兔准分子激光角膜切削术后角膜血小板源性生长因子mRNA表达的变化
作者：钟一声 程枫 周颖明 廉井财 王康孙 邓伟
单位：钟一声 周颖明 廉井财 王康孙 邓伟(200025 上海第二医科大学瑞金医院眼科中心)；程枫(上海第二医科大学人类基因治疗研究中心)
关键词：准分子激光屈光性角膜切削术；角膜上皮细胞；角膜基质；血小板源性生长因子；上皮下混浊
眼科研究000305 摘要 目的 研究角膜上皮下混浊(haze)形成的发生机制，检测准分子激光屈光性角膜切削术(PRK)后角膜上皮和基质血小板源性生长因子(PDGF)表达的变化。方法 新西兰白兔施行PRK后1，2，3月用裂隙灯显微镜观察haze形成情况，并用原位核酸分子杂交方法，检测角膜上皮和基质PDGFmRNA的表达。结果 正常角膜上皮细胞有PDGF mRNA表达，基质层无表达；PRK后角膜上皮细胞PDGF mRNA表达增加，术后2月表达最强，且基质中亦有轻微表达。上皮细胞PDGF mRNA表达强弱与haze形成的轻重密切相关。结论 PDGF参与PRK后伤口愈合过程，且调节着haze的形成和发展。
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分类号 R772
Expression of platelet-derived growth factor mRNA in rabbit cornea after photorefractive keratectomy
Zhong Yisheng，Cheng Feng，Zhou Yingming
(Ophthalmic Center，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai 200025)
Abstract Objective To study the mechanism of haze formation and to investigate the expression of platelet-derived growth factor (PDGF) mRNA in corneal epithelium and stroma after photorefractive keratectomy (PRK).Methods Twenty white rabbits were randomly divided into 4 groups，and PRK was performed on each eye of 15 rabbits.Haze formation was determined by a slit-lamp examination at the 1st，2nd and 3rd month after PRK，and the expression of PDGF mRNA was detected by in situ hybridization.ResultsThe corneal haze was first seen one month after PRK.The most obvious haze formation was observed at two months，and haze decreased or disappeared by the 3rd month after PRK.PDGF mRNA expression was present in the normal corneal epithelium，but was not present in the normal corneal stroma.Expression of PDGF mRNA in the corneal epithelium increased after PRK，with the peak appearing in the 2nd month.PDGF expression was detected in corneal stroma in the 2nd month.The extent of the expression of PDGF mRNA was related to the amount of haze formation.Conclusion PDGF takes part in promoting corneal wound healing after PRK，and may contribute to the formation and development of corneal haze.
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Key words photorefractive keratectomy corneal epithelium corneal stroma platelet-derived growth factor haze
