脊髓缺血损伤模型及行为学的实验研究
作者：伍亚民 王正国 朱佩芳 廖维宏
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所 400042 重庆
关键词：兔；脊髓损伤；局部缺血；行为
中华创伤杂志000309摘 要：目的 制作一种新的家兔脊髓缺血损伤模型，观察其行为功能改变。 方法 以选择性阻断腰动脉制作腰髓缺血损伤模型，32只家兔随机均分为对照组，缺血30，60及90 min组。采用Jacobs法对家兔后肢功能评级，Reuter法对脊髓感觉运动反射功能评分。 结果 再灌注1 d时，缺血30 min家兔轻瘫，缺血60，90 min家兔全部(8/8)发生完全性截瘫。Reuter分值变化趋势为缺血90 min组>缺血60 min组>缺血30 min组>对照组。 结论 选择性阻断腰动脉血流30，60，90 min可以模拟出轻、中、重不同程度局部脊髓缺血再灌注损伤。本模型是一种较理想的脊髓缺血损伤模型。
, 百拇医药
Experimental Study on ischemic injury model of spinal cord and behavior
WU Yamin WANG Zhengguo ZHU Peifang, et al.
(Research Institute of Surgery, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
Abstract：Objective To make a new ischemic injury model of spinal cord and investigate function changes of behavior in rabbits. Methods The ischemic injury model of spinal cord was created by the selective occlusion of lumbar arteries in 32 rabbits，which were randomly and equally divided into four groups, i.e. control group, ischemia for 30 minutes, ischemia for 60 minutes and ischemia for 90 minutes. The function of hind extremities was evaluated by the Jacobs method; and the sensory, motor and reflex functions of spinal cord were scored through the Reuter method. Results A mild paralysis was noted in the ischemia for 30 minutes group from one day perfusion, but the complete paralysis of all rabbits happened in the two groups of ischemia for 60 minutes and ischemia for 90 minutes. The Reuter's score in the order from the highest to the lowest was ischemia for 90 minutes, ischemia for 60 minutes,ischemia for 30 minutes and control group. Conclusions Mild, moderate and severe reperfusion injury of regional spinal cord ischemia can be simulated by the selective occlusion of lumbar artery for 30 minutes, 60 minutes and 90 minutes respectively. It is a very good model of ischemic injury in spinal cord.
, 百拇医药
Key words：Rabbits; Spinal cord injuries; Ischemia； Behavior▲
脊髓继发性损伤最基本的机制是“血管机制”，即脊髓缺血缺氧在脊髓继发性损伤中具有重要作用[1]。缺血性脊髓病是多种损伤疾患的后遗症，如胸腹主动脉瘤手术治疗就可能发生因脊髓缺血所致的截瘫, 且其发病率高达40%～45%[2，3]。研究脊髓缺血致截瘫的机制具有十分重要的理论价值和临床意义。由此，建立理想的脊髓缺血损伤模型十分必要[3]。笔者制作一种新的家兔脊髓缺血再灌注损伤模型，并从行为学方面进行了初步研究。
