阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义核酸在K562细胞的摄入和胞内分布的影响
作者：王志东 卓光生 陈志哲 胡建达
单位：福建医科大学 附属协和医院、福建省血液病研究所,福州 350001
关键词：阳离子；脂质体；寡核苷酸类；反义；白血病；幼红细胞；急性；基因表达
福建医科大学学报000301
摘要: 目的 探讨阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义寡核苷酸(反义核酸)细胞摄入和胞内分布的影响。 方法 采用阳离子脂质体介导WT1反义核酸转染K562细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布,RT-PCR检测处理前后WT1 mRNA表达水平。 结果 (1)脂质体提高K562细胞对反义核酸的摄入,细胞摄入率达70.9%,平均荧光强度提高6倍以上;脂质体介导转染反义核酸时其细胞浆中类核内体或溶酶体中的点状结构较非脂质体处理时大,胞核内有明显的荧光物质分布;(2)脂质体介导WT1反义核酸可下调WT1 mRNA水平。 结论 阳离子脂质体可提高反义核酸的细胞摄入并改变其胞内分布,这可能是它增强反义核酸生物活性的机制。
, 百拇医药
中图分类号: R733.7; Q786; R977.6 文献标识码: A
文章编号:1000-2235(2000)03-0209-03
Effects of Cationic Liposome LipofectinTM on the Intracellular Uptake
and Distribution of WT1 Antisense Oligodeoxynucleotides in K562 Cells
WANG Zhi-dong ZHUO Guang-sheng CHEN Zhi-zhe
(Fujian Insititue of Hematology, The Affiliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhuo 350001, China)
, 百拇医药
ABSTRACT: Objective To study the effects of cationic liposome on the uptake and intracellular distribution of antisense oligodeoxynucleotide(PSODN). Methods The uptake and intracellular localization of FAM-labelled PSODN(F-PSODN) mediated by cationic liposome Lipofectin was detected by flow cytometry(FCM) and fluorescence microscope. The expression of WT1 mRNA was measured by RT-PCR. Results (1)Cationic liposomes enhanced K562 cells taking F-PSODN by 70.9%,and mean fluorescence intensity was increased six times than the controls. K562 cells transfection mediated by cationic liposome showed larger punctuate structures in cytosol and more intensive PSODN nuclear accumulation. (2)The expression of WT1 mRNA was decreased in K562 cells transfected with ASODN and cationic liposome after 72 hours. Conclusion Cationic liposomes increased PSODN activities by enhancing the uptake of ODN and altering intracellular distribution of the ODN.
, 百拇医药
KEY WORDS: cationic; liposome; oligodeoxynucleotide,antisense; leukemia,erythroblastic,acute; gene expression
阳离子脂质体由于其转染的安全性、高效性和通用性而在基因治疗中得到广泛应用。笔者于1998年6月～1999年1月采用阳离子脂质体LipofectinTM介导(WT1)反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(简称反义核酸)转染K562细胞,观察脂质体对反义核酸细胞摄入和胞内分布的影响,探讨脂质体提高反义核酸生物活性的可能机制。
1 材料与方法
1.1 细胞及培养体系 K562细胞培养在含15%小牛血清的RPMI 1640完全培养基(GIBCO/BRL,USA)中,取对数生长期的细胞待用。