准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy，PRK)是治疗近视安全和有效的方法。然而，其术后发生的屈光回退和上皮下混浊(haze)影响着其预测性和稳定性。一般认为，它们与术后伤口愈合过程密切相关[1]。角膜伤口愈合是一复杂的生物学过程，细胞因子参与并调节其愈合。本文旨在研究PRK后角膜血小板源性生长因子(platelet-derived
growth factor，PDGF)mRNA的表达变化，探讨其与术后常见并发症的关系。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 动物模型建立
取新西兰白兔20只，体重2.5～3 kg，无眼疾病，雌雄兼用。随机分为正常对照组(5只)、PRK后1月组(5只)、2月组(5只)和3月组(5只)。用50 mg/kg戊巴比妥钠兔耳缘静脉麻醉后，以1%Alcaine滴眼表面麻醉，按常规方法将兔施行PRK，术后结膜囊涂金霉素眼膏。使用激光器为Chiron Vision 117-C型(USA)，输入-8.0 D切削程序，切削深度156 μm，光学消融直径5.6 mm。激光参数为能量120 mJ/cm2，频率50 Hz。
1.2 术后观察及处理
PRK后1周内，每日用手持裂隙灯观察眼前段情况，并点0.25%氯霉素滴眼液1次。于PRK后1月、2月和3月分别将兔全身麻醉，裂隙灯检查角膜haze形成情况，并按Rai等[2]haze分级标准进行分级并记录。无菌操作下摘除眼球，剪下完整角膜，沿角膜中心将角膜一分为二，迅速投入液氮中保存备用。同样方法获得对照组角膜并保存。
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1.3 PDGF mRNA检测
1.3.1 试剂：寡核苷酸探针PDGF[3]：5’-GACGTATTCCACCTTGGCCA-3’经DNA合成仪合成。DIG3’末端寡核苷酸标记试剂盒和显色系统(Boehringer Mannheim公司)；顺丁烯二酸(Sigma公司)；鲑鱼精DNA(Sigma公司)，所有试剂均用DEPC水配制。
1.3.2 探针标记：按标记试剂盒说明进行3’末端标记，标上DIG-11-ddUTP。
1.3.3 实验器材处理：参照文献方法进行[3]，载玻片使用前涂以多聚赖氨酸。
1.3.4 原位杂交：参照Boehringer公司试剂盒推荐的检测方法。角膜组织冰冻切片(厚约5 μm)，并将对照组、术后1，2和3月组角膜切片按顺序粘于同一载玻片上，以保证杂交和显色条件一致。每份标本切片3张，干燥后4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤；室温预杂交1 h；置湿盒中37℃，杂交16～18 h；杂交后依次用2×SSC 15 min，1×SSC 15 min，0.5×SSC 37℃ 15 min，0.5×SSC 15 min，以洗去多余未杂交探针；2%绵羊血清封闭30 min；加1∶1 000抗体室温2 h；加缓冲显色液1 ml(含NBT 4.5 μl，X-P 3.5 μl)，置37℃暗处反应4～5 h；HE复染，显微镜观察结果；阴性对照：杂交液中使用未标记探针。
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2 结果
2.1 PRK后角膜伤口愈合情况
PRK后5～7天角膜上皮层完全修复；术后1月，可见1～2级haze形成；2月时haze形成最明显，可达2～3级，未见到4级haze形成；术后3月，形成的haze明显减轻，仅见0.5～1级haze。
2.2 兔角膜PRK后PDGF mRNA的表达
正常和PRK后1，2，3月兔角膜行PDGF原位杂交，观察其mRNA表达，以上皮细胞浆和基质中有无蓝紫色杂交颗粒区分阳性和阴性表达，以颗粒着染浓密程度区分表达强弱。正常兔角膜上皮细胞有PDGF mRNA表达，而基质中无表达(图1)。PRK后1月，角膜上皮细胞PDGF mRNA表达较正常角膜上皮细胞表达增强，而基质中无PDGF mRNA表达；PRK后2月，上皮细胞层可见PDGF mRNA呈浓密表达，且基质中亦有轻微表达(图2)；PRK后3月，上皮细胞PDGF mRNA表达较前期减弱，但仍较正常上皮细胞表达增强，基质中未见明显PDGF表达。PRK后角膜上皮细胞PDGF mRNA的表达强弱与形成haze的轻重有密切关系，2月时haze形成最明显，角膜上皮细胞PDGF mRNA表达亦最明显。
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图1 正常角膜上皮细胞层有PDGF mRNA表达，基质中无表达(×400) 图2 PRK后2月，上皮细胞层PDGF mRNA呈浓密表达，且基质中亦有轻微表达(×400) Fig.1 PDGF mRNA expression was