材料与方法
1.动物模型与分组：日本大耳白家兔32只,体重(2.25±0.25)kg, 雌雄不拘。随机均分为对照组，缺血30,60,90 min组。以选择性阻断腰动脉制备脊髓缺血损伤模型，具体方法见参考文献[4～6] 。
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2.观察指标与方法：(1)后肢运动功能：家兔致伤后于再灌注1，3，7，14 d时，参照Jacobs等[7]方法结合实际工作体会(以下括号内所述)对各组家兔后肢运动功能进行评级，具体标准如下： 0级，全瘫(针刺无反应)；1级，严重瘫痪，最小的功能性运动(肌肉搐动)；2级，能进行功能性运动(受累肢体可负重)，但不能齐足跳动；3级，能齐足跳动，但有共济失调和轻瘫(跛行)；4级，齐足跳动，轻度共济失调和(或)轻瘫(奔跑但不够灵活)；5级，正常。据此以0～3级为截瘫标准，计算出各组家兔的截瘫率。(2)感觉运动功能综合评分：根据Reuter等[8]方法对各组家兔再灌注后1，2，4，8，24，48，72 h脊髓感觉、运动、反射功能进行评分。
3.统计学处理：采用t检验对组内、组间样本进行显著性检验。
结 果
1.兔后肢运动功能观察：再灌注1 d时, 各组家兔的Jacobs分级就显示出较明显的差别。见表1。 其后观察了再灌注14 d期间的截瘫率。结果发现，对照组家兔术后1～14 d无明显瘫痪表现, 截瘫率为8/8; 缺血损伤各组家兔随缺血程度的不同,其后肢表现为不同程度、不同类型的瘫痪。再灌注1 d时, 缺血30，60，90 min组家兔大部分发生截瘫,截瘫率分别为5/8,8/8,8/8；但缺血30 min组有3只家兔后肢功能恢复至5级,1只家兔功能恢复至3级；而在缺血60,90 min组家兔仍然全部处于瘫痪状态。再灌注14 d时，截瘫率分别为8/8,7/8,8/8。
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表1 再灌注24 h各组家兔后肢运动功能评级 组别
兔数
Jacobs分级
0
1
2
3
4
5
对照组
8
0
0
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0
0
2
6
缺血30 min组
8
2
2
0
1
0
3
缺血60 min组
8
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6
0
1
1
0
0
缺血90 min组
8
8
0
0
0
0
0
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2.感觉运动功能观察：按Reuter法评分，正常家兔评0 分,全瘫时评11分。结果发现，除对照组家兔再灌注24,48,72 h外,其他各组所有时相点评分值均明显高于伤前正常分值；缺血期间各组评分均为11分。总体而言，再灌注后损伤各组各个时相点的分值均明显高于对照组分值(P<0.05～0.01); 60，90 min组的评分值均明显高于30 min组评分值, 60 min组与90 min组比较, 除90 min组再灌注1 h时的评分值明显高于相应60 min组的评分值外, 其他各个时相点间比较无明显差异 (P>0.05)。见表2。
表2 不同时间各组家兔Reuter评分值(
±s) 组别
兔数
缺血后
再灌注时间(h)
, http://www.100md.com
1
2
4
8
24
48
72
对照组
8
-
6.5±
0.7
4.3±
0.5
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2.7±
0.6
2.3±
0.3
1.2±
0.2
1.2±
0.2
1.2±
0.2
缺血30 min组
8
11.0±0.0
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9.7±
0.5**
7.7±
1.0**
5.7±
0.7*
5.0±
0.5*
3.2±
0.7*
4.3±
0.7**
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3.8±
0.7**
缺血60 min组
8
11.0±0.0
8.8±
0.6**
9.3±
0.5**
9.7±
0.6**＃＃
9.2±
, 百拇医药
0.7**＃＃
9.2±
0.7**＃＃
8.8±
0.5**＃＃
8.5±
0.8**＃＃
缺血90 min组
8
11.0±0.0
10.8±
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10.5±0.3**＃
10.2±
0.4**＃＃
9.8±
0.7**＃＃
9.2±
0.7**＃＃
9.3±
0.6**＃＃
9.7±