1.2 寡核苷酸的合成、纯化及标记 WT1反义核酸(PSODN)互补于WT1 mRNA翻译起始区的-6～+12,序列为5'-GTC GGA GCC CAT TTG CTG-3',正义核酸(SODN)作为对照,序列为5'-CAG CAA ATG GGC TCC GAC-3',均硫代修饰,由福建省血液病研究所合成、纯化。其中部分反义核酸5'端FAM荧光素标记,由上海生工生物公司完成,标记效率采用紫外分光光度法分析,OD260/OD496=2～6表明标记完全。
, http://www.100md.com
1.3 寡核苷酸的转染 取100 μmol/L寡核苷酸溶液7.5 μl加入不含血清及抗生素的RPMI 1640 92.5 μl中,为A液;取阳离子脂质体LipofectinTM(DOTMA与DOPE 1∶1[W/W]的混合物)10 μl(GIBCO/BRL Inc.USA)同样溶于RPMI 1640 90 μl中,为B液。A、B液分置室温30 min后,轻柔混匀,再置室温15 min,转染对数生长期的细胞,6 h后加入小牛血清。
1.4 荧光素标记的PSODN 的细胞摄入和胞内分布
1.4.1 PSODN的细胞摄入 采用流式细胞仪(Coulter,EPICS)检测。取处理6 h后的上述各组细胞4×105个,PBS冲洗5次后荧光显微镜下观察无游离荧光,上机检测反义核酸的细胞摄入率及胞内平均荧光强度。
1.4.2 PSODN的胞内分布 取处理后的细胞,经PBS洗涤5次后细胞直接涂片,室温晾干,荧光显微镜(Olympus,日本)观察胞内荧光物质的分布并拍照。
, 百拇医药
1.5 RT-PCR检测 K562细胞WT1 mRNA的表达
1.5.1 总RNA提取及cDNA的合成按说明书进行(RNA提取液为Life technologies 产品,反转录试剂为Promega产品)。
1.5.2 引物(由上海生工公司合成)序列
WT1:S 5'-ATG TGC GAC GTG TGC CCT GC-3',AS 5'-GCT GCC TGG GAC ACT GAA CGG-3',扩增长度484 bp。
β-actin:S 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3',AS 5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3',扩增长度540 bp。
1.5.3 PCR反应体系 cDNA 1.5 μl,10×buffer 2.5 μl,25 mmol/L MgCl2 1.5 μl,10 mmol/L dNTPmix 0.5 μl,引物各为12.5 pmol,Taq DNA聚合酶1 μl,加无菌去离子水至25 μl,试剂均为Promega产品。
, 百拇医药
1.5.4 扩增参数 WT1:94℃变性30 s,61℃退火50 s,72℃延伸70 s,共35个循环。β-actin: 94℃变性30 s,56℃退火50 s,72℃延伸60 s,共35个循环。PCR扩增仪为PE9600型(PE公司,USA)。
1.5.5 PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶(含0.5%EB)后紫外灯下观察并拍照。
2 结 果
2.1 PSODN的细胞摄入 反义核酸直接作用于K562细胞后,反义核酸的细胞摄入率为8.0%,细胞内平均荧光强度为1.10,而经脂质体介导转染后,细胞摄入率和胞内平均荧光强度分别为78.9%和7.10,另外空白对照组分别为1.2%和1.06,脂质体组分别为1.6%和1.15。
2.2 PSODN的胞内分布 反义核酸直接作用于细胞6 h后,细胞胞浆中见少量细小的点状结构,胞核无明显荧光分布,而经脂质体处理后,细胞胞浆中点状结构多且体积较大,胞核内可见较强荧光分布(图1);处理24 h后,未经脂质体介导时胞核仍无明显荧光分布,脂质体介导时细胞内荧光强度更强,有的细胞呈均匀强荧光分布(图2)。可见脂质体提高了反义核酸摄入并改变其胞内分布。
, 百拇医药
2.3 RT-PCR电泳结果 脂质体介导反义核酸组RT-PCR产物电泳带亮度明显减弱,表明K562细胞WT1 mRNA水平下调(图3)。
图3 K562细胞β-actin、WT1 mRNA RT-PCR电泳结果
M(PCR Marker):1543, 994, 695, 515, 377, 237 bp
1.阴性对照组; 2.空白对照组; 3.反义组; 4.正义组; 5.脂质体组; 6.脂质体+正义组; 7.脂质体+反义组
A.总RNA电泳结果 B.β-actin mRNA RT-PCR电泳结果 C.WT1 mRNA RT-PCR电泳结果
3 讨 论
, 百拇医药
反义核酸可以直接穿过细胞膜或通过内吞泡摄取进入细胞,但这种方式的效率通常是有限的。脂质体介导的转染技术由于具有安全性、高效性和通用性而得到广泛应用。LipofectinTM是1986年开发上市的阳离子脂质体,它由单阳离子脂质体DOTMA和中性脂DOPE等质量组成,经证明可介导转染核酸物质进入多种细胞,现在已得到了较广泛的应用,但是它要求在无血清的条件下转染,因此限制了在体内的应用。
阳离子脂质体介导的转染是通过反义核酸和阳离子脂质体之间离子的相互作用,形成核酸脂质体复合物再被细胞捕获而发挥反义核酸的药理作用的。这种复合物的形成与核酸/脂质体电荷比有密切关系。Shoji等利用琼脂糖电泳法发现,脂质体与ODN电荷比值在5～100时可形成复合物,但奇怪的是比值在200时并无复合物形成[1]。Monia等认为,Lipofectin介导ODN转染的最佳+/-电荷比为2～3∶1,这样脂质体核酸复合物形成后的净正电荷与细胞膜负电荷相互作用使复合物更易进入细胞[2]。作者所用脂质体和寡核苷酸的+/-电荷比为1∶1,实验证明,这种比值有效提高了反义核酸的摄入,摄取反义核酸的K562细胞的百分率达到70.9%,平均荧光强度增加6.45倍,并且有效下调WT1 mRNA表达水平。Capaccioli等则以+/-电荷之比近1/14(脂质体为Lipofectin)成功介导ODN转染。有趣的是,+/-电荷比为7时(脂质体为DOTAP),DOTAP却不能提高细胞对ODN的摄入[3]。这些实验结果提示,电荷相互作用不是脂质体核酸复合物进入细胞的唯一决定因素,内吞作用等可能也发挥重要作用,转染效率的高低还与细胞类型、脂质体种类、ODN碱基组成、培养基等有关。