exclusively present in the normal corneal epithelium(×400) Fig.2 PDGF mRNA was predominantly expressed by corneal
epithelium and slightly expressed by corneal stroma at the 2nd month after PRK(×400)
3 讨论
3.1 PDGF的特性及作用
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PDGF是一肽类生长因子，最先从血小板中分离得到而命名，尔后发现平滑肌细胞、血管内皮细胞、激活的巨噬细胞及肿瘤细胞等均能合成和分泌PDGF。它由A，B两链通过二硫键结合而成的同源二聚体或异源二聚体构成，相对分子质量约30 000[4]。A，B两链最初合成时是无活性的前体，再通过蛋白降解成含100多个氨基酸的成熟多肽链。在成熟的A，B链中大约有60%的氨基酸系列是相似的，并且每一链中均含有8个半胱氨酸残基。
PDGF是结缔组织细胞和胶质细胞的主要分裂源，它能促进机体伤口愈合和胚胎发育，同时也能导致机体内一些不良反应，如产生纤维化性病灶、动脉粥样硬化和促进肿瘤生长等。在伤口愈合过程中，PDGF能促进细胞外基质(extracellular matrix，ECM)产生和炎性细胞的趋化。在中枢神经系统发育过程中，PDGF能通过旁分泌或自分泌机制调节神经细胞的生长和分化[5]。
3.2 PRK后角膜表达PDGF mRNA的变化和意义
, 百拇医药
PRK后伤口愈合过程包括：上皮和基质细胞的移行，细胞的有丝分裂和分化及ECM的再生等。目前研究认为PRK后发生的haze是由激活的角膜基质细胞分泌过多的异常胶原纤维所造成的[1]。临床研究表明，haze形成高峰期在术后2个月左右，术后6个月左右可以减轻或消失[6]。本实验观察发现兔眼PRK后1月已有haze形成，2月时haze形成最明显，可达3级，3月左右形成的haze开始减轻或消退，这与临床观察结果基本一致。
正常角膜上皮-基质间存在着相互作用，Li等[7]研究发现角膜上皮细胞有PDGF mRNA表达，而角膜基质细胞有PDGF受体β mRNA表达，PDGF通过PDGF-PDGF受体β轴调节着角膜上皮-基质的相互作用。本实验结果发现正常兔角膜上皮细胞层有PDGF mRNA表达，而基质中无表达，这与Li等的研究结果基本一致。
PDGF参与PRK后伤口愈合过程，本实验发现PRK后角膜上皮细胞PDGF mRNA表达明显增强，术后2月，角膜上皮细胞PDGF mRNA表达最强，且基质中亦有轻微表达。haze形成明显时，角膜上皮细胞PDGF mRNA表达亦明显，表明PDGF参与调节haze的形成和发展。当然，haze形成是一个非常复杂的过程，许多细胞因子或因素共同调节着haze的形成和发展。有关其它细胞因子或因素对PRK后伤口愈合的调节有待进一步研究。
, 百拇医药
1，钟一声，李翠萍.激光角膜光学切除术后伤口愈后的研究.中国激光医学杂志，1998，7∶170
2，Rai NS，Geiss Ⅲ MJ，Fantes F，et al.Healing of excimer laser ablated monkey corneas：an immunohistochemical evaluation.Arch Ophthalmol，1990，108∶1604
3，章有章，赵涵芳，程枫，等.大鼠深Ⅱ度烫伤后4种生长因子mRNA的表达.上海第二医科大学学报，1997，17(Suppl)：30
4，Hummacher A，Hellman U，Johnsson A，et al.A major part of PDGF purified from human platelets is a heterodimer of one A chain and one B chain.J Biol Chem，1988，263∶16493
, 百拇医药
5，Heldin CH，Westermark B.Platelet-derived growth factor.Mol Cell Biol，1985，3∶169
6，Gastry DS，Kerr Muir MG，Lohman CP，et al.The effect of topical corticosteroid on refractive outcome and corneal haze after photorefractive keratectomy.Arch Ophthalmol，1992，110∶944
7，Li DQ，Tseng SCG.Three patterns of cytokine expression potentially involved in epithelial-fibroblast interactions of human ocular surface.J Cell Physiol，1995，163∶61
(收稿：1999-04-10 修回：1999-11-08), http://www.100md.com
