mtPLA2在严重烧伤早期心肌线粒体损害中的作用
作者：梁晚益 杨宗城 黄跃生
单位：梁晚益(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；杨宗城(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；黄跃生(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)
关键词：烧伤；线粒体；磷脂酶A2；Ca2+；大鼠
第三军医大学学报000303
提 要 目的：探讨线粒体PLA2(Mitochondrial PLA2，mtPLA2) 在严重烧伤早期心肌线粒体损害中的作用。方法：取正常及伤后1、3、6、12、24 h大鼠心肌分离线粒体，测其呼吸功能及Ca2+浓度([Ca2+]m)、mtPLA2活性。结果：1心肌线粒体呼吸控制率(RCR) 伤后1 h升高，3、6、12、24 h明显低于正常组，Ⅲ态呼吸速率(ST3)变化与RCR平行，ST4仅于伤后3 h有明显升高；2伤后各时相点[Ca2+]m均明显升高，而mtPLA2活性于伤后3、6、12、24 h显著高于正常组；3伤后3、6 h RCR与mtPLA2活性呈明显负相关(r=-0.6835,P< 0.01; r=-0.5419,P< 0.01)。结论：伤后[Ca2+]m升高可激活mtPLA2，后者在严重烧伤早期心肌线粒体损害中起重要作用。
, 百拇医药
中图法分类号 R329.24;R644 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0210-03
Role of mitochondrial PLA2 in myocardial mitochondria damage in the early stage of severe burns in rats
LIANG Wanyi, YANG Zhongcheng, HUANG Yuesheng
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, 百拇医药
Abstract Objective: To study the role of mitochondrial PLA2(mtPLA2) in the damages of myocardial mitochondria in the early stage of severe burns. Methods: Myocardial mitochondria were isolated from the rats of the normal control and burned groups in the 1st, 3rd, 6th, 12th and 24th hour after burn injury. The mitochondrial respiratory function, content of mitochondrial calcium (mtCa2+) and activity of mtPLA2 were determined. Results: 1Respiatory control rate (RCR) of myocardial mitochondria was increased in the 1st hour and then significantly decreased in the 3rd, 6th, 12th and 24th hour postburn. The changes of ST3 which was similar to those of PCR and SR4 was significantly increased only in the 3rd hour postburn. 2mtCa2+ was increased at all the time points postburn and the activity of mtPLA2 was increased only in the 3rd, 6th, 12th and 24th hour postburn. 3PCR was negatively correlated with mtPLA2 activity in the 3rd, 6th, 12th and 24th hour postburn (r=-0.6835,P< 0.01, r=-0.5419,P< 0.01). Conclusion: After the injury of severe burns, the elevation of the content of mitochondrial calcium can significantly activate mitochondrial PLA2 which plays an important role in the damages of myocardial mitochondria in the early stage after burn injury.
