聚合酶链反应(PCR)在快速诊断结核性脑膜炎中的价值
作者：樊晖 李慕凯
单位：樊晖(广州市结核病肺肿瘤防治所，广州 510180)；李慕凯(广州市结核病肺肿瘤防治所，广州 510180)
关键词：PCR；结核性脑膜炎；
广州医学院学报000320 中图分类号 R529.304 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0057-02
1985年，Mullis结核分支杆菌DNA创建了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术，1989年Hance等首先将该技术应用于检测分支杆菌，[1]1990年我国引进了该项技术，从而开辟了以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分支杆菌阶段。PCR技术灵敏度高，可检测1～100fg纯化结核分支杆菌DNA(约相当于1～20个结核分支杆菌菌体DNA量)。[2]近年来,运用PCR检测各种临床标本中结核杆菌,具有快速、敏感、特异的优点[3]。临床标本不需经过培养,直接用PCR扩增试验,当天可出结果,具有早期诊断的价值。目前,所使用的PCR技术检测不同来源的临床标本中结核杆菌的低限为3～1000个/标本。其敏感性高达98～100%,特异性为62.6～98%。 PCR检测临床标本中结核杆菌总阳性率为26.5～80%, 较培养法高12～43%,比涂片镜检也要高。其中，非肺部标本总阳性率提高更为明显。因此，PCR法尤其适用于肺外结核，特别是结脑的快速诊断[4]。为此，本文对141例结脑及28例非结脑的脑脊液标本进行PCR-结核杆菌检测，以探明其诊断价值。
, 百拇医药
1 材料和方法
本文病例是作者1998年广州市结核性脑膜炎流行性调查中在中山一院神经内科及小儿科住院病例中采集到并引用的。结核性脑膜炎的确诊依据是：1.临床症状：起病较缓慢，表现以脑膜刺激征、发热、头痛、视神经和外展神经损害及精神异常等为主。2.有颅外结核证据，如肺或胸椎X线片显示的结核性改变等。3.皮肤PPD-IgG试验阳性，脑脊液符合结核性改变等。4.抗结核治疗有效[5]。
1. 1 临床选例 141例临床诊断为结脑患者的脑脊液标本(其中男性98例，女性43例，年龄1～70岁)和28例非结脑(其中15例病毒脑，3例新隐球菌性脑炎和10例化脓性脑炎。男性20例，女性8例，年龄1～70岁)脑脊液同时作抗酸染色，细菌培养和PCR法比较检测结核杆菌。结核杆菌-PCR试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供。
1. 2 脑脊液 PCR法：脑脊液标本取5ml离心沉淀，12000r/min, 离心1～5min后，弃上清液，取菌混悬液或沉淀物，加入DNA提取液中，100°C水浴加热10min，再离心沉淀，10000～12000r/min，离心5min后，取上清液2μl进行扩增。定性试验用美国PE公司9600仪器上机，上机后不再开盖，以减少污染[6，7]。
, 百拇医药
2 结果
表1 脑脊液标本PCR法与常规方法找结核杆菌阳性检出率的比较 检测方法
例数
阳性例数
百分数%
PCR法
141
88
62.4
培养法
141
23
, 百拇医药 16.31△
涂片法
141
4
2.84△△
与PCR法比较:△P<0.01，△△P<0.01
PCR法检测脑脊液中结核杆菌阳性率为62.4%(88/141例)，显著高于培养法阳性率16.31%(23/141例)，及涂片抗酸染色法阳性率2.84%(4/141例)，非结脑经三种检测结核杆菌均为(-)，经统计学处理△P<0.01,△△P<0.01，差异有显著性。说明PCR法具有良好的敏感性。
, 百拇医药 3 讨论
3.1 传统和正在研究开发的结核菌细菌学诊断法可分为两大类：培养法和非培养法。培养法的优点是直观，可作进一步鉴别、药敏和毒力检测。但是，培养依赖性也正是其最严重的缺点。结核菌是缓慢生长菌，整个培养过程需4～8周，尤其是化疗影响而出现的培养时间延长，低活力菌和L型等非杆菌结构等生物学性别的改变，更突出了培养法的局限性。非培养法是一种用理化等技术手段，直接检出和鉴定临床标本中结核杆菌菌的技术。染色镜检法最为方便、经济，但敏感性和特异性较差。免疫学方法则由于抗体反应在结核杆菌菌诊断上的局限性和敏感性，仍困扰着其进一步发展。PCR技术属于非培养检测技术，由于其快速、敏感、特异、方便和无须预培养等优点，特别适用于难以培养的生长缓慢的病原微生物的诊断。因此，PCR技术自然就成为结核杆菌细菌诊断学最令人鼓舞的课题。