单位：钟一声 周颖明 廉井财 王康孙 邓伟(200025 上海第二医科大学瑞金医院眼科中心)；程枫(上海第二医科大学人类基因治疗研究中心)
关键词：准分子激光屈光性角膜切削术；角膜上皮细胞；角膜基质；血小板源性生长因子；上皮下混浊
眼科研究000305 摘要 目的 研究角膜上皮下混浊(haze)形成的发生机制，检测准分子激光屈光性角膜切削术(PRK)后角膜上皮和基质血小板源性生长因子(PDGF)表达的变化。方法 新西兰白兔施行PRK后1，2，3月用裂隙灯显微镜观察haze形成情况，并用原位核酸分子杂交方法，检测角膜上皮和基质PDGFmRNA的表达。结果 正常角膜上皮细胞有PDGF mRNA表达，基质层无表达；PRK后角膜上皮细胞PDGF mRNA表达增加，术后2月表达最强，且基质中亦有轻微表达。上皮细胞PDGF mRNA表达强弱与haze形成的轻重密切相关。结论 PDGF参与PRK后伤口愈合过程，且调节着haze的形成和发展。
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分类号 R772
Expression of platelet-derived growth factor mRNA in rabbit cornea after photorefractive keratectomy
Zhong Yisheng，Cheng Feng，Zhou Yingming
(Ophthalmic Center，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai 200025)
Abstract Objective To study the mechanism of haze formation and to investigate the expression of platelet-derived growth factor (PDGF) mRNA in corneal epithelium and stroma after photorefractive keratectomy (PRK).Methods Twenty white rabbits were randomly divided into 4 groups，and PRK was performed on each eye of 15 rabbits.Haze formation was determined by a slit-lamp examination at the 1st，2nd and 3rd month after PRK，and the expression of PDGF mRNA was detected by in situ hybridization.ResultsThe corneal haze was first seen one month after PRK.The most obvious haze formation was observed at two months，and haze decreased or disappeared by the 3rd month after PRK.PDGF mRNA expression was present in the normal corneal epithelium，but was not present in the normal corneal stroma.Expression of PDGF mRNA in the corneal epithelium increased after PRK，with the peak appearing in the 2nd month.PDGF expression was detected in corneal stroma in the 2nd month.The extent of the expression of PDGF mRNA was related to the amount of haze formation.Conclusion PDGF takes part in promoting corneal wound healing after PRK，and may contribute to the formation and development of corneal haze.
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Key words photorefractive keratectomy corneal epithelium corneal stroma platelet-derived growth factor haze