, 百拇医药
Key words burns; mitochondrion; PLA2; calciumion; rat
严重烧伤早期心肌线粒体结构与功能受损，导致细胞能量代谢障碍，后者在心功能损害中起重要作用[1]。目前认为钙分布异常是线粒体损伤的主要原因之一，但钙分布异常损伤线粒体的具体途径和机制尚不清楚。线粒体是富含磷脂的细胞器，同时含有自身的磷脂酶A2—线粒体PLA2， 它具有Ca2+依赖性激活的特点，可能在烧伤后线粒体损害中起一定作用。
1 材料与方法
1.1 动物致伤模型及分组
健康成年Wistar大鼠48只(本校动物中心提供)，体重(220±20)g，领回后喂养4～5 d以适应环境，分为正常对照组(n=8)和烧伤组(n=40)。动物麻醉脱毛后，烧伤组置脱毛区于92℃水浴18 s，造成30%TBSAⅢ度烫(烧)伤(病理切片证实)，分别于烧伤后30 min、9 h经腹腔注射乳酸林格氏液，每次1%烧伤面积按每公斤体重2 ml注射。正常对照组不烧伤、不补液，动物脱毛后1 h活杀取心脏，烧伤组动物分别于伤后1、3、6、12、24 h活杀取心。
, 百拇医药
1.2 线粒体分离
参照Zydowo等[2]的方法。分离介质：0.25 mol/L蔗糖,10 mmol/L Tris-HCl, pH7.4(去离子水配制)，4°C条件下分离心肌线粒体，1 h内完成。
1.3 线粒体呼吸功能测定
参照Poderoso等[3]的方法，以苹果酸钠和谷氨酸钠为底物，用B0M3耗氧测量仪测定心肌线粒体呼吸功能并计算RCR和ST3、ST4氧耗速率。
1.4 线粒体Ca2+测定
按Elizabeth等[4]的方法略作改进。线粒体悬浮于1%HCl中，150 W×10 s超声3次后，30 000×g离心60 min，取上清，邻甲酚酞络合酮显色，575 mm波长比色。
, 百拇医药
1.5 mtPLA2活性测定
先用1 mol/L KCl悬浮线粒体，然后冻融3次，150 W×15 s超声破碎，再于4°C孵育1 h，并不时振摇，最后30 000×g离心60 min，取上清，用合成底物2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱测定mtPLA2活性[5]。
1.6 统计学处理
所有数据经华西医科大学PEMS统计软件处理，作方差分析及t检验，部分指标作相关分析。
2 结果
2.1 烧伤后线粒体呼吸功能的变化
烧伤后1 h心肌线粒体RCR、ST3明显升高，3、6、12、24 h显著低于正常对照组；ST4除烧伤后3 h明显升高外，其余各时相点与正常组比无明显变化，见表1。
, 百拇医药
表1 烧伤后心肌线粒体呼吸功能变化(n=8)
Tab1 Changes of myocardial mitochondrial respiratory function after burn(n=8)
Control
Postburn(h)
1
3
6
12
24
RCR
3.12±0.27
, 百拇医药
3.58±0.43*
2.35±0.28*
2.04±0.35*
2.62±0.31＃
2.71±0.25＃
ST3
132.9±27.6
166.7±35.7*
80.0±11.8*
67.3±15.7*
, 百拇医药
93.9±23.2*
105.1±24.4＃
st4
30.6±8.9
32.4±5.1
44.7±7.9*
34.5±5.3
31.0±5.5
33.5±6.5
＃：P<0.05；*：P<0.01 vs control；ST3，ST4 is expressed as nanoatom 0.min-1.mg-1
, 百拇医药
2.2 烧伤后[Ca2+]m与mtPLA2变化
烧伤后各时相点[Ca2+]m显著高于对照组，而mtPLA2活性于伤后3、6、12、24 h明显升高，尤以3、6 h为甚，见表2。
表2 烧伤后线粒体Ca2+与PLA2变化(n=8)
Tab2 Changes of [Ca2+]m and mtPLA2 activity after burn(n=8)
Control
Postburn(h)
, http://www.100md.com
1
3
6
12
24
[Ca2+]m(nmol/mg)
10.4±1.62
13.1±2.6＃
24.1±3.1*
21.9±2.0*
13.7±1.8＃
, 百拇医药
13.4±2.0＃
mtPLA2(U/g)
17.2±4.1
18.5±4.5
70.7±9.0*
77.4±7.3*
30.9±5.0*
25.4±5.9＃
＃：P<0.05；*：P<0.01 vs vontrol
2.3 线粒体RCR与mtPLA2相关分析
, 百拇医药
伤后3、6 h线粒体RCR与mtPLA2活性呈明显负相关，相关系数分别为r=-0.6835，P< 0.01；r=-0.5419，P< 0.01。
3 讨论
我们所曾经报道烧伤后线粒体功能损害与 MODS相关[1]。本实验进一步探讨烧伤后心肌线粒体功能损害的发生机制，结果表明大鼠烧伤后心肌线粒体RCR于伤后1h升高，伤后3、6、12、24 h显著降低，ST3变化与RCR基本平行，而ST4仅于伤后3 h有明显升高，说明烧伤可致心肌线粒体损害，证实了我们以前的研究结果，且进一步提示ST3变化是RCR降低的主要原因。伤后1h RCR、ST3升高，表明此时线粒体可能尚未受到明显损害，反而由于烧伤后强烈的应激反应和某些激素水平升高，刺激线粒体呼吸加强。
