骨折的转基因治疗
作者：王丹 胡蕴玉
单位：王丹(济宁医学院附属医院骨科 272129)；胡蕴玉(第四军医大学全军骨科研究所)
关键词：
中华创伤杂志000325 骨组织具有再生和修复能力。骨折时，只需将骨折复位后固定一段时间即可使大部分骨折达到良好愈合。尽管如此，仍有部分病人因骨折部血运差、伴有骨和软组织缺失、不适当开放复位和内固定、代谢性或遗传性疾病影响等而发生骨折延迟愈合或不愈合，需要进一步治疗。骨移植是常用治疗方法。因骨移植本身具有一些难以克服的缺点，使其应用受到一定的限制。因此，迫切需要新的治疗方法以加速骨折愈合，缩短骨折固定时间和保证复杂骨折能够达到良好愈合。随着对骨形成的生物学研究的深入，能促进成骨的生长因子，如骨形成蛋白(BMPs)、转化生长因子-β(TGF-β)等与适当载体复合植入骨折或骨缺损局部促进骨愈合的动物实验和临床应用均取得了成功，为促进骨折愈合、治疗骨折延迟或不愈合开辟了一条新途径。但是，外源性生长因子半衰期较短，要求相对大的剂量才能刺激足量骨形成而发挥治疗作用，从而增加临床应用的成本和可能导致毒性作用的产生[1]。因而，需要寻找新的方法以解决这些问题。通过基因转移(gene transfer)或基因转染(gene transfection)技术将具有成骨促进作用的生长因子基因转入某些细胞，使这些细胞能在骨折部位分泌生长因子并持续一段时间和维持所需浓度，从而有效地促进骨折愈合，这样也避免了应用外源性生长因子的蛋白质所带来的弊病。这就是促进骨折愈合的转基因疗法。
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一、基因转移的策略
生长因子是机体细胞根据其编码基因而合成的蛋白质。将编码某种生长因子的基因分离出来，以适当方式转移到某个细胞内，再将这个细胞植入到骨折局部，它就能在骨折处合成这种生长因子并持续一段时间。当骨折部位植入许多含有某种生长因子基因的细胞时，就可以维持较高的生长因子浓度而促进骨折愈合。其他部位的组织和器官不含这种细胞，就不会以此种方式合成这种生长因子，从而对全身其他组织不会产生不利影响。1995年，Evans等[2]对基因治疗的概念及其在骨科领域应用的可能性进行了阐述。简单地说，一个成功的基因治疗包括目的基因获得，将目的基因转入靶细胞，获得目的基因的高水平表达并持续一段时间。
基因向细胞内转移存在两个问题：一是基因载体的选择，二是应当在体内或在体外将基因向细胞内转移，并避开溶酶体的降解作用进入细胞核内。裸DNA具有价廉、安全的优点。但是，没有载体帮助，细胞摄入目的基因的效率较低。载体可以显著提高细胞对目的基因的摄入和表达水平。目前，转基因所用载体可以是病毒类或非病毒类。非病毒类(如脂质体)价格比病毒低廉且安全，较少产生抗原性[3]。但是，与病毒类载体相比，基因表达水平较低且表达持续时间较短。病毒类载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、乳头状瘤病毒、猿病毒、多瘤病毒、牛痘病毒、细小病毒等。应用腺病毒和单纯疱疹病毒作为载体进行转基因时,转染细胞的目的基因表达是暂时性高水平表达，这对于骨组织修复比较理想。
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基因转移治疗骨折的策略有体内转移(in vivo)和体外转移(in vitra)两种。体内转移是将含有目的基因的载体直接注射到骨折部位，骨折局部的某些细胞将目的基因吸收。体外转移是首先从体内分离出某种细胞并进行体外培养，再通过载体将目的基因导入所培养的细胞，然后将这些细胞植入骨折部位。上述两种方法在骨折部位都可以获得目的基因在一段时间内的持续表达。体内转移的方法简单，但体外转移方法比较安全。某些载体，如病毒等不适合用于体内转移。此外，根据某些细胞具有向骨损伤部位移动的特性，将这些细胞进行转基因后可全身应用，以治疗多发性骨折[4]。
二、基因转移治疗骨折的研究
基因转移治疗骨折可采用上述两种方法将目的基因转移到骨折部位。同时，采用Lac Z、Neor或虫荧光素酶基因作为标记基因以检测目的基因是否插入到了载体上和是否导入了宿主细胞内。
1. 体外转基因法：骨髓基质细胞可作为转基因的宿主细胞。将骨髓基质细胞从骨髓组织中分离出来，在体外直接用含有促骨形成作用的生长因子基因的逆转录病毒或腺病毒载体转导。然后，将携带有目的基因的骨髓基质细胞直接注射到骨折局部或全身应用[5，6]。因骨髓基质细胞具有向骨损伤部位集聚的生物学特性，全身应用时它们同样能达到促进骨折修复的目的。采用骨髓基质细胞作为转基因的宿主细胞，不仅给骨折部位提供了生长因子，而且还提供了成骨前体细胞，从而更有利于促进骨愈合。