, 百拇医药
细胞摄取反义核酸脂质体复合物和裸反义核酸后胞内分布与反义核酸药理作用密切相关。作者应用荧光显微镜观察K562细胞内反义核酸的分布,发现脂质体介导组与单纯反义核酸组不同之处在于,前者胞质内点状结构较大且核内明显荧光分布,这可能是脂质体提高反义核酸药理作用的另一重要机制。反义核酸这种胞内分布与荧光素标记无关。实验表明,ODN的荧光标记不影响其摄入[4];也不是由于游离荧光素引起的。作者应用紫外分光光度法发现反义核酸标记完全,无游离荧光。由于作者所用的细胞涂片是室温晾干,未加固定,因此这种胞内分布与固定方法无关[5],真正反映了反义核酸的胞内分布。Kronenwett等认为,胞质中这种点状结构相当于内体(endosome)和/或溶酶体(lysosome),反义核酸从这种内吞泡释放出来进入核内[6]。Bennett等认为,脂质体促使更多的反义核酸进入核内,更多地与mRNA结合,激活RNase H降解mRNA从而更有效抑制基因表达,而且这种作用与pH值、微管聚合作用无关,但与钠离子有关,机制仍未清楚[7]。
, 百拇医药
笔者认为,脂质体提高反义核酸摄入并增加其核内分布,可能是增强反义核酸生物活性的重要机制。
图1 处理0h后F-PSODN细胞内的分布(×100)
A.WT1反义核酸组 B.脂质体介导WT1反义核酸组
图2 处理24hF-PSODN在K562细胞内的分布(×100)
A.WT1反义核酸组 B.脂质体介导WT1反义核酸组
作者简介:王志东(1973～),男,住院医师,医学硕士.
参考文献:
, http://www.100md.com
[1] Shoji Y,Norimatsu M,Shimada J,et al. Limited use of cationic liposomes as tools to enhance the antiherpetic activities of oligonucleotides in vitro cells infected with herps simplex virus type Ⅰ[J]. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 1998,8:255.
[2]Monia BP,Johnston JF,Ecker DJ,et al. Selective inhibition of mutant Ha-ras mRNA expression by antisense oligonucleotides[J]. J Biol Chem, 1992,267:19954.
[3] Capaccioli S,Dipasquale G,Mini E,et al. Cationic lipids improve antisense oligonucleotides uptake and present degradation in culture cells and in human serum[J]. Biochem Biophy Res Commun, 1993,197:818.
, http://www.100md.com
[4] Tonkinson TL,Stein CA. Patterns of intracellular compartmentalization, trafficking and acidification of 5'-fluorescein labelled phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotides in HL-60 cells[J]. Nucleic Acids Res, 1994,22:4268.
[5] Pichon C,Monsigny M,Roche AC. Intracellular localization of oligonucleotides:influence of fixative protocols[J]. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 1999,9:89.
[6] Kronenwett R,Steidl U,Kirsch M,et al. Oligodeoxyribonu-cleotide uptake in primary human hematopoetic cells is enhanced by cationic lipids and depends on the hematopoietic cell subset[J]. Blood, 1998,91:852.
[7] Bennett CF,Chiang MY,Chan H,et al. Cationic lipids enhance cellular uptake and activity of phosphorothioate antisense oligonucleotides[J]. Mol Pharmacol, 1992,41:1023.