3.2 结核性脑膜炎是严重的肺外结核病，其病死率，后遗症发生率均较高，早期诊断是临床上的关键问题[8，9]。但因脑脊液中细菌太少，直接涂片阳性率低，培养又需时较长，给临床特异性治疗造成困难[10]。因此，结脑的早期诊断，早期治疗是非常重要的。由本文对169例结脑，非结脑的脑脊液标本结核杆菌-PCR检测结果来看，PCR技术对结核性脑膜炎的快速诊断具有比既往常规方法较大的优越性[11]。
, http://www.100md.com
作者简介：樊晖，女(1973.11-)，本科，医师。
研究方向：结核病诊治。
参考文献
[1]Hance AJ,Grand Champ B,Lecy-frebault V,et al.Detection and indentification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA[J].Mol Microbiol,1989;3:843～846
[2]陈效友，王洪平，金玉生等.TaqMan聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌DNA及其临床应用[J].中华结核和呼吸杂志，2000；23(5)：284～288
[3]潘毓萱. PCR技术在结核病临床诊断的应用及存在问题 [J].中华结核和呼吸杂志,1995;18(4):197～199
, 百拇医药
[4]王巍，庄玉辉.脑脊液检测项目在结核性脑膜炎诊断应用中的若干进展[J].中华结核和呼吸杂志,1996;19(5):303～305
[5]张小明，唐显峡，曾跃等.结核性脑膜炎的CT表现与临床预后的关系[J].中华结核和呼吸杂志，2000；23(2)：108～111
[6]张正.PCR反应方法学进展及临床价值的评估[J].中华医学检验杂志,1995;18(4):247～250
[7]翟秉祥，张丽杰，刘延龙.聚合酶链反应技术诊断结核病的可信性[J].中华结核和呼吸杂志，1999；22(7)：435～439
[8]许绍发，端木宏谨.肺外结核的诊断和治疗[J] .中华结核和呼吸杂志,1997;20(3):131～133
[9]谢冬英，曹红，俞洪林等.结核性与新隐球菌性脑膜炎的鉴别诊断[J].中华结核和呼吸杂志，1999；22(12)：731～735
[10]侯淑莲,孙秀娟,张惠荣等.应用PCR检测脑脊液中结核杆菌的研究 [J].中国防痨杂志,1994;16(3):121～123
[11]吴丽娟,邓光贵,﹑张文俊等.应用PCR技术快速诊断结核病[J].中华内科杂志,1995;34(7):481～484
(收稿：2000-04-25), 百拇医药
单位：樊晖(广州市结核病肺肿瘤防治所，广州 510180)；李慕凯(广州市结核病肺肿瘤防治所，广州 510180)
关键词：PCR；结核性脑膜炎；
广州医学院学报000320 中图分类号 R529.304 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0057-02
1985年，Mullis结核分支杆菌DNA创建了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术，1989年Hance等首先将该技术应用于检测分支杆菌，[1]1990年我国引进了该项技术，从而开辟了以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分支杆菌阶段。PCR技术灵敏度高，可检测1～100fg纯化结核分支杆菌DNA(约相当于1～20个结核分支杆菌菌体DNA量)。[2]近年来,运用PCR检测各种临床标本中结核杆菌,具有快速、敏感、特异的优点[3]。临床标本不需经过培养,直接用PCR扩增试验,当天可出结果,具有早期诊断的价值。目前,所使用的PCR技术检测不同来源的临床标本中结核杆菌的低限为3～1000个/标本。其敏感性高达98～100%,特异性为62.6～98%。 PCR检测临床标本中结核杆菌总阳性率为26.5～80%, 较培养法高12～43%,比涂片镜检也要高。其中，非肺部标本总阳性率提高更为明显。因此，PCR法尤其适用于肺外结核，特别是结脑的快速诊断[4]。为此，本文对141例结脑及28例非结脑的脑脊液标本进行PCR-结核杆菌检测，以探明其诊断价值。
, 百拇医药
1 材料和方法
本文病例是作者1998年广州市结核性脑膜炎流行性调查中在中山一院神经内科及小儿科住院病例中采集到并引用的。结核性脑膜炎的确诊依据是：1.临床症状：起病较缓慢，表现以脑膜刺激征、发热、头痛、视神经和外展神经损害及精神异常等为主。2.有颅外结核证据，如肺或胸椎X线片显示的结核性改变等。3.皮肤PPD-IgG试验阳性，脑脊液符合结核性改变等。4.抗结核治疗有效[5]。
1. 1 临床选例 141例临床诊断为结脑患者的脑脊液标本(其中男性98例，女性43例，年龄1～70岁)和28例非结脑(其中15例病毒脑，3例新隐球菌性脑炎和10例化脓性脑炎。男性20例，女性8例，年龄1～70岁)脑脊液同时作抗酸染色，细菌培养和PCR法比较检测结核杆菌。结核杆菌-PCR试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供。