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Balk等[6]从大鼠骨髓中分离出骨髓基质细胞，分别用带有标记基因Lac Z的腺病毒和带有标记基因Lac Z和Neor的逆转录病毒进行基因转染。转染的目的基因为重组人BMP-2(rhBMP-2)。作者将转染的骨髓基质细胞种植在陶瓷块上，然后植入到裸鼠皮下来检测其成软骨和骨的能力。结果证实，转染的骨髓基质细胞能形成软骨和骨组织，并且所形成的组织中有标记基因Lac Z表达。Lieberman等[7]用含有rhBMP-2 cDNA的腺病毒在体外转染小鼠骨髓基质细胞，然后将其植入有严重免疫缺陷的小鼠股四头肌内，结果可诱导形成大量骨组织。用被转染的骨髓基质细胞修复裸鼠股骨干节段性骨缺损也取得了成功[8]。Mason等[9]发现，用含hBMP基因的逆转录病毒载体转染骨膜细胞，可显著增加被转染细胞分泌羟基磷灰石的能力，从而提出应用转基因的骨膜细胞移植促进骨折愈合的设想。另有研究表明，将转染的骨髓基质细胞注射到同基因小鼠骨髓内，它们能在不同部位骨髓组织中迁徙，逐步分化为成骨细胞，并且仍能保持标记基因较高水平的表达[4]。该研究结果为全身应用基因转染骨髓基质细胞治疗多发性骨折，提供了实验依据。
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2. 体内转基因法：Baltzer等[10]将带有Lac Z和虫荧光素酶标记基因的腺病毒悬液注射到兔股骨缺损部位，用组织化学和酶分析方法分别检测骨缺损部位和远位组织中的Lac Z+细胞和虫荧光素酶。结果发现，直接注射病毒悬液后，在截骨端、骨缺损部瘢痕组织及周围肌肉组织中，基因转移的效率相当高。在肺和脾组织中无基因转移的证据存在，仅在肝脏中有低水平的转染基因暂时表达。肌肉和瘢痕组织中细胞的转染基因表达随着时间推移而下降，注射病毒悬液后2～6周逐渐消失。但注射后6周时，在骨组织中仍然存在转染基因表达。Goldstein等[4]证实，骨缺损部细胞可摄入含有标记基因的质粒并表达标记基因。然后，分别用Ⅰ型和Ⅱ型胶原基质、矿化胶原等作为含有BMP-4和甲状旁腺素第1～34氨基酸片断(hPTG 1～34)质粒的载体，植入大鼠股骨5 mm骨缺损处。术后23周，所有动物的骨缺损全部愈合，而空白对照组仍然是骨不连。用不同剂量含有hPTH 1～34质粒的胶原植入兔股骨干骺端和股骨干直径8 mm骨洞内，可促进骨形成。但成骨量与剂量呈正相关。Steinbrech等[11]用含有胰岛素样生长因子(IGF)Ⅰ和Ⅱ基因的病毒悬液注入兔上颌骨截骨部。术后7 d，局部骨和软组织中IGFⅠ和IGFⅡ均显著高于对照组。上述结果表明，不但在较大动物体内基因转染可取得目的基因表达，而且目的基因表达后所致的生物学效应有明显剂量依赖性。
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三、存在问题
转基因治疗骨折初步实验研究结果令人振奋，展现出了临床应用前景。但是,究竟需要目的基因多长时间的表达才能满足骨折修复的需要尚不清楚。虽然已经证实，促进成骨的生长因子与骨折自然修复有关，但是，尚不清楚这些因子在骨折不愈合时能否单独起治疗作用。成骨抑制因子、破骨细胞调节因子、促血管生成因子等对骨愈合均有调节作用。在骨折不愈合时，这些因子的作用是否发生了异常也不清楚。因此，仍需要进一步开展人体骨折愈合的生物学研究和骨折不愈合及成骨障碍的分子病理学研究。一旦解决了这些问题，我们就会知道通过转基因方法治疗骨折或骨折不愈合时转入什么基因将会更有效，从而做到有的放矢、提高疗效。目前，有关转基因治疗骨折和骨缺损的研究仅涉及了目的基因在骨折部位的表达情况。目的基因表达对骨折修复过程的影响也许是较长期的，需要进一步深入研究。将来，必须在技术上筛选出对骨折及骨缺损修复效果最好的生长因子基因和能够应用于临床的最有效和最安全的转基因至骨折或骨缺损部位的方法[12]。此外，还需要确立转基因治疗骨折和骨缺损的适应证及临床效果评定标准。
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参考文献：
[1]Einhorn T. The cell and molecular biology of fracture healing. Clin Orthop, 1998, (355 Suppl):7-21.
[2]Evans CH, Robbins PD. Possible orthopaedic applications of gene therapy. J Bone Joint Surg (Am), 1995, 77:1103-1114.
