计算机实时处理技术在细胞内钙元素研究中的应用
作者：雷长海 龚华礼 杨勇骥
单位：雷长海(第二军医大学基础医学部计算机教研室，上海 200433)；龚华礼(第二军医大学基础医学部计算机教研室，上海 200433)；杨勇骥(生物物理研究所)
关键词：钙；骨骼肌；兴奋-收缩偶联
第二军医大学学报000332 【中图分类号】 R 337 【文献标识码】 B 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0241-03▲
生物组织细胞内的元素(如钙、钾、钠、镁、磷、硫、氯)通常以可溶性元素形式存在。这些元素对生物组织细胞的功能活动及病理改变有着极为重要的影响。应用电子显微镜技术、X射线能量色散谱微区分析技术及超低温快速冷冻固定技术是目前解决可溶性元素定位定量微区分析这一世界性难题的唯一途径[1，2]。国外从80年代初开始此项研究，但由于在各方面存在着很大困难，使该研究一直处于实验阶段。
, 百拇医药
我们针对国际上该项研究中的难点，从细胞超低温快速冷冻固定以及冷冻固定对细胞、细胞器的影响入手，以骨骼肌为研究对象，借助计算机实时控制的电刺激-超低温快速冷冻固定同步技术和电子探针X射线能量色散谱微区分析系统，测定骨骼肌肌浆网内外钙离子的含量及钙离子的分布，研究骨骼肌在电刺激后兴奋-收缩偶联变化中肌浆网内钙离子变化的情况，进而对骨骼肌兴奋-收缩偶联变化时的肌浆网功能-形态作深入的研究。
1 系统设计
在生物样品受到电刺激后，其细胞功能发生变化(毫秒级水平)，为了同步固定其细胞功能变化时的形态结构，需要对样品自受刺激开始到被超低温快速冷冻固定的经历时间进行实时的测量和调控。实验中充分利用计算机高速采样卡的数据采集性能，设计了如图1所示的测量系统，方便地实现了经历时间的测量。主要测量原理为：装有实验样品的弹射架向下弹射，经过由两对透射型红外光电开关和信号放大电路及脉冲整形输出电路构成的红外探测器的第一对红外光电开关时，遮挡第一路红外线，红外探测器产生一路脉冲信号，该信号作为开始信号和触发信号同时传入计算机和刺激仪。计算机系统收到开始信号后进行计时；刺激仪收到触发信号后延时产生刺激信号，刺激样品使其功能发生变化，并将该刺激信号同步传入计算机。在实验样品受激的瞬间，计算机系统进行信号的实时定位。通过刺激仪对触发信号与刺激信号间延时的调节实现电刺激-超低温快速冷冻固定经历时间的精确调控。弹射架继续下落经过红外探测器的第二对红外光电开关时，遮挡第二路红外线并与冷冻平台接触，在实验样品被超低温快速冷冻固定的瞬间红外探测器产生另一路脉冲信号，该信号作为结束信号传入计算机，计算机收到该结束信号后进行信号的实时定位并停止采样。
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由于计算机采样频率可以通过软件进行设置，其基本单位由计算机时钟决定，是已知可控的。根据开始信号和结束信号这两路脉冲信号可以测得实验的时间间隔；根据触发信号与刺激信号可以测得刺激信号延时的时间间隔；根据刺激信号和结束信号间采样数据测得电刺激-超低温快速冷冻固定的时间间隔。因此，红外传感器中控制产生脉冲信号的器件要求具有很高的响应速度。在实验中，我们采用的透射型红外光电开关管型号为FHK-20，响应时间小于10 μs，可满足毫秒级分析要求，其性能远远优于国外同类研究中使用的机械探测器件。
图1 测量系统示意图
放大电路和脉冲整形输出电路输出标准的方波信号，当红外线未被遮挡时输出信号为零电平，红外线被遮挡时输出信号为高电平。
2 结 果
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利用以上介绍的系统获取了电刺激前后的骨骼肌肌浆网超微结构形态。观察表明：在骨骼肌兴奋-收缩偶联功能变化的收缩潜伏期内，肌浆网中的钙向其前端流出。用电子探针X射线能量色散谱微区分析技术对电刺激后0.8 及5.6 ms时间经历的骨骼肌肌浆网内钙含量进行测定，而后取其均值测得0.8 ms时间经历后的骨骼肌肌浆网内钙含量为27.13 mmol/kg，且部分肌浆网内钙含量高达33.49～50.88 mmol/kg，而5.6 ms时间经历后的骨骼肌肌浆网内钙含量约为8.3 mmol/kg。有关结果将另文报道。
3 讨 论
肌浆网中钙离子在骨骼肌兴奋-收缩偶联机制中起着重要作用，但在骨骼肌兴奋-收缩偶联时，钙离子如何在肌浆网中被“刺激”后释放，生理学实验提供钙离子释放的两种假说[3，4]：(1)通过肌浆网肌膜的去极化，由膜电位的变化引起肌浆网内钙离子释放，即直接接触信号传导假说(direct contact signals transduation)，简称DCT假说。(2)兴奋-收缩偶联开始的瞬间，肌浆网外附近区域的钙离子浓度高而诱发肌浆网内钙离子释放，即扩散传递传导假说(diffusible transmitter transduation )，简称DTT假说。