1. 2 脑脊液 PCR法：脑脊液标本取5ml离心沉淀，12000r/min, 离心1～5min后，弃上清液，取菌混悬液或沉淀物，加入DNA提取液中，100°C水浴加热10min，再离心沉淀，10000～12000r/min，离心5min后，取上清液2μl进行扩增。定性试验用美国PE公司9600仪器上机，上机后不再开盖，以减少污染[6，7]。
, 百拇医药
2 结果
表1 脑脊液标本PCR法与常规方法找结核杆菌阳性检出率的比较 检测方法
例数
阳性例数
百分数%
PCR法
141
88
62.4
培养法
141
23
, 百拇医药 16.31△
涂片法
141
4
2.84△△
与PCR法比较:△P<0.01，△△P<0.01
PCR法检测脑脊液中结核杆菌阳性率为62.4%(88/141例)，显著高于培养法阳性率16.31%(23/141例)，及涂片抗酸染色法阳性率2.84%(4/141例)，非结脑经三种检测结核杆菌均为(-)，经统计学处理△P<0.01,△△P<0.01，差异有显著性。说明PCR法具有良好的敏感性。
, 百拇医药 3 讨论
3.1 传统和正在研究开发的结核菌细菌学诊断法可分为两大类：培养法和非培养法。培养法的优点是直观，可作进一步鉴别、药敏和毒力检测。但是，培养依赖性也正是其最严重的缺点。结核菌是缓慢生长菌，整个培养过程需4～8周，尤其是化疗影响而出现的培养时间延长，低活力菌和L型等非杆菌结构等生物学性别的改变，更突出了培养法的局限性。非培养法是一种用理化等技术手段，直接检出和鉴定临床标本中结核杆菌菌的技术。染色镜检法最为方便、经济，但敏感性和特异性较差。免疫学方法则由于抗体反应在结核杆菌菌诊断上的局限性和敏感性，仍困扰着其进一步发展。PCR技术属于非培养检测技术，由于其快速、敏感、特异、方便和无须预培养等优点，特别适用于难以培养的生长缓慢的病原微生物的诊断。因此，PCR技术自然就成为结核杆菌细菌诊断学最令人鼓舞的课题。
3.2 结核性脑膜炎是严重的肺外结核病，其病死率，后遗症发生率均较高，早期诊断是临床上的关键问题[8，9]。但因脑脊液中细菌太少，直接涂片阳性率低，培养又需时较长，给临床特异性治疗造成困难[10]。因此，结脑的早期诊断，早期治疗是非常重要的。由本文对169例结脑，非结脑的脑脊液标本结核杆菌-PCR检测结果来看，PCR技术对结核性脑膜炎的快速诊断具有比既往常规方法较大的优越性[11]。
, http://www.100md.com
作者简介：樊晖，女(1973.11-)，本科，医师。
研究方向：结核病诊治。
参考文献
[1]Hance AJ,Grand Champ B,Lecy-frebault V,et al.Detection and indentification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA[J].Mol Microbiol,1989;3:843～846
[2]陈效友，王洪平，金玉生等.TaqMan聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌DNA及其临床应用[J].中华结核和呼吸杂志，2000；23(5)：284～288
[3]潘毓萱. PCR技术在结核病临床诊断的应用及存在问题 [J].中华结核和呼吸杂志,1995;18(4):197～199
, 百拇医药
[4]王巍，庄玉辉.脑脊液检测项目在结核性脑膜炎诊断应用中的若干进展[J].中华结核和呼吸杂志,1996;19(5):303～305
[5]张小明，唐显峡，曾跃等.结核性脑膜炎的CT表现与临床预后的关系[J].中华结核和呼吸杂志，2000；23(2)：108～111
[6]张正.PCR反应方法学进展及临床价值的评估[J].中华医学检验杂志,1995;18(4):247～250
[7]翟秉祥，张丽杰，刘延龙.聚合酶链反应技术诊断结核病的可信性[J].中华结核和呼吸杂志，1999；22(7)：435～439
[8]许绍发，端木宏谨.肺外结核的诊断和治疗[J] .中华结核和呼吸杂志,1997;20(3):131～133
[9]谢冬英，曹红，俞洪林等.结核性与新隐球菌性脑膜炎的鉴别诊断[J].中华结核和呼吸杂志，1999；22(12)：731～735
[10]侯淑莲,孙秀娟,张惠荣等.应用PCR检测脑脊液中结核杆菌的研究 [J].中国防痨杂志,1994;16(3):121～123
[11]吴丽娟,邓光贵,﹑张文俊等.应用PCR技术快速诊断结核病[J].中华内科杂志,1995;34(7):481～484
(收稿：2000-04-25), 百拇医药