[3]Zhang Y,Sekirov L,Saravolac E,et al.Stabilized plasmid-lipid particles for regional gene therapy:formulation and transfection properties. Gene Ther, 1999, 6:1438-1447.
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[4]Goldstein SA, Bonadio J. Potential role for direct gene transfer in the enhancement of fracture healing. Clin Orthop, 1998, (355 Suppl):154-162.
[5]Allay JA, Dennis JE, Haynesworth SE, et al. Lac Z and interleulin-3 expression in vivo after retroviral transduction of marrow-derived human osteogenic mesenchymal progenitors. Human Gen Ther, 1997, 8:1417-1427.
[6]Balk ML, Bray J, Day C, et al. Effect of rhBMP-2 on the osteogenetic potential of bone marrow stromal cells from an osteogenesis imperfecta mouse (OIM). Bone, 1997, 21:7-15.
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[7]Lieberman JR, Le LQ, Wu L, et al. Regional gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthoptoscopic bone formation in radents. J Orthop Res, 1998, 16:330-339.
[8]Lieberman JR, Dalwiski A, Stevenson S, et al. Regional gene therapy with BMP producing bone marrow cells heals segmental femoral defects in rats. Trans Orthop Res Soc, 1998, 23:210.
[9]Mason JM ,Grande DA,Barciar M,et al.Expression of human bone morphogenic protein 7 in primary rabbit periosteal cells: potential utility in gene therapy for osteochondral repair. Gene Ther, 1998,5:1098-1109.
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[10]Baltzer AW,lattemann C, Whalen JD,et al.A gene therapy approach to accelerating bone healing: evaluation of gene expression in a New Zealand white rabbit model. Ann Surg Sports Traumatol Arthrosc,1999,7:197-202.
[11]Steinbrech DS,Mehrara BJ,Rowe NM,et al. Gene expression of insulin-like growth factors Ⅰand Ⅱin rat membranous osteotomy healing. Ann Plast Surg, 1999, 42:481-487.
[12]Alden TD,Pittman DD,Hankins GR,et al. In vivo endochondral bone formation using a bone morphogenetic protein 2 advenoviral vector. Human Gene Ther, 1999, 10:2245-2253.
