高效液相色谱法在测定心肌组织中ATP、ADP、AMP方面的应用
作者：寇瑛何才云 刘智敏 石应康 佟莉
单位：寇瑛(华西医科大学附属第一医院胸心外科 成都 610041)；何才云(华西医科大学附属第一医院分析测试中心 成都 610041)；刘智敏(华西医科大学附属第一医院分析测试中心 成都 610041)；石应康(华西医科大学附属第一医院胸心外科 成都 610041)；佟莉(华西医科大学附属第一医院麻醉科 成都 610041)
关键词：高效液相色谱法；含氧血心脏停搏液；ATP；能量储备
华西医学000313摘要：目的：用高效液相色谱法来测定心肌组织中的ATP、ADP、AMP的含量，比较含氧血心脏停搏液持续灌注和冷晶体心脏停搏液间断灌主保护心肌的作用。方法：心脏瓣膜直视术患者45例，随机分为两组冷晶体心脏停搏液组(CCC组)和含氧血(T>35℃)心脏停搏液组(OBC组)，分别测定两组心肌组织中ATP、ADP、AMP的含量。结果：组间比较，主动脉开放后CCC组能量储备值(EC值)明显降低(P<0.05)；组内比较，CCC组的EC值主动脉开放后较阻断前明显减少(P<0.01)。结论：含氧血心脏停搏液持续灌注在能量储备方面较冷晶体心脏停搏液间断灌注好。
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[中图分类号]R446；R977.8；R654.1 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(2000)03-0295-02
Application of High-Performance Liquid Chromatography(HPLC) in the Determination of ATP,ADP and AMP in Cardiac Muscle
KOU Ying-li,HE Cai-yun,LIU Zhi-min,et al.
(Department of Thoracocardiac Surgery,The First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu,Sichuan 610041,P.R.China)
, 百拇医药
Abstract：Objective:The present study was designed to ascertain whether continuous warm oxygenated blood cardioplegia can protect the arrested heart from myocardial ischemia.Myocardial protection is one of the most important part in open heart surgery which directly influences the effect of surgery.Methods:Forty-five patients with valve operations were randomly divided into two groups:21 patients with cold crystalloid cardioplegia(CCC),and 24 patients with oxygenated blood cardioplegia(OBC).The ATP,ADP and AMP in myocardial tissues from the patients were determined by HPLC.Results:Energy charge(EC)was lower in CCC than that in OBC after cross-clamp removal(P<0.05).The EC was lower in CCC after cross-clamp removal than that before aortic occlusion(P<0.01).Conclusion:The results showed that OBC is superior to CCC in energy charge of myocardial tissue.
, 百拇医药
Key words:High performance liquid chromatography;Oxygenated blood cardioplegia;ATP;Energy charge
高效液相色谱法(HPLC)〔1，2〕测定迅速、精确、灵敏度高，已成为估计嘌呤、嘧啶复合物变化的方法之一。而手术前后心肌组织高能磷酸化合物含量的变化程度是判断心肌保护的一个重要指标。本研究利用HPLC测定心肌组织中的三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)的含量，来比较传统的晶体心脏停搏液间断灌注和含氧血心脏停搏液持续灌注对心肌的保护作用。
1 资料与方法
1.1 临床资料：将心脏瓣膜直视术患者45例随机分为两组：冷晶体心脏停搏液组(cold crystalloid cardioplegia,CCC组)：21例，用冷晶体心脏停搏液(ST.Thomas液)间断灌注；含氧血心脏停搏液组(oxygenated blood cardioplegia,OBC组)：24例，用含氧温血(T>30℃)心脏停搏液持续灌注。
, 百拇医药
1.2 心肌组织样品设备：每例病人在主动脉阻断前及开放后20～30分钟取右心耳组织50mg置密闭容器中迅速投入液氮保存。在0.5℃下将标本放入预冷盛有0.42M(3.6%)高氯酸1ml的匀浆管中，抽提30分钟，3000rpm冷冻离心15分钟后取上清液1.5ml，用1N KOH中和至pH6.25后置密闭容器中放入-85℃冰箱保存直至测试。取储存标本迅速解冻，3000rpm冷冻离心5分钟，取上清液20μl进样。
1.3 统计学分析：数据均以均数±标准差(
±s)表示，统计分析用t检验。
图1 标品溶液色谱图 图2 心肌提取液色谱图
表1.两组心肌ATP含量及EC值比较 组别