收稿日期:2000-02-16, 百拇医药
单位：福建医科大学 附属协和医院、福建省血液病研究所,福州 350001
关键词：阳离子；脂质体；寡核苷酸类；反义；白血病；幼红细胞；急性；基因表达
福建医科大学学报000301
摘要: 目的 探讨阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义寡核苷酸(反义核酸)细胞摄入和胞内分布的影响。 方法 采用阳离子脂质体介导WT1反义核酸转染K562细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布,RT-PCR检测处理前后WT1 mRNA表达水平。 结果 (1)脂质体提高K562细胞对反义核酸的摄入,细胞摄入率达70.9%,平均荧光强度提高6倍以上;脂质体介导转染反义核酸时其细胞浆中类核内体或溶酶体中的点状结构较非脂质体处理时大,胞核内有明显的荧光物质分布;(2)脂质体介导WT1反义核酸可下调WT1 mRNA水平。 结论 阳离子脂质体可提高反义核酸的细胞摄入并改变其胞内分布,这可能是它增强反义核酸生物活性的机制。
, 百拇医药
中图分类号: R733.7; Q786; R977.6 文献标识码: A
文章编号:1000-2235(2000)03-0209-03
Effects of Cationic Liposome LipofectinTM on the Intracellular Uptake
and Distribution of WT1 Antisense Oligodeoxynucleotides in K562 Cells
WANG Zhi-dong ZHUO Guang-sheng CHEN Zhi-zhe
(Fujian Insititue of Hematology, The Affiliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhuo 350001, China)
, 百拇医药
ABSTRACT: Objective To study the effects of cationic liposome on the uptake and intracellular distribution of antisense oligodeoxynucleotide(PSODN). Methods The uptake and intracellular localization of FAM-labelled PSODN(F-PSODN) mediated by cationic liposome Lipofectin was detected by flow cytometry(FCM) and fluorescence microscope. The expression of WT1 mRNA was measured by RT-PCR. Results (1)Cationic liposomes enhanced K562 cells taking F-PSODN by 70.9%,and mean fluorescence intensity was increased six times than the controls. K562 cells transfection mediated by cationic liposome showed larger punctuate structures in cytosol and more intensive PSODN nuclear accumulation. (2)The expression of WT1 mRNA was decreased in K562 cells transfected with ASODN and cationic liposome after 72 hours. Conclusion Cationic liposomes increased PSODN activities by enhancing the uptake of ODN and altering intracellular distribution of the ODN.
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KEY WORDS: cationic; liposome; oligodeoxynucleotide,antisense; leukemia,erythroblastic,acute; gene expression
阳离子脂质体由于其转染的安全性、高效性和通用性而在基因治疗中得到广泛应用。笔者于1998年6月～1999年1月采用阳离子脂质体LipofectinTM介导(WT1)反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(简称反义核酸)转染K562细胞,观察脂质体对反义核酸细胞摄入和胞内分布的影响,探讨脂质体提高反义核酸生物活性的可能机制。
1 材料与方法
1.1 细胞及培养体系 K562细胞培养在含15%小牛血清的RPMI 1640完全培养基(GIBCO/BRL,USA)中,取对数生长期的细胞待用。
1.2 寡核苷酸的合成、纯化及标记 WT1反义核酸(PSODN)互补于WT1 mRNA翻译起始区的-6～+12,序列为5'-GTC GGA GCC CAT TTG CTG-3',正义核酸(SODN)作为对照,序列为5'-CAG CAA ATG GGC TCC GAC-3',均硫代修饰,由福建省血液病研究所合成、纯化。其中部分反义核酸5'端FAM荧光素标记,由上海生工生物公司完成,标记效率采用紫外分光光度法分析,OD260/OD496=2～6表明标记完全。