收稿日期：1999-06-30, http://www.100md.com
单位：王丹(济宁医学院附属医院骨科 272129)；胡蕴玉(第四军医大学全军骨科研究所)
关键词：
中华创伤杂志000325 骨组织具有再生和修复能力。骨折时，只需将骨折复位后固定一段时间即可使大部分骨折达到良好愈合。尽管如此，仍有部分病人因骨折部血运差、伴有骨和软组织缺失、不适当开放复位和内固定、代谢性或遗传性疾病影响等而发生骨折延迟愈合或不愈合，需要进一步治疗。骨移植是常用治疗方法。因骨移植本身具有一些难以克服的缺点，使其应用受到一定的限制。因此，迫切需要新的治疗方法以加速骨折愈合，缩短骨折固定时间和保证复杂骨折能够达到良好愈合。随着对骨形成的生物学研究的深入，能促进成骨的生长因子，如骨形成蛋白(BMPs)、转化生长因子-β(TGF-β)等与适当载体复合植入骨折或骨缺损局部促进骨愈合的动物实验和临床应用均取得了成功，为促进骨折愈合、治疗骨折延迟或不愈合开辟了一条新途径。但是，外源性生长因子半衰期较短，要求相对大的剂量才能刺激足量骨形成而发挥治疗作用，从而增加临床应用的成本和可能导致毒性作用的产生[1]。因而，需要寻找新的方法以解决这些问题。通过基因转移(gene transfer)或基因转染(gene transfection)技术将具有成骨促进作用的生长因子基因转入某些细胞，使这些细胞能在骨折部位分泌生长因子并持续一段时间和维持所需浓度，从而有效地促进骨折愈合，这样也避免了应用外源性生长因子的蛋白质所带来的弊病。这就是促进骨折愈合的转基因疗法。
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一、基因转移的策略
生长因子是机体细胞根据其编码基因而合成的蛋白质。将编码某种生长因子的基因分离出来，以适当方式转移到某个细胞内，再将这个细胞植入到骨折局部，它就能在骨折处合成这种生长因子并持续一段时间。当骨折部位植入许多含有某种生长因子基因的细胞时，就可以维持较高的生长因子浓度而促进骨折愈合。其他部位的组织和器官不含这种细胞，就不会以此种方式合成这种生长因子，从而对全身其他组织不会产生不利影响。1995年，Evans等[2]对基因治疗的概念及其在骨科领域应用的可能性进行了阐述。简单地说，一个成功的基因治疗包括目的基因获得，将目的基因转入靶细胞，获得目的基因的高水平表达并持续一段时间。
基因向细胞内转移存在两个问题：一是基因载体的选择，二是应当在体内或在体外将基因向细胞内转移，并避开溶酶体的降解作用进入细胞核内。裸DNA具有价廉、安全的优点。但是，没有载体帮助，细胞摄入目的基因的效率较低。载体可以显著提高细胞对目的基因的摄入和表达水平。目前，转基因所用载体可以是病毒类或非病毒类。非病毒类(如脂质体)价格比病毒低廉且安全，较少产生抗原性[3]。但是，与病毒类载体相比，基因表达水平较低且表达持续时间较短。病毒类载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、乳头状瘤病毒、猿病毒、多瘤病毒、牛痘病毒、细小病毒等。应用腺病毒和单纯疱疹病毒作为载体进行转基因时,转染细胞的目的基因表达是暂时性高水平表达，这对于骨组织修复比较理想。
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基因转移治疗骨折的策略有体内转移(in vivo)和体外转移(in vitra)两种。体内转移是将含有目的基因的载体直接注射到骨折部位，骨折局部的某些细胞将目的基因吸收。体外转移是首先从体内分离出某种细胞并进行体外培养，再通过载体将目的基因导入所培养的细胞，然后将这些细胞植入骨折部位。上述两种方法在骨折部位都可以获得目的基因在一段时间内的持续表达。体内转移的方法简单，但体外转移方法比较安全。某些载体，如病毒等不适合用于体内转移。此外，根据某些细胞具有向骨损伤部位移动的特性，将这些细胞进行转基因后可全身应用，以治疗多发性骨折[4]。
二、基因转移治疗骨折的研究
基因转移治疗骨折可采用上述两种方法将目的基因转移到骨折部位。同时，采用Lac Z、Neor或虫荧光素酶基因作为标记基因以检测目的基因是否插入到了载体上和是否导入了宿主细胞内。
1. 体外转基因法：骨髓基质细胞可作为转基因的宿主细胞。将骨髓基质细胞从骨髓组织中分离出来，在体外直接用含有促骨形成作用的生长因子基因的逆转录病毒或腺病毒载体转导。然后，将携带有目的基因的骨髓基质细胞直接注射到骨折局部或全身应用[5，6]。因骨髓基质细胞具有向骨损伤部位集聚的生物学特性，全身应用时它们同样能达到促进骨折修复的目的。采用骨髓基质细胞作为转基因的宿主细胞，不仅给骨折部位提供了生长因子，而且还提供了成骨前体细胞，从而更有利于促进骨愈合。
