物；5.PCR markers
3 讨论
鼻咽癌(NPC)是我国南方和东南亚地区常见的亚性肿瘤。EB病毒感染与NPC的发生密切相关。血清流行病学研究表明，NPC患者血清中存在的多种EBV特异性抗体水平远高于健康人和其他肿瘤患者。核酸分子杂交及多聚酶链式反应等检测均表明，各种不同类型的NPC组织中都存在EBV基因。在NPC组织中存在有EBV某些基因的表达产物如EBV核抗原(EBNA1)、潜伏膜蛋白1(LMP1)、LMP2等。
对EBV DNA 转化活性的研究表明，LMP1基因可使体外培养的小鼠成纤维细胞发生转化，使细胞获得在裸鼠体内形成肿瘤的能力，即具有致瘤性[1]。LMP1能诱导多种组织细胞中bcl-2基因的过度表达，后者能阻止细胞凋亡并造成细胞的恶性转化。LMP1在NPC的发生中参与鼻咽上皮细胞的转化[4]；来自NPC活检组织的LMP1基因致瘤能力强；它不仅存在于NPC细胞胞核中，而且可整合于细胞染色体上[5]。这都提示EVB LMP1基因在NPC的发生、发展中起着非常重要的作用。我们认为，通过阻断LMP1基因的表达，就有可能阻止EBV密切相关的NPC的发生和发展，逆转NPC细胞的恶性表型，达到基因治疗的目的。据此，我们设计了针对鼻咽癌细胞中LMP1基因的反义治疗研究策略：构建EBV LMP1基因反义表达载体，导入NPC细胞中表达与LMP1 mRNA互补的反义RNA，通过互补结合阻断LMP1基因的表达。
, 百拇医药
我们通过PCR扩增出了LMP1基因第一外显子序列，借助BamHⅠ和EcoRⅠ两个限制性酶切位点，将PCR产物克隆到真核表达载体pCDNA3.1的多克隆位点中。由于上游引物带有EcoRⅠ，下游引物带有BamHⅠ位点，使得扩增序列的5’端为EcoRⅠ位点，3’端为BamHⅠ位点；而在真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点中，BamHⅠ位点于EcoRⅠ位点的上游；这样在T4 DNA连接酶作用下，扩增序列就反向插入到相同酶切的载体中，形成T7启动子控制下的重组LMP1反义基因。通过限制性酶切鉴定、PCR扩增以及序列测定，证实了重组LMP1反义基因的真核表达载体构建成功，为后续实验奠定了基础。
图3 重组LMP1反义基因测序结果
基金项目：广州市重点科技攻关项目(JB02-97-5-10-01)
, 百拇医药
作者简介：谭学方(1971-)，女，硕士。研究方向：肿瘤分子免疫学。
参考文献
[1]Wang D,Lebowitz D,Kieff E. An EBV membrane protein expressed in immortalized lymphocytes transsorms established rodent cells[J]. Cell,1985;43:831～840
[2]Mosialos G,Birkenbach M,Yalamanchili R,et al.The Epstein-Bar virus transforming protein LMP1 engages signaling for the tumor necrosis factor receptor family [J]. Cell,1995;80(3):389～399
, http://www.100md.com
[3]金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南(第二版)[M].科学出版社，1992:16～55
[4]陈宜芳，郭辉玉，汪慧民等.鼻咽癌细胞系SUNE中EBV-LPM1基因对永生化人上皮细胞生长物性的影响[J].中华肿瘤学杂志，1998；20(5)：330～332
[5]Hu LF,Chen F,Zheng X,et al. Clonability and tumorigenicity of human epithelial calls expressing the EBV encoded membrane protein LMP1[J]. Oncogene,1993;8:1575～1583
(收稿：2000-06-05), 百拇医药