, 百拇医药
例数
ATP(umol/g.wet.weight)**
EC**
主动脉阻断前 主动脉开放后
主动脉阻断前 主动脉开放后
CCC组
(21例)
0.3798±0.1566 0.1904±0.1204
0.4252±0.0849 0.2856±0.0913
OBC组
(24例)
, 百拇医药
0.3802±0.1384 0.2637±0.1109
0.4456±0.0961 0.4016±0.1024
注：*CCC组与OBC组比较P<0.05；**两个时间点的组内比较：CCC组ATP含量P<0.05，EC值P<0.01，OBC组ATP含量P<0.05
能量储备EC(Energy charge)=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)
2 实验部分
2.1 仪器：瑞典LKB公司的高效液相色谱仪，包括：2150输液泵，2152控制器，美国PE公司LC-295多波长紫外检测器和2220数据处理机，国产SYZ-A型石英亚沸高水蒸馏器。
, 百拇医药 2.2 试剂：ATP、ADP、AMP标准品(Sigma公司)；高氯酸、氢氧化钾、氢氧化铵、磷酸二氢铵(市售分析纯)；高纯水。
2.3 色谱条件：色谱柱：Lichrosorb RP 18,5um,250mm×4mm i.d.;柱温：23～28℃；流动相：pH6.25，0.1mol/L磷酸铵缓冲液；流速：0.8ml/min；检测波长：254nm；灵敏度：0.01AUFS。
3 结果
3.1 方法性能：样品分峰的保留时间与标品相近(图1、图2)。
按外标法定量在0～30×10-11mol/L的范围内，ATP、ADP、AMP的进样量对峰面积的线性关系良好，线性系数r>0.999。将1×10-12mol/L ATP、0.85×10-12mol/L ADP和1×10-12mol/L AMP的混合标准液重复进样5次，所得峰面积的变异系数分别为1.7%，1.4%和0.99%。ATP、ADP、AMP的回收率分别为96.92%、95.97%、99.23%。
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3.2 两组心肌组织中ATP的含量及能量储备(EC)〔3，4〕(见表1)，两组心肌组织中ADP及AMP含量无明显差异(P>0.05)。
3 讨论
我们的研究采用的HPLC方法费时少，比通常使用的酶分析法具更好的精确性，在能量复合物测定方面进了关键的一步，现逐渐应用于心肌研究的实践中〔2〕。心肌组织中的ATP、ADP、AMP含量变化直接反映了心肌能量代谢水平，能量的缺乏是缺血缺氧引起细胞结构和功能异常的根本原因〔5〕，是判断手术过程中心肌保护的一个相当重要的指标。由表看出，两组心肌组织ATP、ADP、AMP的含量在主动脉阻断前、开放后组间差异无显著性，EC值在主动脉开放后CCC与OBC组的差异有统计学意义(P<0.05)，即CCC组主动脉开放后EC值较OBC组明显减少。两组组内比较主动脉开放后ATP含量均明显减少(P<0.05)，EC值CCC组主动脉开放后较阻断前显著减少(P<0.01)，OBC组内差异无显著性(P>0.05)。本试验结果说明在主动脉阻断期间，含氧血心脏停搏液持续灌注能维持足够的氧传递和新陈代谢〔6〕。心脏在温血环境下停搏，增加了诱导期间心肌对氧的摄取，保证了心脏停搏状态时氧耗较低的心肌供氧，减轻了心肌供、耗氧间的失衡状态。
, 百拇医药
综上所述，含氧血心脏停搏液持续灌注在能量储备方面优于冷晶体心脏停搏液间断灌注法，有利于手术后心肌组织能量的恢复，是一种较好的心肌保护方法。
参考文献
1，Hull-Ryde EA,Lewis WR,Veronee CD,et al.Simple step gradient elution of the major high-energy compounds and their catabolites in cardiac muscle using High-Performance Liquid Chromatography.J Chromatogr.1986;377(11):165～174.
2，Holliss DG,Humphrey SM,Morrison MA,et al.Reverse phase HPLC for rapid,comprehensive measurement of nucleotides,nucleosides and bases of the myocardial adenine pool.Analytical Letters.1984;17(B18):2047～2049.
, http://www.100md.com
3，Swanson DK,Myerowitz PD,Watson KM.The effects of cardioplegia washout on myocardial preservation.J Surg Research.1985;39(4):378～389.
4，Yau TM,Weisel RD,Mickle DAG,et al.Optimal delivery of blood cardioplegia.Circulation.1991;84(Suppl Ⅲ)：Ⅲ380～388.
5，Martin DR,Scott DF,Downes GL,et al.Primary cause of unsuccessful liver and heart preservation:cold sensitivity of the ATP ase system.Ann Surg.1972;175(1):111～117.
6，Yuan SM.A generalized consideration of myocardial preservation with cold crystalloid versus warm blood cardioplegia in heart valve replacement.Kachsiung Journal of Medical Sciences.1998;14(5):266～273.