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Balk等[6]从大鼠骨髓中分离出骨髓基质细胞，分别用带有标记基因Lac Z的腺病毒和带有标记基因Lac Z和Neor的逆转录病毒进行基因转染。转染的目的基因为重组人BMP-2(rhBMP-2)。作者将转染的骨髓基质细胞种植在陶瓷块上，然后植入到裸鼠皮下来检测其成软骨和骨的能力。结果证实，转染的骨髓基质细胞能形成软骨和骨组织，并且所形成的组织中有标记基因Lac Z表达。Lieberman等[7]用含有rhBMP-2 cDNA的腺病毒在体外转染小鼠骨髓基质细胞，然后将其植入有严重免疫缺陷的小鼠股四头肌内，结果可诱导形成大量骨组织。用被转染的骨髓基质细胞修复裸鼠股骨干节段性骨缺损也取得了成功[8]。Mason等[9]发现，用含hBMP基因的逆转录病毒载体转染骨膜细胞，可显著增加被转染细胞分泌羟基磷灰石的能力，从而提出应用转基因的骨膜细胞移植促进骨折愈合的设想。另有研究表明，将转染的骨髓基质细胞注射到同基因小鼠骨髓内，它们能在不同部位骨髓组织中迁徙，逐步分化为成骨细胞，并且仍能保持标记基因较高水平的表达[4]。该研究结果为全身应用基因转染骨髓基质细胞治疗多发性骨折，提供了实验依据。
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2. 体内转基因法：Baltzer等[10]将带有Lac Z和虫荧光素酶标记基因的腺病毒悬液注射到兔股骨缺损部位，用组织化学和酶分析方法分别检测骨缺损部位和远位组织中的Lac Z+细胞和虫荧光素酶。结果发现，直接注射病毒悬液后，在截骨端、骨缺损部瘢痕组织及周围肌肉组织中，基因转移的效率相当高。在肺和脾组织中无基因转移的证据存在，仅在肝脏中有低水平的转染基因暂时表达。肌肉和瘢痕组织中细胞的转染基因表达随着时间推移而下降，注射病毒悬液后2～6周逐渐消失。但注射后6周时，在骨组织中仍然存在转染基因表达。Goldstein等[4]证实，骨缺损部细胞可摄入含有标记基因的质粒并表达标记基因。然后，分别用Ⅰ型和Ⅱ型胶原基质、矿化胶原等作为含有BMP-4和甲状旁腺素第1～34氨基酸片断(hPTG 1～34)质粒的载体，植入大鼠股骨5 mm骨缺损处。术后23周，所有动物的骨缺损全部愈合，而空白对照组仍然是骨不连。用不同剂量含有hPTH 1～34质粒的胶原植入兔股骨干骺端和股骨干直径8 mm骨洞内，可促进骨形成。但成骨量与剂量呈正相关。Steinbrech等[11]用含有胰岛素样生长因子(IGF)Ⅰ和Ⅱ基因的病毒悬液注入兔上颌骨截骨部。术后7 d，局部骨和软组织中IGFⅠ和IGFⅡ均显著高于对照组。上述结果表明，不但在较大动物体内基因转染可取得目的基因表达，而且目的基因表达后所致的生物学效应有明显剂量依赖性。
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三、存在问题
转基因治疗骨折初步实验研究结果令人振奋，展现出了临床应用前景。但是,究竟需要目的基因多长时间的表达才能满足骨折修复的需要尚不清楚。虽然已经证实，促进成骨的生长因子与骨折自然修复有关，但是，尚不清楚这些因子在骨折不愈合时能否单独起治疗作用。成骨抑制因子、破骨细胞调节因子、促血管生成因子等对骨愈合均有调节作用。在骨折不愈合时，这些因子的作用是否发生了异常也不清楚。因此，仍需要进一步开展人体骨折愈合的生物学研究和骨折不愈合及成骨障碍的分子病理学研究。一旦解决了这些问题，我们就会知道通过转基因方法治疗骨折或骨折不愈合时转入什么基因将会更有效，从而做到有的放矢、提高疗效。目前，有关转基因治疗骨折和骨缺损的研究仅涉及了目的基因在骨折部位的表达情况。目的基因表达对骨折修复过程的影响也许是较长期的，需要进一步深入研究。将来，必须在技术上筛选出对骨折及骨缺损修复效果最好的生长因子基因和能够应用于临床的最有效和最安全的转基因至骨折或骨缺损部位的方法[12]。此外，还需要确立转基因治疗骨折和骨缺损的适应证及临床效果评定标准。
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参考文献：
[1]Einhorn T. The cell and molecular biology of fracture healing. Clin Orthop, 1998, (355 Suppl):7-21.
[2]Evans CH, Robbins PD. Possible orthopaedic applications of gene therapy. J Bone Joint Surg (Am), 1995, 77:1103-1114.
