椎间盘细胞培养过程中的反分化研究
作者：陈岩 胡有谷 刘勇
单位：陈岩(青岛大学医学院附属医院骨科 266003)；胡有谷(青岛大学医学院附属医院骨科 266003)；刘勇(青岛大学医学院附属医院骨科 266003)
关键词：
中国脊柱脊椎杂志000326 中图分类号：R329.2 文献标识码：B
文章编号：1006-406X(2000)-03-0188-02
椎间盘退变与其细胞生物学改变密切相关。本研究在观察椎间盘培养细胞传代过程中形态学变化的同时，对Ⅱ型胶原mRNA表达水平的改变进行了检测，目的在于找到一种理想的能模拟体内椎间盘退变的实验模型。
材料与方法 Ⅱ型胶原cDNA探针的制备：大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化采用氯化钙法[1]，重组质粒pHCAR3由芬兰Turku大学Eero Vuorio教授馈赠。质粒DNA提取采用碱裂解法[2]。插入片段的酶切回收采用的限制性内切酶为EcoR Ⅰ及Hind Ⅲ。探针回收按文献方法进行[3]。地高辛标记胶原cDNA探针按照B.M公司地高辛标记手册进行。
, 百拇医药
椎间盘细胞培养系统的建立：取材自保胎失败、胎龄3个月的胎儿3例，在无菌操作下4h内取椎间盘。将组织冲净，分别切取髓核和纤维环，剪成碎块。胰蛋白酶、胶原酶消化及冲洗离心后加入适量含血清培养液。细胞计数后接种在培养瓶中，置于CO2培养箱中培养。随时在相差显微镜下进行形态学观察。培养细胞达到95%融合时，收集细胞进行原位杂交分析。
原代培养细胞达到95%融合时，向培养瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液(1:1)少许，镜下见胞质回缩，细胞间隙增大时，吸除消化液，用Hanks液冲掉残余消化液。吸取培养液吹打瓶壁细胞以制成细胞悬液。计数后将悬液分装入培养瓶中，置培养箱中培养。当细胞传至第4代且培养细胞达到95%融合时，收集细胞进行原位杂交分析。
将贴壁细胞用胰蛋白酶制成细胞悬液。离心、冲洗及计数后用PBS重新悬浮细胞至浓度为106个/ml。取50μl细胞悬液涂于玻片上，空气中干燥及多聚甲醛固定后按照文献方法进行原位杂交[4]。
, 百拇医药
结果 细胞的形态学变化：原代培养的纤维环及髓核细胞生长迅速，3～5d后形成单细胞层，其中类软骨细胞为圆形或多角形，胞质突起，类成纤维细胞则呈梭形。传代细胞生长则较为缓慢，细胞形态变化明显，由圆形或多角形逐渐转为梭形，这种变化在传至第4代时表现更为明显，约有70%的细胞变为梭形，反映了类软骨细胞在形态方面向成纤维细胞转化的反分化改变。
Ⅱ型胶原mRNA表达的变化：原代培养的类软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平较高，表现为阳性染色细胞数目较多，染色较深。随着细胞的传代及类软骨细胞外形的转变，阳性染色细胞数目减少，染色强度明显减低。这说明类软骨细胞在传代过程中逐渐失去了其软骨表型，功能上也发生了反分化改变(图1～4，封三)。
图1 原代培养纤维环细胞Ⅱ型胶原mRNA原位杂交结果(×100)图2 传代培养纤维环细胞Ⅱ型胶原mRNA原位杂交结果(×200)图3 原代培养髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA原位杂交结果(×100)图4 传代培养髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA原位杂交结果(×200)
, 百拇医药
讨论 正常椎间盘纤维环外层主要分布着类成纤维细胞，表达I型胶原以维持椎间盘纤维环的张力。纤维环内层和髓核则集中分布着类软骨细胞，后者可表达具有软骨表型特征的Ⅱ型胶原，在椎间盘承受压力方面发挥关键作用。退变椎间盘中，类软骨细胞在发生凋亡的同时，其外形向类成纤维细胞转化，即反分化改变。髓核和纤维环内层的Ⅱ型胶原含量也明显减少，同时髓核中出现I型胶原的分布，部分突出的椎间盘则可以完全被I型及部分Ⅲ型胶原所取代，从而发生明显的纤维化[5]。与上述变化相对应，另有学者还发现胎儿椎间盘纤维环外层类成纤维细胞活跃表达Ⅰ型胶原mRNA；纤维环内层及髓核内类软骨细胞中Ⅱ型胶原基因表达活跃，髓核中没有Ⅰ型胶原基因表达。成人退变椎间盘中，Ⅱ型胶原基因表达水平减弱，同时髓核中出现Ⅰ型胶原基因表达[6]。这表明在椎间盘退变过程中，Ⅰ型胶原成为这一时期胶原代谢的主要成分，退变髓核中大部分类软骨细胞中Ⅱ型胶原基因处于不能转录或关闭状态，故无Ⅱ型胶原的合成，这一结果显然与退变椎间盘中类软骨细胞的反分化密切相关。