烧伤早期的细胞损害主要由缺血缺氧引起，后者导致细胞Ca2+一定程度的升高。胞浆升高的Ca2+通过完善的Ca2+转运体系进入线粒体，首先导致线粒体Ca2+升高或超载[6]。本实验结果表明烧伤后各时相点[Ca2+]m显著升高，伤后3、6、12、24 h mtPLA2活性明显高于对照组；同时，烧伤后3、6 h RCR与mtPLA2活性呈明显负相关(r=-0.6835，P< 0.01，r=-0.5419，P< 0.01)。提示[Ca2+]m 升高可激活mtPLA2，后者降解线粒体膜磷脂，使某些呼吸酶及F0F1-ATPase活性下降，RCR降低[7]。可见，线粒体Ca2+对mtPLA2的激活，以及mtPLA2对线粒体膜磷脂的降解，在严重烧伤后心肌线粒体损害中起重要作用[8]。烧伤后1 h Ca2+有明显升高，而PLA2活性变化不显著，这可能是烧伤应激使儿茶酚胺升高，线粒体摄取Ca2+上调细胞代谢的表现，但这一程度的Ca2+升高可能不足以激活mtPLA2。
, 百拇医药
线粒体作为重要的细胞器之一，在细胞能量代谢和钙稳态维持中起重要作用[9]。有研究表明线粒体Ca2+紊乱是缺血缺氧性细胞死亡的根本原因，防治线粒体Ca2+超载，阻断其对mtPLA2的激活，可能有助于这些病理条件下维持线粒体、细胞乃至器官的正常功能[10]。
作者简介：梁晚益(1967.10)，男，湖南省涟源市人，博士,主要从事烧、创伤脏器损害方面的研究， 发表论文5篇。
参考文献
[1] Huang Y S, Yang Z C, Liu X S, et al. Serial experiment and clinical studies on the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome in severe burn[J]. Burns,1998,24(8)：706-716.
, http://www.100md.com
[2] Zydowo M M, Swierczynskki J, Nagel G, et al.The respiration and calcium content of heart mitochondria from rats with vitamin D induced carionecrosis[J]. Biochem J,1985, 226(1)：155-161.
[3] Poderoso J J, Fernadez S, Carreras M C, et al. Liver oxygen uptake dependence and mitochondrial function in septic rats[J]. Circ Shock,1994,44(4)：175-182.
[4] Elizabeth A F, James D M, Takuro T, et al. Myocardial mitochondrial Calcium accumulation modulates nuclear calcium accumulation and DNA fragmentation[J]. Ann Thorac Surg,1995,60：338-344.
, 百拇医药
[5] 沈 红， 李玉书. 用合线底物测定磷脂酶A2 的方法研究[J].军事医学科学院院刊，1992，16(1)：71-74.
[6] Roberto F. The role of mitochondria in ischemic heart disease [J]. J Cardiovasc Pharmacol,1996,28(Suppl 1)：S1-S10.
[7] Nakahara I, Kikuchi H, Taki W, et al. Changes of major phospholipids of mitochondria during postischemic reperfusion in rat brain[J]. J Neurosurg,1992,76(2)：244-250.
[8] Elimadi A, Morin D, Sapena R,et al. Comparison of the effects of cyclosporine A and trimetazidine on Ca2+dependent mitochondrial swelling[J]. Fundam Clin Pharmacol,1997,11(5):440-447.
, 百拇医药
[9] Wallace K B, Eells J T, Madeira V M, et al. Mitochondria mediated cell injury[J]. Fundam Appl Toxicol，1997,38(1)：23-37.
[10] Halestrap A P, Kerr P M, Javadov S, et al. Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart[J]. BBA,1998,1 366(1～2)：69-78.