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1.3 寡核苷酸的转染 取100 μmol/L寡核苷酸溶液7.5 μl加入不含血清及抗生素的RPMI 1640 92.5 μl中,为A液;取阳离子脂质体LipofectinTM(DOTMA与DOPE 1∶1[W/W]的混合物)10 μl(GIBCO/BRL Inc.USA)同样溶于RPMI 1640 90 μl中,为B液。A、B液分置室温30 min后,轻柔混匀,再置室温15 min,转染对数生长期的细胞,6 h后加入小牛血清。
1.4 荧光素标记的PSODN 的细胞摄入和胞内分布
1.4.1 PSODN的细胞摄入 采用流式细胞仪(Coulter,EPICS)检测。取处理6 h后的上述各组细胞4×105个,PBS冲洗5次后荧光显微镜下观察无游离荧光,上机检测反义核酸的细胞摄入率及胞内平均荧光强度。
1.4.2 PSODN的胞内分布 取处理后的细胞,经PBS洗涤5次后细胞直接涂片,室温晾干,荧光显微镜(Olympus,日本)观察胞内荧光物质的分布并拍照。
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1.5 RT-PCR检测 K562细胞WT1 mRNA的表达
1.5.1 总RNA提取及cDNA的合成按说明书进行(RNA提取液为Life technologies 产品,反转录试剂为Promega产品)。
1.5.2 引物(由上海生工公司合成)序列
WT1:S 5'-ATG TGC GAC GTG TGC CCT GC-3',AS 5'-GCT GCC TGG GAC ACT GAA CGG-3',扩增长度484 bp。
β-actin:S 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3',AS 5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3',扩增长度540 bp。
1.5.3 PCR反应体系 cDNA 1.5 μl,10×buffer 2.5 μl,25 mmol/L MgCl2 1.5 μl,10 mmol/L dNTPmix 0.5 μl,引物各为12.5 pmol,Taq DNA聚合酶1 μl,加无菌去离子水至25 μl,试剂均为Promega产品。
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1.5.4 扩增参数 WT1:94℃变性30 s,61℃退火50 s,72℃延伸70 s,共35个循环。β-actin: 94℃变性30 s,56℃退火50 s,72℃延伸60 s,共35个循环。PCR扩增仪为PE9600型(PE公司,USA)。
1.5.5 PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶(含0.5%EB)后紫外灯下观察并拍照。
2 结 果
2.1 PSODN的细胞摄入 反义核酸直接作用于K562细胞后,反义核酸的细胞摄入率为8.0%,细胞内平均荧光强度为1.10,而经脂质体介导转染后,细胞摄入率和胞内平均荧光强度分别为78.9%和7.10,另外空白对照组分别为1.2%和1.06,脂质体组分别为1.6%和1.15。
2.2 PSODN的胞内分布 反义核酸直接作用于细胞6 h后,细胞胞浆中见少量细小的点状结构,胞核无明显荧光分布,而经脂质体处理后,细胞胞浆中点状结构多且体积较大,胞核内可见较强荧光分布(图1);处理24 h后,未经脂质体介导时胞核仍无明显荧光分布,脂质体介导时细胞内荧光强度更强,有的细胞呈均匀强荧光分布(图2)。可见脂质体提高了反义核酸摄入并改变其胞内分布。
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2.3 RT-PCR电泳结果 脂质体介导反义核酸组RT-PCR产物电泳带亮度明显减弱,表明K562细胞WT1 mRNA水平下调(图3)。
图3 K562细胞β-actin、WT1 mRNA RT-PCR电泳结果
M(PCR Marker):1543, 994, 695, 515, 377, 237 bp
1.阴性对照组; 2.空白对照组; 3.反义组; 4.正义组; 5.脂质体组; 6.脂质体+正义组; 7.脂质体+反义组
A.总RNA电泳结果 B.β-actin mRNA RT-PCR电泳结果 C.WT1 mRNA RT-PCR电泳结果
3 讨 论
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反义核酸可以直接穿过细胞膜或通过内吞泡摄取进入细胞,但这种方式的效率通常是有限的。脂质体介导的转染技术由于具有安全性、高效性和通用性而得到广泛应用。LipofectinTM是1986年开发上市的阳离子脂质体,它由单阳离子脂质体DOTMA和中性脂DOPE等质量组成,经证明可介导转染核酸物质进入多种细胞,现在已得到了较广泛的应用,但是它要求在无血清的条件下转染,因此限制了在体内的应用。
阳离子脂质体介导的转染是通过反义核酸和阳离子脂质体之间离子的相互作用,形成核酸脂质体复合物再被细胞捕获而发挥反义核酸的药理作用的。这种复合物的形成与核酸/脂质体电荷比有密切关系。Shoji等利用琼脂糖电泳法发现,脂质体与ODN电荷比值在5～100时可形成复合物,但奇怪的是比值在200时并无复合物形成[1]。Monia等认为,Lipofectin介导ODN转染的最佳+/-电荷比为2～3∶1,这样脂质体核酸复合物形成后的净正电荷与细胞膜负电荷相互作用使复合物更易进入细胞[2]。作者所用脂质体和寡核苷酸的+/-电荷比为1∶1,实验证明,这种比值有效提高了反义核酸的摄入,摄取反义核酸的K562细胞的百分率达到70.9%,平均荧光强度增加6.45倍,并且有效下调WT1 mRNA表达水平。Capaccioli等则以+/-电荷之比近1/14(脂质体为Lipofectin)成功介导ODN转染。有趣的是,+/-电荷比为7时(脂质体为DOTAP),DOTAP却不能提高细胞对ODN的摄入[3]。这些实验结果提示,电荷相互作用不是脂质体核酸复合物进入细胞的唯一决定因素,内吞作用等可能也发挥重要作用,转染效率的高低还与细胞类型、脂质体种类、ODN碱基组成、培养基等有关。