, 百拇医药 本研究发现，传代培养的类软骨细胞在形态学方面趋于类成纤维细胞外观的同时，其原有的作为软骨表型特征的Ⅱ型胶原mRNA表达水平也随之明显降低，这说明类软骨细胞无论从形态学还是功能方面均出现了反分化改变，这一变化与体内椎间盘退变过程中细胞生物学的变化是一致的。需要说明的是，单纯形态学变化不能用作判断细胞反分化的唯一标准，而应用原位杂交技术观察软骨细胞Ⅱ型胶原基因表达水平的改变对判断软骨细胞的分化状态及生物学特征更加敏感和具有特异性。
曲绵域[7]在对人胚胎关节软骨细胞进行传代培养后也发现了软骨细胞的反分化过程，并将其作为关节软骨退行性变的研究模型。本次研究结果与其基本一致，即培养的人体椎间盘类软骨细胞在传代过程中发生的细胞生物学变化与体内椎间盘退变时的变化十分相似，所以我们有理由认为椎间盘传代细胞培养系统的建立可以作为研究体内椎间盘退变的模型。
参考文献
[1] 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1992.55～56.
, 百拇医药
[2] 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1992.19～22.
[3] 卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术[M].北京：高等教育出版社，1993.128～129.
[4] 苏慧慈主编.原位杂交[M].北京：科学出版社，1994.127～130.
[5] 胡有谷，吕振华，陈晓亮，等.腰椎间盘的细胞、胶原和弹性蛋白[J].中华骨科杂志，1997，17(1)：8～11.
[6] 吕振华，胡有谷，冯传汉，等.椎间盘纤维性主胶原基因表达的观察[J].中华外科杂志，1998，36(2)：68～71.
[7] 曲绵域，陈慧敏，刘剑刚，等.软骨细胞培养过程中细胞反分化的研究[J].北京医科大学学报，1992，24(4)：330～332.
收稿日期：1999-05-24
修回日期：1999-12-13, 百拇医药
单位：陈岩(青岛大学医学院附属医院骨科 266003)；胡有谷(青岛大学医学院附属医院骨科 266003)；刘勇(青岛大学医学院附属医院骨科 266003)
关键词：
中国脊柱脊椎杂志000326 中图分类号：R329.2 文献标识码：B
文章编号：1006-406X(2000)-03-0188-02
椎间盘退变与其细胞生物学改变密切相关。本研究在观察椎间盘培养细胞传代过程中形态学变化的同时，对Ⅱ型胶原mRNA表达水平的改变进行了检测，目的在于找到一种理想的能模拟体内椎间盘退变的实验模型。
材料与方法 Ⅱ型胶原cDNA探针的制备：大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化采用氯化钙法[1]，重组质粒pHCAR3由芬兰Turku大学Eero Vuorio教授馈赠。质粒DNA提取采用碱裂解法[2]。插入片段的酶切回收采用的限制性内切酶为EcoR Ⅰ及Hind Ⅲ。探针回收按文献方法进行[3]。地高辛标记胶原cDNA探针按照B.M公司地高辛标记手册进行。
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椎间盘细胞培养系统的建立：取材自保胎失败、胎龄3个月的胎儿3例，在无菌操作下4h内取椎间盘。将组织冲净，分别切取髓核和纤维环，剪成碎块。胰蛋白酶、胶原酶消化及冲洗离心后加入适量含血清培养液。细胞计数后接种在培养瓶中，置于CO2培养箱中培养。随时在相差显微镜下进行形态学观察。培养细胞达到95%融合时，收集细胞进行原位杂交分析。
原代培养细胞达到95%融合时，向培养瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液(1:1)少许，镜下见胞质回缩，细胞间隙增大时，吸除消化液，用Hanks液冲掉残余消化液。吸取培养液吹打瓶壁细胞以制成细胞悬液。计数后将悬液分装入培养瓶中，置培养箱中培养。当细胞传至第4代且培养细胞达到95%融合时，收集细胞进行原位杂交分析。
将贴壁细胞用胰蛋白酶制成细胞悬液。离心、冲洗及计数后用PBS重新悬浮细胞至浓度为106个/ml。取50μl细胞悬液涂于玻片上，空气中干燥及多聚甲醛固定后按照文献方法进行原位杂交[4]。