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本研究的实验结果为骨骼肌兴奋-收缩时肌浆网释放钙离子的DCT假说提供了形态学依据。从结果中可以看出，骨骼肌兴奋-收缩偶联发生时，肌浆网膜发生去极化，肌浆网膜上的活性位差诱导电荷运动，引起肌浆网膜的结构形态变化，从而打开钙离子释放通道，使肌浆网内钙离子外流至胞浆，引起肌细胞的收缩，且钙离子外流随着经历时间的延长而减少。本研究的实验结果为计算机技术在生物物理学中的应用提供了方法学的实验，实验证明利用计算机技术实时处理某些生物信号是高速的、准确的[5，6]。■
基金项目：国家自然科学业基金资助项目(39570354,39670207)
作者简介:雷长海(1974-),男(汉族),硕士
【参 考 文 献】
[1] 杨勇骥，郑 尊. 建立一种新型Agarose薄标样应用于生物EDX定量分析[J]. 第二军医大学学报,1991,12(1):67-70.
, http://www.100md.com
[2] 杨勇骥，郑 尊. 生物医学EDX定量分析中薄标样的建立[J]. 电子显微学报,1991,9(3):33-36.
[3] Stern MD, Lakatta EG. Excitation-contraction coupling in the heart: the state of the question[J]. FASEB J, 1992, 6(12):3092-3100.
[4] Sommer JR. Comparative anatomy: in praise of a powerful approach to elucidate mechanisms translating cardiac excitation into purposeful contraction[J]. J Mol Cell Cardiol，1995，27(1):19-35.
[5] 雷长海，龚华礼，杨勇骥. 模数转换技术在骨骼肌肌浆网形态功能研究中的应用[J]. 第二军医大学学报, 1999, 20(8):576-577.
[6] 雷长海，龚华礼，杨勇骥，等. 肌组织兴奋收缩偶联变化时计算机毫秒级实时控制与测定[J]. 医学信息,1999, 12(6):17.
【收稿日期】 1999-09-16
【修回日期】 2000-02-24, http://www.100md.com
单位：雷长海(第二军医大学基础医学部计算机教研室，上海 200433)；龚华礼(第二军医大学基础医学部计算机教研室，上海 200433)；杨勇骥(生物物理研究所)
关键词：钙；骨骼肌；兴奋-收缩偶联
第二军医大学学报000332 【中图分类号】 R 337 【文献标识码】 B 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0241-03▲
生物组织细胞内的元素(如钙、钾、钠、镁、磷、硫、氯)通常以可溶性元素形式存在。这些元素对生物组织细胞的功能活动及病理改变有着极为重要的影响。应用电子显微镜技术、X射线能量色散谱微区分析技术及超低温快速冷冻固定技术是目前解决可溶性元素定位定量微区分析这一世界性难题的唯一途径[1，2]。国外从80年代初开始此项研究，但由于在各方面存在着很大困难，使该研究一直处于实验阶段。
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我们针对国际上该项研究中的难点，从细胞超低温快速冷冻固定以及冷冻固定对细胞、细胞器的影响入手，以骨骼肌为研究对象，借助计算机实时控制的电刺激-超低温快速冷冻固定同步技术和电子探针X射线能量色散谱微区分析系统，测定骨骼肌肌浆网内外钙离子的含量及钙离子的分布，研究骨骼肌在电刺激后兴奋-收缩偶联变化中肌浆网内钙离子变化的情况，进而对骨骼肌兴奋-收缩偶联变化时的肌浆网功能-形态作深入的研究。
1 系统设计
在生物样品受到电刺激后，其细胞功能发生变化(毫秒级水平)，为了同步固定其细胞功能变化时的形态结构，需要对样品自受刺激开始到被超低温快速冷冻固定的经历时间进行实时的测量和调控。实验中充分利用计算机高速采样卡的数据采集性能，设计了如图1所示的测量系统，方便地实现了经历时间的测量。主要测量原理为：装有实验样品的弹射架向下弹射，经过由两对透射型红外光电开关和信号放大电路及脉冲整形输出电路构成的红外探测器的第一对红外光电开关时，遮挡第一路红外线，红外探测器产生一路脉冲信号，该信号作为开始信号和触发信号同时传入计算机和刺激仪。计算机系统收到开始信号后进行计时；刺激仪收到触发信号后延时产生刺激信号，刺激样品使其功能发生变化，并将该刺激信号同步传入计算机。在实验样品受激的瞬间，计算机系统进行信号的实时定位。通过刺激仪对触发信号与刺激信号间延时的调节实现电刺激-超低温快速冷冻固定经历时间的精确调控。弹射架继续下落经过红外探测器的第二对红外光电开关时，遮挡第二路红外线并与冷冻平台接触，在实验样品被超低温快速冷冻固定的瞬间红外探测器产生另一路脉冲信号，该信号作为结束信号传入计算机，计算机收到该结束信号后进行信号的实时定位并停止采样。