准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy，PRK)是治疗近视安全和有效的方法。然而，其术后发生的屈光回退和上皮下混浊(haze)影响着其预测性和稳定性。一般认为，它们与术后伤口愈合过程密切相关[1]。角膜伤口愈合是一复杂的生物学过程，细胞因子参与并调节其愈合。本文旨在研究PRK后角膜血小板源性生长因子(platelet-derived
growth factor，PDGF)mRNA的表达变化，探讨其与术后常见并发症的关系。
1 材料与方法
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取新西兰白兔20只，体重2.5～3 kg，无眼疾病，雌雄兼用。随机分为正常对照组(5只)、PRK后1月组(5只)、2月组(5只)和3月组(5只)。用50 mg/kg戊巴比妥钠兔耳缘静脉麻醉后，以1%Alcaine滴眼表面麻醉，按常规方法将兔施行PRK，术后结膜囊涂金霉素眼膏。使用激光器为Chiron Vision 117-C型(USA)，输入-8.0 D切削程序，切削深度156 μm，光学消融直径5.6 mm。激光参数为能量120 mJ/cm2，频率50 Hz。
1.2 术后观察及处理
PRK后1周内，每日用手持裂隙灯观察眼前段情况，并点0.25%氯霉素滴眼液1次。于PRK后1月、2月和3月分别将兔全身麻醉，裂隙灯检查角膜haze形成情况，并按Rai等[2]haze分级标准进行分级并记录。无菌操作下摘除眼球，剪下完整角膜，沿角膜中心将角膜一分为二，迅速投入液氮中保存备用。同样方法获得对照组角膜并保存。
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1.3 PDGF mRNA检测
1.3.1 试剂：寡核苷酸探针PDGF[3]：5’-GACGTATTCCACCTTGGCCA-3’经DNA合成仪合成。DIG3’末端寡核苷酸标记试剂盒和显色系统(Boehringer Mannheim公司)；顺丁烯二酸(Sigma公司)；鲑鱼精DNA(Sigma公司)，所有试剂均用DEPC水配制。
1.3.2 探针标记：按标记试剂盒说明进行3’末端标记，标上DIG-11-ddUTP。
1.3.3 实验器材处理：参照文献方法进行[3]，载玻片使用前涂以多聚赖氨酸。
1.3.4 原位杂交：参照Boehringer公司试剂盒推荐的检测方法。角膜组织冰冻切片(厚约5 μm)，并将对照组、术后1，2和3月组角膜切片按顺序粘于同一载玻片上，以保证杂交和显色条件一致。每份标本切片3张，干燥后4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤；室温预杂交1 h；置湿盒中37℃，杂交16～18 h；杂交后依次用2×SSC 15 min，1×SSC 15 min，0.5×SSC 37℃ 15 min，0.5×SSC 15 min，以洗去多余未杂交探针；2%绵羊血清封闭30 min；加1∶1 000抗体室温2 h；加缓冲显色液1 ml(含NBT 4.5 μl，X-P 3.5 μl)，置37℃暗处反应4～5 h；HE复染，显微镜观察结果；阴性对照：杂交液中使用未标记探针。
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2 结果
2.1 PRK后角膜伤口愈合情况
PRK后5～7天角膜上皮层完全修复；术后1月，可见1～2级haze形成；2月时haze形成最明显，可达2～3级，未见到4级haze形成；术后3月，形成的haze明显减轻，仅见0.5～1级haze。
2.2 兔角膜PRK后PDGF mRNA的表达
正常和PRK后1，2，3月兔角膜行PDGF原位杂交，观察其mRNA表达，以上皮细胞浆和基质中有无蓝紫色杂交颗粒区分阳性和阴性表达，以颗粒着染浓密程度区分表达强弱。正常兔角膜上皮细胞有PDGF mRNA表达，而基质中无表达(图1)。PRK后1月，角膜上皮细胞PDGF mRNA表达较正常角膜上皮细胞表达增强，而基质中无PDGF mRNA表达；PRK后2月，上皮细胞层可见PDGF mRNA呈浓密表达，且基质中亦有轻微表达(图2)；PRK后3月，上皮细胞PDGF mRNA表达较前期减弱，但仍较正常上皮细胞表达增强，基质中未见明显PDGF表达。PRK后角膜上皮细胞PDGF mRNA的表达强弱与形成haze的轻重有密切关系，2月时haze形成最明显，角膜上皮细胞PDGF mRNA表达亦最明显。
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图1 正常角膜上皮细胞层有PDGF mRNA表达，基质中无表达(×400) 图2 PRK后2月，上皮细胞层PDGF mRNA呈浓密表达，且基质中亦有轻微表达(×400) Fig.1 PDGF mRNA expression was
exclusively present in the normal corneal epithelium(×400) Fig.2 PDGF mRNA was predominantly expressed by corneal