(收稿日期：2000-04-14), 百拇医药
单位：寇瑛(华西医科大学附属第一医院胸心外科 成都 610041)；何才云(华西医科大学附属第一医院分析测试中心 成都 610041)；刘智敏(华西医科大学附属第一医院分析测试中心 成都 610041)；石应康(华西医科大学附属第一医院胸心外科 成都 610041)；佟莉(华西医科大学附属第一医院麻醉科 成都 610041)
关键词：高效液相色谱法；含氧血心脏停搏液；ATP；能量储备
华西医学000313摘要：目的：用高效液相色谱法来测定心肌组织中的ATP、ADP、AMP的含量，比较含氧血心脏停搏液持续灌注和冷晶体心脏停搏液间断灌主保护心肌的作用。方法：心脏瓣膜直视术患者45例，随机分为两组冷晶体心脏停搏液组(CCC组)和含氧血(T>35℃)心脏停搏液组(OBC组)，分别测定两组心肌组织中ATP、ADP、AMP的含量。结果：组间比较，主动脉开放后CCC组能量储备值(EC值)明显降低(P<0.05)；组内比较，CCC组的EC值主动脉开放后较阻断前明显减少(P<0.01)。结论：含氧血心脏停搏液持续灌注在能量储备方面较冷晶体心脏停搏液间断灌注好。
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[中图分类号]R446；R977.8；R654.1 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(2000)03-0295-02
Application of High-Performance Liquid Chromatography(HPLC) in the Determination of ATP,ADP and AMP in Cardiac Muscle
KOU Ying-li,HE Cai-yun,LIU Zhi-min,et al.
(Department of Thoracocardiac Surgery,The First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu,Sichuan 610041,P.R.China)
, 百拇医药
Abstract：Objective:The present study was designed to ascertain whether continuous warm oxygenated blood cardioplegia can protect the arrested heart from myocardial ischemia.Myocardial protection is one of the most important part in open heart surgery which directly influences the effect of surgery.Methods:Forty-five patients with valve operations were randomly divided into two groups:21 patients with cold crystalloid cardioplegia(CCC),and 24 patients with oxygenated blood cardioplegia(OBC).The ATP,ADP and AMP in myocardial tissues from the patients were determined by HPLC.Results:Energy charge(EC)was lower in CCC than that in OBC after cross-clamp removal(P<0.05).The EC was lower in CCC after cross-clamp removal than that before aortic occlusion(P<0.01).Conclusion:The results showed that OBC is superior to CCC in energy charge of myocardial tissue.
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Key words:High performance liquid chromatography;Oxygenated blood cardioplegia;ATP;Energy charge
高效液相色谱法(HPLC)〔1，2〕测定迅速、精确、灵敏度高，已成为估计嘌呤、嘧啶复合物变化的方法之一。而手术前后心肌组织高能磷酸化合物含量的变化程度是判断心肌保护的一个重要指标。本研究利用HPLC测定心肌组织中的三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)的含量，来比较传统的晶体心脏停搏液间断灌注和含氧血心脏停搏液持续灌注对心肌的保护作用。
1 资料与方法
1.1 临床资料：将心脏瓣膜直视术患者45例随机分为两组：冷晶体心脏停搏液组(cold crystalloid cardioplegia,CCC组)：21例，用冷晶体心脏停搏液(ST.Thomas液)间断灌注；含氧血心脏停搏液组(oxygenated blood cardioplegia,OBC组)：24例，用含氧温血(T>30℃)心脏停搏液持续灌注。
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1.2 心肌组织样品设备：每例病人在主动脉阻断前及开放后20～30分钟取右心耳组织50mg置密闭容器中迅速投入液氮保存。在0.5℃下将标本放入预冷盛有0.42M(3.6%)高氯酸1ml的匀浆管中，抽提30分钟，3000rpm冷冻离心15分钟后取上清液1.5ml，用1N KOH中和至pH6.25后置密闭容器中放入-85℃冰箱保存直至测试。取储存标本迅速解冻，3000rpm冷冻离心5分钟，取上清液20μl进样。
1.3 统计学分析：数据均以均数±标准差(
±s)表示，统计分析用t检验。图1 标品溶液色谱图 图2 心肌提取液色谱图
表1.两组心肌ATP含量及EC值比较 组别
, 百拇医药
例数
ATP(umol/g.wet.weight)**