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细胞摄取反义核酸脂质体复合物和裸反义核酸后胞内分布与反义核酸药理作用密切相关。作者应用荧光显微镜观察K562细胞内反义核酸的分布,发现脂质体介导组与单纯反义核酸组不同之处在于,前者胞质内点状结构较大且核内明显荧光分布,这可能是脂质体提高反义核酸药理作用的另一重要机制。反义核酸这种胞内分布与荧光素标记无关。实验表明,ODN的荧光标记不影响其摄入[4];也不是由于游离荧光素引起的。作者应用紫外分光光度法发现反义核酸标记完全,无游离荧光。由于作者所用的细胞涂片是室温晾干,未加固定,因此这种胞内分布与固定方法无关[5],真正反映了反义核酸的胞内分布。Kronenwett等认为,胞质中这种点状结构相当于内体(endosome)和/或溶酶体(lysosome),反义核酸从这种内吞泡释放出来进入核内[6]。Bennett等认为,脂质体促使更多的反义核酸进入核内,更多地与mRNA结合,激活RNase H降解mRNA从而更有效抑制基因表达,而且这种作用与pH值、微管聚合作用无关,但与钠离子有关,机制仍未清楚[7]。
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笔者认为,脂质体提高反义核酸摄入并增加其核内分布,可能是增强反义核酸生物活性的重要机制。
图1 处理0h后F-PSODN细胞内的分布(×100)
A.WT1反义核酸组 B.脂质体介导WT1反义核酸组
图2 处理24hF-PSODN在K562细胞内的分布(×100)
A.WT1反义核酸组 B.脂质体介导WT1反义核酸组
作者简介:王志东(1973～),男,住院医师,医学硕士.
参考文献:
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[1] Shoji Y,Norimatsu M,Shimada J,et al. Limited use of cationic liposomes as tools to enhance the antiherpetic activities of oligonucleotides in vitro cells infected with herps simplex virus type Ⅰ[J]. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 1998,8:255.
[2]Monia BP,Johnston JF,Ecker DJ,et al. Selective inhibition of mutant Ha-ras mRNA expression by antisense oligonucleotides[J]. J Biol Chem, 1992,267:19954.
[3] Capaccioli S,Dipasquale G,Mini E,et al. Cationic lipids improve antisense oligonucleotides uptake and present degradation in culture cells and in human serum[J]. Biochem Biophy Res Commun, 1993,197:818.
, http://www.100md.com
[4] Tonkinson TL,Stein CA. Patterns of intracellular compartmentalization, trafficking and acidification of 5'-fluorescein labelled phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotides in HL-60 cells[J]. Nucleic Acids Res, 1994,22:4268.
[5] Pichon C,Monsigny M,Roche AC. Intracellular localization of oligonucleotides:influence of fixative protocols[J]. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 1999,9:89.
[6] Kronenwett R,Steidl U,Kirsch M,et al. Oligodeoxyribonu-cleotide uptake in primary human hematopoetic cells is enhanced by cationic lipids and depends on the hematopoietic cell subset[J]. Blood, 1998,91:852.
[7] Bennett CF,Chiang MY,Chan H,et al. Cationic lipids enhance cellular uptake and activity of phosphorothioate antisense oligonucleotides[J]. Mol Pharmacol, 1992,41:1023.
收稿日期:2000-02-16, 百拇医药