收稿日期：1999-08-05；修回日期：2000-01-19, http://www.100md.com
单位：梁晚益(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；杨宗城(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；黄跃生(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)
关键词：烧伤；线粒体；磷脂酶A2；Ca2+；大鼠
第三军医大学学报000303
提 要 目的：探讨线粒体PLA2(Mitochondrial PLA2，mtPLA2) 在严重烧伤早期心肌线粒体损害中的作用。方法：取正常及伤后1、3、6、12、24 h大鼠心肌分离线粒体，测其呼吸功能及Ca2+浓度([Ca2+]m)、mtPLA2活性。结果：1心肌线粒体呼吸控制率(RCR) 伤后1 h升高，3、6、12、24 h明显低于正常组，Ⅲ态呼吸速率(ST3)变化与RCR平行，ST4仅于伤后3 h有明显升高；2伤后各时相点[Ca2+]m均明显升高，而mtPLA2活性于伤后3、6、12、24 h显著高于正常组；3伤后3、6 h RCR与mtPLA2活性呈明显负相关(r=-0.6835,P< 0.01; r=-0.5419,P< 0.01)。结论：伤后[Ca2+]m升高可激活mtPLA2，后者在严重烧伤早期心肌线粒体损害中起重要作用。
, 百拇医药
中图法分类号 R329.24;R644 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0210-03
Role of mitochondrial PLA2 in myocardial mitochondria damage in the early stage of severe burns in rats
LIANG Wanyi, YANG Zhongcheng, HUANG Yuesheng
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, 百拇医药
Abstract Objective: To study the role of mitochondrial PLA2(mtPLA2) in the damages of myocardial mitochondria in the early stage of severe burns. Methods: Myocardial mitochondria were isolated from the rats of the normal control and burned groups in the 1st, 3rd, 6th, 12th and 24th hour after burn injury. The mitochondrial respiratory function, content of mitochondrial calcium (mtCa2+) and activity of mtPLA2 were determined. Results: 1Respiatory control rate (RCR) of myocardial mitochondria was increased in the 1st hour and then significantly decreased in the 3rd, 6th, 12th and 24th hour postburn. The changes of ST3 which was similar to those of PCR and SR4 was significantly increased only in the 3rd hour postburn. 2mtCa2+ was increased at all the time points postburn and the activity of mtPLA2 was increased only in the 3rd, 6th, 12th and 24th hour postburn. 3PCR was negatively correlated with mtPLA2 activity in the 3rd, 6th, 12th and 24th hour postburn (r=-0.6835,P< 0.01, r=-0.5419,P< 0.01). Conclusion: After the injury of severe burns, the elevation of the content of mitochondrial calcium can significantly activate mitochondrial PLA2 which plays an important role in the damages of myocardial mitochondria in the early stage after burn injury.
, 百拇医药
Key words burns; mitochondrion; PLA2; calciumion; rat