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结果 细胞的形态学变化：原代培养的纤维环及髓核细胞生长迅速，3～5d后形成单细胞层，其中类软骨细胞为圆形或多角形，胞质突起，类成纤维细胞则呈梭形。传代细胞生长则较为缓慢，细胞形态变化明显，由圆形或多角形逐渐转为梭形，这种变化在传至第4代时表现更为明显，约有70%的细胞变为梭形，反映了类软骨细胞在形态方面向成纤维细胞转化的反分化改变。
Ⅱ型胶原mRNA表达的变化：原代培养的类软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平较高，表现为阳性染色细胞数目较多，染色较深。随着细胞的传代及类软骨细胞外形的转变，阳性染色细胞数目减少，染色强度明显减低。这说明类软骨细胞在传代过程中逐渐失去了其软骨表型，功能上也发生了反分化改变(图1～4，封三)。
图1 原代培养纤维环细胞Ⅱ型胶原mRNA原位杂交结果(×100)图2 传代培养纤维环细胞Ⅱ型胶原mRNA原位杂交结果(×200)图3 原代培养髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA原位杂交结果(×100)图4 传代培养髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA原位杂交结果(×200)
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讨论 正常椎间盘纤维环外层主要分布着类成纤维细胞，表达I型胶原以维持椎间盘纤维环的张力。纤维环内层和髓核则集中分布着类软骨细胞，后者可表达具有软骨表型特征的Ⅱ型胶原，在椎间盘承受压力方面发挥关键作用。退变椎间盘中，类软骨细胞在发生凋亡的同时，其外形向类成纤维细胞转化，即反分化改变。髓核和纤维环内层的Ⅱ型胶原含量也明显减少，同时髓核中出现I型胶原的分布，部分突出的椎间盘则可以完全被I型及部分Ⅲ型胶原所取代，从而发生明显的纤维化[5]。与上述变化相对应，另有学者还发现胎儿椎间盘纤维环外层类成纤维细胞活跃表达Ⅰ型胶原mRNA；纤维环内层及髓核内类软骨细胞中Ⅱ型胶原基因表达活跃，髓核中没有Ⅰ型胶原基因表达。成人退变椎间盘中，Ⅱ型胶原基因表达水平减弱，同时髓核中出现Ⅰ型胶原基因表达[6]。这表明在椎间盘退变过程中，Ⅰ型胶原成为这一时期胶原代谢的主要成分，退变髓核中大部分类软骨细胞中Ⅱ型胶原基因处于不能转录或关闭状态，故无Ⅱ型胶原的合成，这一结果显然与退变椎间盘中类软骨细胞的反分化密切相关。
, 百拇医药 本研究发现，传代培养的类软骨细胞在形态学方面趋于类成纤维细胞外观的同时，其原有的作为软骨表型特征的Ⅱ型胶原mRNA表达水平也随之明显降低，这说明类软骨细胞无论从形态学还是功能方面均出现了反分化改变，这一变化与体内椎间盘退变过程中细胞生物学的变化是一致的。需要说明的是，单纯形态学变化不能用作判断细胞反分化的唯一标准，而应用原位杂交技术观察软骨细胞Ⅱ型胶原基因表达水平的改变对判断软骨细胞的分化状态及生物学特征更加敏感和具有特异性。
曲绵域[7]在对人胚胎关节软骨细胞进行传代培养后也发现了软骨细胞的反分化过程，并将其作为关节软骨退行性变的研究模型。本次研究结果与其基本一致，即培养的人体椎间盘类软骨细胞在传代过程中发生的细胞生物学变化与体内椎间盘退变时的变化十分相似，所以我们有理由认为椎间盘传代细胞培养系统的建立可以作为研究体内椎间盘退变的模型。
参考文献
[1] 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1992.55～56.
, 百拇医药
[2] 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1992.19～22.
[3] 卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术[M].北京：高等教育出版社，1993.128～129.
[4] 苏慧慈主编.原位杂交[M].北京：科学出版社，1994.127～130.
[5] 胡有谷，吕振华，陈晓亮，等.腰椎间盘的细胞、胶原和弹性蛋白[J].中华骨科杂志，1997，17(1)：8～11.
[6] 吕振华，胡有谷，冯传汉，等.椎间盘纤维性主胶原基因表达的观察[J].中华外科杂志，1998，36(2)：68～71.
[7] 曲绵域，陈慧敏，刘剑刚，等.软骨细胞培养过程中细胞反分化的研究[J].北京医科大学学报，1992，24(4)：330～332.
收稿日期：1999-05-24
修回日期：1999-12-13, 百拇医药