epithelium and slightly expressed by corneal stroma at the 2nd month after PRK(×400)
3 讨论
3.1 PDGF的特性及作用
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PDGF是一肽类生长因子，最先从血小板中分离得到而命名，尔后发现平滑肌细胞、血管内皮细胞、激活的巨噬细胞及肿瘤细胞等均能合成和分泌PDGF。它由A，B两链通过二硫键结合而成的同源二聚体或异源二聚体构成，相对分子质量约30 000[4]。A，B两链最初合成时是无活性的前体，再通过蛋白降解成含100多个氨基酸的成熟多肽链。在成熟的A，B链中大约有60%的氨基酸系列是相似的，并且每一链中均含有8个半胱氨酸残基。
PDGF是结缔组织细胞和胶质细胞的主要分裂源，它能促进机体伤口愈合和胚胎发育，同时也能导致机体内一些不良反应，如产生纤维化性病灶、动脉粥样硬化和促进肿瘤生长等。在伤口愈合过程中，PDGF能促进细胞外基质(extracellular matrix，ECM)产生和炎性细胞的趋化。在中枢神经系统发育过程中，PDGF能通过旁分泌或自分泌机制调节神经细胞的生长和分化[5]。
3.2 PRK后角膜表达PDGF mRNA的变化和意义
, 百拇医药
PRK后伤口愈合过程包括：上皮和基质细胞的移行，细胞的有丝分裂和分化及ECM的再生等。目前研究认为PRK后发生的haze是由激活的角膜基质细胞分泌过多的异常胶原纤维所造成的[1]。临床研究表明，haze形成高峰期在术后2个月左右，术后6个月左右可以减轻或消失[6]。本实验观察发现兔眼PRK后1月已有haze形成，2月时haze形成最明显，可达3级，3月左右形成的haze开始减轻或消退，这与临床观察结果基本一致。
正常角膜上皮-基质间存在着相互作用，Li等[7]研究发现角膜上皮细胞有PDGF mRNA表达，而角膜基质细胞有PDGF受体β mRNA表达，PDGF通过PDGF-PDGF受体β轴调节着角膜上皮-基质的相互作用。本实验结果发现正常兔角膜上皮细胞层有PDGF mRNA表达，而基质中无表达，这与Li等的研究结果基本一致。
PDGF参与PRK后伤口愈合过程，本实验发现PRK后角膜上皮细胞PDGF mRNA表达明显增强，术后2月，角膜上皮细胞PDGF mRNA表达最强，且基质中亦有轻微表达。haze形成明显时，角膜上皮细胞PDGF mRNA表达亦明显，表明PDGF参与调节haze的形成和发展。当然，haze形成是一个非常复杂的过程，许多细胞因子或因素共同调节着haze的形成和发展。有关其它细胞因子或因素对PRK后伤口愈合的调节有待进一步研究。
, 百拇医药
1，钟一声，李翠萍.激光角膜光学切除术后伤口愈后的研究.中国激光医学杂志，1998，7∶170
2，Rai NS，Geiss Ⅲ MJ，Fantes F，et al.Healing of excimer laser ablated monkey corneas：an immunohistochemical evaluation.Arch Ophthalmol，1990，108∶1604
3，章有章，赵涵芳，程枫，等.大鼠深Ⅱ度烫伤后4种生长因子mRNA的表达.上海第二医科大学学报，1997，17(Suppl)：30
4，Hummacher A，Hellman U，Johnsson A，et al.A major part of PDGF purified from human platelets is a heterodimer of one A chain and one B chain.J Biol Chem，1988，263∶16493
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5，Heldin CH，Westermark B.Platelet-derived growth factor.Mol Cell Biol，1985，3∶169
6，Gastry DS，Kerr Muir MG，Lohman CP，et al.The effect of topical corticosteroid on refractive outcome and corneal haze after photorefractive keratectomy.Arch Ophthalmol，1992，110∶944
7，Li DQ，Tseng SCG.Three patterns of cytokine expression potentially involved in epithelial-fibroblast interactions of human ocular surface.J Cell Physiol，1995，163∶61
(收稿：1999-04-10 修回：1999-11-08), http://www.100md.com