严重烧伤早期心肌线粒体结构与功能受损，导致细胞能量代谢障碍，后者在心功能损害中起重要作用[1]。目前认为钙分布异常是线粒体损伤的主要原因之一，但钙分布异常损伤线粒体的具体途径和机制尚不清楚。线粒体是富含磷脂的细胞器，同时含有自身的磷脂酶A2—线粒体PLA2， 它具有Ca2+依赖性激活的特点，可能在烧伤后线粒体损害中起一定作用。
1 材料与方法
1.1 动物致伤模型及分组
健康成年Wistar大鼠48只(本校动物中心提供)，体重(220±20)g，领回后喂养4～5 d以适应环境，分为正常对照组(n=8)和烧伤组(n=40)。动物麻醉脱毛后，烧伤组置脱毛区于92℃水浴18 s，造成30%TBSAⅢ度烫(烧)伤(病理切片证实)，分别于烧伤后30 min、9 h经腹腔注射乳酸林格氏液，每次1%烧伤面积按每公斤体重2 ml注射。正常对照组不烧伤、不补液，动物脱毛后1 h活杀取心脏，烧伤组动物分别于伤后1、3、6、12、24 h活杀取心。
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1.2 线粒体分离
参照Zydowo等[2]的方法。分离介质：0.25 mol/L蔗糖,10 mmol/L Tris-HCl, pH7.4(去离子水配制)，4°C条件下分离心肌线粒体，1 h内完成。
1.3 线粒体呼吸功能测定
参照Poderoso等[3]的方法，以苹果酸钠和谷氨酸钠为底物，用B0M3耗氧测量仪测定心肌线粒体呼吸功能并计算RCR和ST3、ST4氧耗速率。
1.4 线粒体Ca2+测定
按Elizabeth等[4]的方法略作改进。线粒体悬浮于1%HCl中，150 W×10 s超声3次后，30 000×g离心60 min，取上清，邻甲酚酞络合酮显色，575 mm波长比色。
, 百拇医药
1.5 mtPLA2活性测定
先用1 mol/L KCl悬浮线粒体，然后冻融3次，150 W×15 s超声破碎，再于4°C孵育1 h，并不时振摇，最后30 000×g离心60 min，取上清，用合成底物2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱测定mtPLA2活性[5]。
1.6 统计学处理
所有数据经华西医科大学PEMS统计软件处理，作方差分析及t检验，部分指标作相关分析。
2 结果
2.1 烧伤后线粒体呼吸功能的变化
烧伤后1 h心肌线粒体RCR、ST3明显升高，3、6、12、24 h显著低于正常对照组；ST4除烧伤后3 h明显升高外，其余各时相点与正常组比无明显变化，见表1。
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表1 烧伤后心肌线粒体呼吸功能变化(n=8)
Tab1 Changes of myocardial mitochondrial respiratory function after burn(n=8)
Control
Postburn(h)
1
3
6
12
24
RCR
3.12±0.27
, 百拇医药
3.58±0.43*
2.35±0.28*
2.04±0.35*
2.62±0.31＃
2.71±0.25＃
ST3
132.9±27.6
166.7±35.7*
80.0±11.8*
67.3±15.7*
, 百拇医药
93.9±23.2*
105.1±24.4＃
st4
30.6±8.9
32.4±5.1
44.7±7.9*
34.5±5.3
31.0±5.5
33.5±6.5
＃：P<0.05；*：P<0.01 vs control；ST3，ST4 is expressed as nanoatom 0.min-1.mg-1
, 百拇医药
2.2 烧伤后[Ca2+]m与mtPLA2变化
烧伤后各时相点[Ca2+]m显著高于对照组，而mtPLA2活性于伤后3、6、12、24 h明显升高，尤以3、6 h为甚，见表2。
表2 烧伤后线粒体Ca2+与PLA2变化(n=8)
Tab2 Changes of [Ca2+]m and mtPLA2 activity after burn(n=8)
Control
Postburn(h)
, http://www.100md.com
1
3
6
12
24
[Ca2+]m(nmol/mg)
10.4±1.62
13.1±2.6＃
24.1±3.1*
21.9±2.0*
13.7±1.8＃
, 百拇医药
13.4±2.0＃
mtPLA2(U/g)
17.2±4.1
18.5±4.5
70.7±9.0*
77.4±7.3*
30.9±5.0*
25.4±5.9＃
＃：P<0.05；*：P<0.01 vs vontrol
2.3 线粒体RCR与mtPLA2相关分析
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伤后3、6 h线粒体RCR与mtPLA2活性呈明显负相关，相关系数分别为r=-0.6835，P< 0.01；r=-0.5419，P< 0.01。
3 讨论
我们所曾经报道烧伤后线粒体功能损害与 MODS相关[1]。本实验进一步探讨烧伤后心肌线粒体功能损害的发生机制，结果表明大鼠烧伤后心肌线粒体RCR于伤后1h升高，伤后3、6、12、24 h显著降低，ST3变化与RCR基本平行，而ST4仅于伤后3 h有明显升高，说明烧伤可致心肌线粒体损害，证实了我们以前的研究结果，且进一步提示ST3变化是RCR降低的主要原因。伤后1h RCR、ST3升高，表明此时线粒体可能尚未受到明显损害，反而由于烧伤后强烈的应激反应和某些激素水平升高，刺激线粒体呼吸加强。