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由于计算机采样频率可以通过软件进行设置，其基本单位由计算机时钟决定，是已知可控的。根据开始信号和结束信号这两路脉冲信号可以测得实验的时间间隔；根据触发信号与刺激信号可以测得刺激信号延时的时间间隔；根据刺激信号和结束信号间采样数据测得电刺激-超低温快速冷冻固定的时间间隔。因此，红外传感器中控制产生脉冲信号的器件要求具有很高的响应速度。在实验中，我们采用的透射型红外光电开关管型号为FHK-20，响应时间小于10 μs，可满足毫秒级分析要求，其性能远远优于国外同类研究中使用的机械探测器件。
图1 测量系统示意图
放大电路和脉冲整形输出电路输出标准的方波信号，当红外线未被遮挡时输出信号为零电平，红外线被遮挡时输出信号为高电平。
2 结 果
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利用以上介绍的系统获取了电刺激前后的骨骼肌肌浆网超微结构形态。观察表明：在骨骼肌兴奋-收缩偶联功能变化的收缩潜伏期内，肌浆网中的钙向其前端流出。用电子探针X射线能量色散谱微区分析技术对电刺激后0.8 及5.6 ms时间经历的骨骼肌肌浆网内钙含量进行测定，而后取其均值测得0.8 ms时间经历后的骨骼肌肌浆网内钙含量为27.13 mmol/kg，且部分肌浆网内钙含量高达33.49～50.88 mmol/kg，而5.6 ms时间经历后的骨骼肌肌浆网内钙含量约为8.3 mmol/kg。有关结果将另文报道。
3 讨 论
肌浆网中钙离子在骨骼肌兴奋-收缩偶联机制中起着重要作用，但在骨骼肌兴奋-收缩偶联时，钙离子如何在肌浆网中被“刺激”后释放，生理学实验提供钙离子释放的两种假说[3，4]：(1)通过肌浆网肌膜的去极化，由膜电位的变化引起肌浆网内钙离子释放，即直接接触信号传导假说(direct contact signals transduation)，简称DCT假说。(2)兴奋-收缩偶联开始的瞬间，肌浆网外附近区域的钙离子浓度高而诱发肌浆网内钙离子释放，即扩散传递传导假说(diffusible transmitter transduation )，简称DTT假说。
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本研究的实验结果为骨骼肌兴奋-收缩时肌浆网释放钙离子的DCT假说提供了形态学依据。从结果中可以看出，骨骼肌兴奋-收缩偶联发生时，肌浆网膜发生去极化，肌浆网膜上的活性位差诱导电荷运动，引起肌浆网膜的结构形态变化，从而打开钙离子释放通道，使肌浆网内钙离子外流至胞浆，引起肌细胞的收缩，且钙离子外流随着经历时间的延长而减少。本研究的实验结果为计算机技术在生物物理学中的应用提供了方法学的实验，实验证明利用计算机技术实时处理某些生物信号是高速的、准确的[5，6]。■
基金项目：国家自然科学业基金资助项目(39570354,39670207)
作者简介:雷长海(1974-),男(汉族),硕士
【参 考 文 献】
[1] 杨勇骥，郑 尊. 建立一种新型Agarose薄标样应用于生物EDX定量分析[J]. 第二军医大学学报,1991,12(1):67-70.
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[2] 杨勇骥，郑 尊. 生物医学EDX定量分析中薄标样的建立[J]. 电子显微学报,1991,9(3):33-36.
[3] Stern MD, Lakatta EG. Excitation-contraction coupling in the heart: the state of the question[J]. FASEB J, 1992, 6(12):3092-3100.
[4] Sommer JR. Comparative anatomy: in praise of a powerful approach to elucidate mechanisms translating cardiac excitation into purposeful contraction[J]. J Mol Cell Cardiol，1995，27(1):19-35.
[5] 雷长海，龚华礼，杨勇骥. 模数转换技术在骨骼肌肌浆网形态功能研究中的应用[J]. 第二军医大学学报, 1999, 20(8):576-577.
[6] 雷长海，龚华礼，杨勇骥，等. 肌组织兴奋收缩偶联变化时计算机毫秒级实时控制与测定[J]. 医学信息,1999, 12(6):17.
【收稿日期】 1999-09-16
【修回日期】 2000-02-24, http://www.100md.com