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0.6**＃＃
与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01； 与缺血30 min组比较：# P<0.05 ##P<0.01； 与缺血60 min组比较：△△P<0.01讨 论
脊髓缺血损伤模型以新西兰家兔腹主动脉阻断致腰髓缺血损伤模型为代表[3]。经兔腹腔入路的左肾动脉下腹主动脉阻断法，存在二次手术创伤；经腹膜后左肾动脉下腹主动脉阻断可造成典型的缺血再灌注损伤，且可在清醒状态下致伤，因而被广泛地使用；后来发展到经股动脉插气囊或液囊导管阻断腹主动脉，又较以上模型更进一步。但这些模型存在一个共同的不可忽视的缺点：在造成脊髓缺血再灌注损伤的同时，也导致了腹腔、盆腔、下肢肌肉、神经等组织器官的缺血再灌注损伤,由此影响了行为功能学评估，进而影响脊髓损伤(SCI)机制及防治的研究[3]。同样的情况在大鼠脊髓缺血损伤模型中也有发生[3，9]。笔者首次利用日本大耳白家兔通过选择性阻断腰动脉制作了单一的局部脊髓缺血再灌注损伤模型，因其不直接阻断腹主动脉，从而也不会造成腹主动脉所支配的其他器官组织的直接缺血再灌注损伤，因而更利于进行继发性脊髓损伤的深入研究。此外还有以下特点：来自腰尾部和骶部节段血管的循环代偿可对腰骶髓提供保护作用；缺血损伤程度较主动脉阻断所致的缺血损伤轻；可通过不同数目的腰动脉阻断或同一腰动脉不同的阻断时间来控制缺血损伤程度，且重复性好，能复制出不同类型截瘫的典型临床表现。主要不足是要求动物种属纯，此外造模操作手术较复杂。
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从Jacobs评级结果中可以看出：对照组动物行为功能在再灌注1 d时完全正常,至再灌注14 d也未见明显的行为功能障碍。缺血30 min时，动物出现一过性软瘫，至再灌注1 d时，多数动物行为功能基本恢复，少数表现轻度的共济失调。缺血60 min和90 min时，动物表现明显的截瘫，再灌注1 d内表现为软瘫，之后大多数动物表现为硬瘫，且可分为伸肌瘫痪、屈肌瘫痪和混合性瘫痪3种类型，部分动物出现明显的大小便失禁。再灌注14 d内,60 min组少数动物逐渐恢复，瘫痪症状减轻, 其截瘫率降至7/8，但90 min组家兔功能改善慢，截瘫率仍为8/8。由此可见，选择性阻断腰动脉30,60,90 min可致轻、中、重不同程度的后肢运动功能障碍。Reuter评分能对动物的感觉、运动、反射、肌张力、后肢运动等功能进行综合评估, 分值越高功能受损越明显。结果发现，除对照组动物再灌注24，48，72 h外,其他各组家兔所有Reuter分值均明显高于伤前正常分值，这说明对照组家兔在再灌注1 d后其功能基本得到恢复，而3个损伤组均存在明显的不同程度的功能障碍。在缺血期间，评分最高均为11分，此时家兔均表现为软瘫，可能系急性缺血、脊髓休克和麻药作用所致。损伤组家兔再灌注期间的Reuter分值自大至小依次为缺血90 min组>缺血60 min组>缺血30 min组>对照组。提示随缺血时间的延长，再灌注时家兔感觉、运动功能障碍也越明显。综合Jacobs分级和Reuter评分结果，结合本模型有关脊髓血流量、病理学和感觉运动传导功能类似变化规律的研究结果[4，5]，不难推断：本造模方法可通过腰动脉阻断时间的不同而模拟出轻、中、重不同程度脊髓缺血再灌注损伤。因而，本模型是一种较理想的脊髓缺血损伤模型。
, 百拇医药
基金项目：全军“九五”指令性课题基金资助项目(96L035)
参考文献：
[1]Tator CH，Fehlings MG. Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms. J Neurosurg，1991，75：15-26.
[2]Crawford ES，Crawford JL，Safi HJ，et al. Thoracoabdominal aortic aneurysm: preoperative and intraoperative factors determining immediate and long-term results of operation in 605 patients. J Vasc Surg， 1986，3：389-404.
, 百拇医药
[3]伍亚民，王正国，朱佩芳，等. 脊髓缺血损伤模型的研究概况. 中华创伤杂志， 1999，15 增刊：106-108.
[4]伍亚民，王正国，朱佩芳，等. 家兔脊髓缺血再灌注皮层体感诱发电位的变化及意义. 第三军医大学学报，1999，21：5-8.
[5]伍亚民，王正国，朱佩芳，等.脊髓缺血再灌注对其血流量变化及其病理改变关系的研究. 第三军医大学学报，1999，21：475-478.
[6]伍亚民，王正国，朱佩芳，等.缺血再灌注损伤致脊髓传导功能的变化及2-氨基膦酸基戊酸的影响. 解放军医学杂志，1999，24：336-338.