EC**
主动脉阻断前 主动脉开放后
主动脉阻断前 主动脉开放后
CCC组
(21例)
0.3798±0.1566 0.1904±0.1204
0.4252±0.0849 0.2856±0.0913
OBC组
(24例)
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0.3802±0.1384 0.2637±0.1109
0.4456±0.0961 0.4016±0.1024
注：*CCC组与OBC组比较P<0.05；**两个时间点的组内比较：CCC组ATP含量P<0.05，EC值P<0.01，OBC组ATP含量P<0.05
能量储备EC(Energy charge)=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)
2 实验部分
2.1 仪器：瑞典LKB公司的高效液相色谱仪，包括：2150输液泵，2152控制器，美国PE公司LC-295多波长紫外检测器和2220数据处理机，国产SYZ-A型石英亚沸高水蒸馏器。
, 百拇医药 2.2 试剂：ATP、ADP、AMP标准品(Sigma公司)；高氯酸、氢氧化钾、氢氧化铵、磷酸二氢铵(市售分析纯)；高纯水。
2.3 色谱条件：色谱柱：Lichrosorb RP 18,5um,250mm×4mm i.d.;柱温：23～28℃；流动相：pH6.25，0.1mol/L磷酸铵缓冲液；流速：0.8ml/min；检测波长：254nm；灵敏度：0.01AUFS。
3 结果
3.1 方法性能：样品分峰的保留时间与标品相近(图1、图2)。
按外标法定量在0～30×10-11mol/L的范围内，ATP、ADP、AMP的进样量对峰面积的线性关系良好，线性系数r>0.999。将1×10-12mol/L ATP、0.85×10-12mol/L ADP和1×10-12mol/L AMP的混合标准液重复进样5次，所得峰面积的变异系数分别为1.7%，1.4%和0.99%。ATP、ADP、AMP的回收率分别为96.92%、95.97%、99.23%。
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3.2 两组心肌组织中ATP的含量及能量储备(EC)〔3，4〕(见表1)，两组心肌组织中ADP及AMP含量无明显差异(P>0.05)。
3 讨论
我们的研究采用的HPLC方法费时少，比通常使用的酶分析法具更好的精确性，在能量复合物测定方面进了关键的一步，现逐渐应用于心肌研究的实践中〔2〕。心肌组织中的ATP、ADP、AMP含量变化直接反映了心肌能量代谢水平，能量的缺乏是缺血缺氧引起细胞结构和功能异常的根本原因〔5〕，是判断手术过程中心肌保护的一个相当重要的指标。由表看出，两组心肌组织ATP、ADP、AMP的含量在主动脉阻断前、开放后组间差异无显著性，EC值在主动脉开放后CCC与OBC组的差异有统计学意义(P<0.05)，即CCC组主动脉开放后EC值较OBC组明显减少。两组组内比较主动脉开放后ATP含量均明显减少(P<0.05)，EC值CCC组主动脉开放后较阻断前显著减少(P<0.01)，OBC组内差异无显著性(P>0.05)。本试验结果说明在主动脉阻断期间，含氧血心脏停搏液持续灌注能维持足够的氧传递和新陈代谢〔6〕。心脏在温血环境下停搏，增加了诱导期间心肌对氧的摄取，保证了心脏停搏状态时氧耗较低的心肌供氧，减轻了心肌供、耗氧间的失衡状态。
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综上所述，含氧血心脏停搏液持续灌注在能量储备方面优于冷晶体心脏停搏液间断灌注法，有利于手术后心肌组织能量的恢复，是一种较好的心肌保护方法。
参考文献
1，Hull-Ryde EA,Lewis WR,Veronee CD,et al.Simple step gradient elution of the major high-energy compounds and their catabolites in cardiac muscle using High-Performance Liquid Chromatography.J Chromatogr.1986;377(11):165～174.
2，Holliss DG,Humphrey SM,Morrison MA,et al.Reverse phase HPLC for rapid,comprehensive measurement of nucleotides,nucleosides and bases of the myocardial adenine pool.Analytical Letters.1984;17(B18):2047～2049.
, http://www.100md.com
3，Swanson DK,Myerowitz PD,Watson KM.The effects of cardioplegia washout on myocardial preservation.J Surg Research.1985;39(4):378～389.
4，Yau TM,Weisel RD,Mickle DAG,et al.Optimal delivery of blood cardioplegia.Circulation.1991;84(Suppl Ⅲ)：Ⅲ380～388.
5，Martin DR,Scott DF,Downes GL,et al.Primary cause of unsuccessful liver and heart preservation:cold sensitivity of the ATP ase system.Ann Surg.1972;175(1):111～117.
6，Yuan SM.A generalized consideration of myocardial preservation with cold crystalloid versus warm blood cardioplegia in heart valve replacement.Kachsiung Journal of Medical Sciences.1998;14(5):266～273.
(收稿日期：2000-04-14), 百拇医药