[3]Zhang Y,Sekirov L,Saravolac E,et al.Stabilized plasmid-lipid particles for regional gene therapy:formulation and transfection properties. Gene Ther, 1999, 6:1438-1447.
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[4]Goldstein SA, Bonadio J. Potential role for direct gene transfer in the enhancement of fracture healing. Clin Orthop, 1998, (355 Suppl):154-162.
[5]Allay JA, Dennis JE, Haynesworth SE, et al. Lac Z and interleulin-3 expression in vivo after retroviral transduction of marrow-derived human osteogenic mesenchymal progenitors. Human Gen Ther, 1997, 8:1417-1427.
[6]Balk ML, Bray J, Day C, et al. Effect of rhBMP-2 on the osteogenetic potential of bone marrow stromal cells from an osteogenesis imperfecta mouse (OIM). Bone, 1997, 21:7-15.
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[7]Lieberman JR, Le LQ, Wu L, et al. Regional gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthoptoscopic bone formation in radents. J Orthop Res, 1998, 16:330-339.
[8]Lieberman JR, Dalwiski A, Stevenson S, et al. Regional gene therapy with BMP producing bone marrow cells heals segmental femoral defects in rats. Trans Orthop Res Soc, 1998, 23:210.
[9]Mason JM ,Grande DA,Barciar M,et al.Expression of human bone morphogenic protein 7 in primary rabbit periosteal cells: potential utility in gene therapy for osteochondral repair. Gene Ther, 1998,5:1098-1109.
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[10]Baltzer AW,lattemann C, Whalen JD,et al.A gene therapy approach to accelerating bone healing: evaluation of gene expression in a New Zealand white rabbit model. Ann Surg Sports Traumatol Arthrosc,1999,7:197-202.
[11]Steinbrech DS,Mehrara BJ,Rowe NM,et al. Gene expression of insulin-like growth factors Ⅰand Ⅱin rat membranous osteotomy healing. Ann Plast Surg, 1999, 42:481-487.
[12]Alden TD,Pittman DD,Hankins GR,et al. In vivo endochondral bone formation using a bone morphogenetic protein 2 advenoviral vector. Human Gene Ther, 1999, 10:2245-2253.
收稿日期：1999-06-30, http://www.100md.com