[7]Jacobs TP，Schohami E，Baze W，et al. Deteriorating stroke model: histopathology，edema and eicosanoid changes following spinal cord ischemia in rabbit. Stroke，1987，18：741-751.
, 百拇医药
[8]Reuter DG，Tacker WA，Badylak SF，et al. Correlation of motor-evoked potential response to ischemia spinal cord damage. J Thorac Cardiovas Surg， 1992，104：262-272.
[9]Marsala M，Yaksh TL.Transient spinal ischema in the rat： characterization of behavioral and histopathological consequences as a function of the duration of aortic occlusion. J Cereb Blood Flow Metab， 1994，14：526-535.
收稿日期：1999-11-15, 百拇医药
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所 400042 重庆
关键词：兔；脊髓损伤；局部缺血；行为
中华创伤杂志000309摘 要：目的 制作一种新的家兔脊髓缺血损伤模型，观察其行为功能改变。 方法 以选择性阻断腰动脉制作腰髓缺血损伤模型，32只家兔随机均分为对照组，缺血30，60及90 min组。采用Jacobs法对家兔后肢功能评级，Reuter法对脊髓感觉运动反射功能评分。 结果 再灌注1 d时，缺血30 min家兔轻瘫，缺血60，90 min家兔全部(8/8)发生完全性截瘫。Reuter分值变化趋势为缺血90 min组>缺血60 min组>缺血30 min组>对照组。 结论 选择性阻断腰动脉血流30，60，90 min可以模拟出轻、中、重不同程度局部脊髓缺血再灌注损伤。本模型是一种较理想的脊髓缺血损伤模型。
, 百拇医药
Experimental Study on ischemic injury model of spinal cord and behavior
WU Yamin WANG Zhengguo ZHU Peifang, et al.
(Research Institute of Surgery, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
Abstract：Objective To make a new ischemic injury model of spinal cord and investigate function changes of behavior in rabbits. Methods The ischemic injury model of spinal cord was created by the selective occlusion of lumbar arteries in 32 rabbits，which were randomly and equally divided into four groups, i.e. control group, ischemia for 30 minutes, ischemia for 60 minutes and ischemia for 90 minutes. The function of hind extremities was evaluated by the Jacobs method; and the sensory, motor and reflex functions of spinal cord were scored through the Reuter method. Results A mild paralysis was noted in the ischemia for 30 minutes group from one day perfusion, but the complete paralysis of all rabbits happened in the two groups of ischemia for 60 minutes and ischemia for 90 minutes. The Reuter's score in the order from the highest to the lowest was ischemia for 90 minutes, ischemia for 60 minutes,ischemia for 30 minutes and control group. Conclusions Mild, moderate and severe reperfusion injury of regional spinal cord ischemia can be simulated by the selective occlusion of lumbar artery for 30 minutes, 60 minutes and 90 minutes respectively. It is a very good model of ischemic injury in spinal cord.