烧伤早期的细胞损害主要由缺血缺氧引起，后者导致细胞Ca2+一定程度的升高。胞浆升高的Ca2+通过完善的Ca2+转运体系进入线粒体，首先导致线粒体Ca2+升高或超载[6]。本实验结果表明烧伤后各时相点[Ca2+]m显著升高，伤后3、6、12、24 h mtPLA2活性明显高于对照组；同时，烧伤后3、6 h RCR与mtPLA2活性呈明显负相关(r=-0.6835，P< 0.01，r=-0.5419，P< 0.01)。提示[Ca2+]m 升高可激活mtPLA2，后者降解线粒体膜磷脂，使某些呼吸酶及F0F1-ATPase活性下降，RCR降低[7]。可见，线粒体Ca2+对mtPLA2的激活，以及mtPLA2对线粒体膜磷脂的降解，在严重烧伤后心肌线粒体损害中起重要作用[8]。烧伤后1 h Ca2+有明显升高，而PLA2活性变化不显著，这可能是烧伤应激使儿茶酚胺升高，线粒体摄取Ca2+上调细胞代谢的表现，但这一程度的Ca2+升高可能不足以激活mtPLA2。
, 百拇医药
线粒体作为重要的细胞器之一，在细胞能量代谢和钙稳态维持中起重要作用[9]。有研究表明线粒体Ca2+紊乱是缺血缺氧性细胞死亡的根本原因，防治线粒体Ca2+超载，阻断其对mtPLA2的激活，可能有助于这些病理条件下维持线粒体、细胞乃至器官的正常功能[10]。
作者简介：梁晚益(1967.10)，男，湖南省涟源市人，博士,主要从事烧、创伤脏器损害方面的研究， 发表论文5篇。
参考文献
[1] Huang Y S, Yang Z C, Liu X S, et al. Serial experiment and clinical studies on the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome in severe burn[J]. Burns,1998,24(8)：706-716.
, http://www.100md.com
[2] Zydowo M M, Swierczynskki J, Nagel G, et al.The respiration and calcium content of heart mitochondria from rats with vitamin D induced carionecrosis[J]. Biochem J,1985, 226(1)：155-161.
[3] Poderoso J J, Fernadez S, Carreras M C, et al. Liver oxygen uptake dependence and mitochondrial function in septic rats[J]. Circ Shock,1994,44(4)：175-182.
[4] Elizabeth A F, James D M, Takuro T, et al. Myocardial mitochondrial Calcium accumulation modulates nuclear calcium accumulation and DNA fragmentation[J]. Ann Thorac Surg,1995,60：338-344.
, 百拇医药
[5] 沈 红， 李玉书. 用合线底物测定磷脂酶A2 的方法研究[J].军事医学科学院院刊，1992，16(1)：71-74.
[6] Roberto F. The role of mitochondria in ischemic heart disease [J]. J Cardiovasc Pharmacol,1996,28(Suppl 1)：S1-S10.
[7] Nakahara I, Kikuchi H, Taki W, et al. Changes of major phospholipids of mitochondria during postischemic reperfusion in rat brain[J]. J Neurosurg,1992,76(2)：244-250.
[8] Elimadi A, Morin D, Sapena R,et al. Comparison of the effects of cyclosporine A and trimetazidine on Ca2+dependent mitochondrial swelling[J]. Fundam Clin Pharmacol,1997,11(5):440-447.
, 百拇医药
[9] Wallace K B, Eells J T, Madeira V M, et al. Mitochondria mediated cell injury[J]. Fundam Appl Toxicol，1997,38(1)：23-37.
[10] Halestrap A P, Kerr P M, Javadov S, et al. Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart[J]. BBA,1998,1 366(1～2)：69-78.
收稿日期：1999-08-05；修回日期：2000-01-19, http://www.100md.com