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Key words：Rabbits; Spinal cord injuries; Ischemia； Behavior▲
脊髓继发性损伤最基本的机制是“血管机制”，即脊髓缺血缺氧在脊髓继发性损伤中具有重要作用[1]。缺血性脊髓病是多种损伤疾患的后遗症，如胸腹主动脉瘤手术治疗就可能发生因脊髓缺血所致的截瘫, 且其发病率高达40%～45%[2，3]。研究脊髓缺血致截瘫的机制具有十分重要的理论价值和临床意义。由此，建立理想的脊髓缺血损伤模型十分必要[3]。笔者制作一种新的家兔脊髓缺血再灌注损伤模型，并从行为学方面进行了初步研究。
材料与方法
1.动物模型与分组：日本大耳白家兔32只,体重(2.25±0.25)kg, 雌雄不拘。随机均分为对照组，缺血30,60,90 min组。以选择性阻断腰动脉制备脊髓缺血损伤模型，具体方法见参考文献[4～6] 。
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2.观察指标与方法：(1)后肢运动功能：家兔致伤后于再灌注1，3，7，14 d时，参照Jacobs等[7]方法结合实际工作体会(以下括号内所述)对各组家兔后肢运动功能进行评级，具体标准如下： 0级，全瘫(针刺无反应)；1级，严重瘫痪，最小的功能性运动(肌肉搐动)；2级，能进行功能性运动(受累肢体可负重)，但不能齐足跳动；3级，能齐足跳动，但有共济失调和轻瘫(跛行)；4级，齐足跳动，轻度共济失调和(或)轻瘫(奔跑但不够灵活)；5级，正常。据此以0～3级为截瘫标准，计算出各组家兔的截瘫率。(2)感觉运动功能综合评分：根据Reuter等[8]方法对各组家兔再灌注后1，2，4，8，24，48，72 h脊髓感觉、运动、反射功能进行评分。
3.统计学处理：采用t检验对组内、组间样本进行显著性检验。
结 果
1.兔后肢运动功能观察：再灌注1 d时, 各组家兔的Jacobs分级就显示出较明显的差别。见表1。 其后观察了再灌注14 d期间的截瘫率。结果发现，对照组家兔术后1～14 d无明显瘫痪表现, 截瘫率为8/8; 缺血损伤各组家兔随缺血程度的不同,其后肢表现为不同程度、不同类型的瘫痪。再灌注1 d时, 缺血30，60，90 min组家兔大部分发生截瘫,截瘫率分别为5/8,8/8,8/8；但缺血30 min组有3只家兔后肢功能恢复至5级,1只家兔功能恢复至3级；而在缺血60,90 min组家兔仍然全部处于瘫痪状态。再灌注14 d时，截瘫率分别为8/8,7/8,8/8。
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表1 再灌注24 h各组家兔后肢运动功能评级 组别
兔数
Jacobs分级
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对照组
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缺血30 min组
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2.感觉运动功能观察：按Reuter法评分，正常家兔评0 分,全瘫时评11分。结果发现，除对照组家兔再灌注24,48,72 h外,其他各组所有时相点评分值均明显高于伤前正常分值；缺血期间各组评分均为11分。总体而言，再灌注后损伤各组各个时相点的分值均明显高于对照组分值(P<0.05～0.01); 60，90 min组的评分值均明显高于30 min组评分值, 60 min组与90 min组比较, 除90 min组再灌注1 h时的评分值明显高于相应60 min组的评分值外, 其他各个时相点间比较无明显差异 (P>0.05)。见表2。
表2 不同时间各组家兔Reuter评分值(
±s) 组别兔数
缺血后
再灌注时间(h)
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1
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对照组
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0.2
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缺血30 min组
8
11.0±0.0
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9.7±
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与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01； 与缺血30 min组比较：# P<0.05 ##P<0.01； 与缺血60 min组比较：△△P<0.01讨 论
脊髓缺血损伤模型以新西兰家兔腹主动脉阻断致腰髓缺血损伤模型为代表[3]。经兔腹腔入路的左肾动脉下腹主动脉阻断法，存在二次手术创伤；经腹膜后左肾动脉下腹主动脉阻断可造成典型的缺血再灌注损伤，且可在清醒状态下致伤，因而被广泛地使用；后来发展到经股动脉插气囊或液囊导管阻断腹主动脉，又较以上模型更进一步。但这些模型存在一个共同的不可忽视的缺点：在造成脊髓缺血再灌注损伤的同时，也导致了腹腔、盆腔、下肢肌肉、神经等组织器官的缺血再灌注损伤,由此影响了行为功能学评估，进而影响脊髓损伤(SCI)机制及防治的研究[3]。同样的情况在大鼠脊髓缺血损伤模型中也有发生[3，9]。笔者首次利用日本大耳白家兔通过选择性阻断腰动脉制作了单一的局部脊髓缺血再灌注损伤模型，因其不直接阻断腹主动脉，从而也不会造成腹主动脉所支配的其他器官组织的直接缺血再灌注损伤，因而更利于进行继发性脊髓损伤的深入研究。此外还有以下特点：来自腰尾部和骶部节段血管的循环代偿可对腰骶髓提供保护作用；缺血损伤程度较主动脉阻断所致的缺血损伤轻；可通过不同数目的腰动脉阻断或同一腰动脉不同的阻断时间来控制缺血损伤程度，且重复性好，能复制出不同类型截瘫的典型临床表现。主要不足是要求动物种属纯，此外造模操作手术较复杂。
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从Jacobs评级结果中可以看出：对照组动物行为功能在再灌注1 d时完全正常,至再灌注14 d也未见明显的行为功能障碍。缺血30 min时，动物出现一过性软瘫，至再灌注1 d时，多数动物行为功能基本恢复，少数表现轻度的共济失调。缺血60 min和90 min时，动物表现明显的截瘫，再灌注1 d内表现为软瘫，之后大多数动物表现为硬瘫，且可分为伸肌瘫痪、屈肌瘫痪和混合性瘫痪3种类型，部分动物出现明显的大小便失禁。再灌注14 d内,60 min组少数动物逐渐恢复，瘫痪症状减轻, 其截瘫率降至7/8，但90 min组家兔功能改善慢，截瘫率仍为8/8。由此可见，选择性阻断腰动脉30,60,90 min可致轻、中、重不同程度的后肢运动功能障碍。Reuter评分能对动物的感觉、运动、反射、肌张力、后肢运动等功能进行综合评估, 分值越高功能受损越明显。结果发现，除对照组动物再灌注24，48，72 h外,其他各组家兔所有Reuter分值均明显高于伤前正常分值，这说明对照组家兔在再灌注1 d后其功能基本得到恢复，而3个损伤组均存在明显的不同程度的功能障碍。在缺血期间，评分最高均为11分，此时家兔均表现为软瘫，可能系急性缺血、脊髓休克和麻药作用所致。损伤组家兔再灌注期间的Reuter分值自大至小依次为缺血90 min组>缺血60 min组>缺血30 min组>对照组。提示随缺血时间的延长，再灌注时家兔感觉、运动功能障碍也越明显。综合Jacobs分级和Reuter评分结果，结合本模型有关脊髓血流量、病理学和感觉运动传导功能类似变化规律的研究结果[4，5]，不难推断：本造模方法可通过腰动脉阻断时间的不同而模拟出轻、中、重不同程度脊髓缺血再灌注损伤。因而，本模型是一种较理想的脊髓缺血损伤模型。
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基金项目：全军“九五”指令性课题基金资助项目(96L035)
参考文献：
[1]Tator CH，Fehlings MG. Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms. J Neurosurg，1991，75：15-26.
[2]Crawford ES，Crawford JL，Safi HJ，et al. Thoracoabdominal aortic aneurysm: preoperative and intraoperative factors determining immediate and long-term results of operation in 605 patients. J Vasc Surg， 1986，3：389-404.
, 百拇医药
[3]伍亚民，王正国，朱佩芳，等. 脊髓缺血损伤模型的研究概况. 中华创伤杂志， 1999，15 增刊：106-108.
[4]伍亚民，王正国，朱佩芳，等. 家兔脊髓缺血再灌注皮层体感诱发电位的变化及意义. 第三军医大学学报，1999，21：5-8.
[5]伍亚民，王正国，朱佩芳，等.脊髓缺血再灌注对其血流量变化及其病理改变关系的研究. 第三军医大学学报，1999，21：475-478.
[6]伍亚民，王正国，朱佩芳，等.缺血再灌注损伤致脊髓传导功能的变化及2-氨基膦酸基戊酸的影响. 解放军医学杂志，1999，24：336-338.
[7]Jacobs TP，Schohami E，Baze W，et al. Deteriorating stroke model: histopathology，edema and eicosanoid changes following spinal cord ischemia in rabbit. Stroke，1987，18：741-751.
, 百拇医药
[8]Reuter DG，Tacker WA，Badylak SF，et al. Correlation of motor-evoked potential response to ischemia spinal cord damage. J Thorac Cardiovas Surg， 1992，104：262-272.
[9]Marsala M，Yaksh TL.Transient spinal ischema in the rat： characterization of behavioral and histopathological consequences as a function of the duration of aortic occlusion. J Cereb Blood Flow Metab， 1994，14：526-535.
收稿日期：1999-11-15, 百拇医药